余 輝 陳小娥 曾茂茂 何志勇 張 爽 方旭波 陳 潔*

（1 江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室 江蘇無錫214122 2 浙江海洋大學(xué)食品與醫(yī)藥學(xué)院 浙江舟山316022）

近年來，隨著海洋資源的衰退與快餐業(yè)的高速發(fā)展，新的蛋白質(zhì)資源開發(fā)迫在眉睫，低值細(xì)點圓趾蟹（Ovalipes punctatus）開發(fā)利用逐漸進(jìn)入水產(chǎn)加工者的視野。細(xì)點圓趾蟹經(jīng)蒸煮，人工挑取蟹螯和頭胸部的大塊蟹肉，再加工成冷凍蟹肉罐頭和蟹肉糜[1]。由于細(xì)點圓趾蟹具有個頭小、肌肉組織松散等特點，所以加工過程中產(chǎn)生許多含肉下腳料，包括蟹螯、頭胸部和腹部殘留蟹肉以及難以加工的附肢和小蟹等。這些下腳料中殘留的蟹肉若不回收利用，不僅嚴(yán)重浪費蛋白質(zhì)資源，而且也會污染環(huán)境。如何回收利用這些殘留的蟹肉，是當(dāng)前加工企業(yè)急需解決的問題。

目前，從蟹下腳料中回收殘留的蟹肉有2種方法：一種是機(jī)械擠壓與離心分離的方法[2]，該方法獲得的蟹肉具有顏色灰暗、有碎蟹殼等缺點，使其市場化應(yīng)用受到一定的限制；另一種是提取/水解蛋白回收方法，該方法是當(dāng)前研究的熱點，如絲氨酸膠原蛋白酶的提取[3]，蛋白水解回收[4-6]，抗菌肽[7-9]，抗腫瘤肽[10]以及抗氧化肽的酶法制備[11]。然而，有關(guān)細(xì)點圓趾蟹下腳料的利用研究很少，僅有李晶等[12]采用酶法制備海鮮調(diào)味基料的報道。盡管胡小超等[13]利用細(xì)點圓趾蟹肉制備金屬鋅螯合肽，以鋅的螯合率為指標(biāo)，通過正交試驗優(yōu)化獲得最適酶解工藝，但其目的是采用蟹肉制備新型生物態(tài)鋅，而非對下腳料進(jìn)行綜合利用，更未對細(xì)點圓趾蟹金屬鋅螯合肽進(jìn)行分離純化與結(jié)構(gòu)鑒定。

多肽結(jié)構(gòu)與其活性有著密切關(guān)系，明確多肽的氨基酸組成對揭示其構(gòu)效關(guān)系有著重要的意義[14-15]。本研究擬采用胰蛋白酶水解細(xì)點圓趾蟹含肉下腳料制備抗氧化肽，通過超濾、離子交換和凝膠層析初步分離純化，并利用半制備型RP-HPLC進(jìn)一步純化，采用超高效液相色譜-電噴霧飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-ESI-TOF-MS/MS）鑒定其結(jié)構(gòu)，最后通過合成多肽進(jìn)一步驗證其抗氧化性，旨在為細(xì)點圓趾蟹含肉下腳料的抗氧化肽開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

細(xì)點圓趾蟹含肉下腳料（OPW），舟山市常青海洋食品公司提供。

胰蛋白酶（2 500 U/mg），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；Sephadex G-15 填料，美國GE 公司；HPLC 級乙腈，美國天地公司；L-還原型谷胱甘肽（GSH）和2，2-連氮-雙-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）銨鹽[2，2′-Azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid）diammonium salt, ABTS]，美國sigma 公司；其它試劑均為分析純級，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

板式超濾設(shè)備，美國Minipore 公司；MA99-3自動核酸蛋白分離層析儀，上海滬西分析儀器廠有限公司；Evolution60 紫外可見分光光度計，美國熱電公司；Waters 1525 型半制備液相色譜儀、Waters Synapt 超高壓液相色譜串聯(lián)四級桿飛行時間質(zhì)譜儀，美國Waters 公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 OPW 酶解物（OPWTPs）的制備 蟹下腳料剔除蟹背甲、斬拌，用甲醇：氯仿體積比1∶2 進(jìn)行脫脂（料液比為0.333 kg OPW/L 混合溶劑），抽濾，濾渣70 ℃干燥5 h。濾渣粉碎后，按料液比為0.2 kg OPW 干基/L 純水、加酶量為4 000 U/g OPW 干基、溫度50 ℃、pH 7.5 的條件水解3 h。待反應(yīng)結(jié)束后，12 000×g 離心20 min，上清液真空濃縮至原體積的1/3，凍干后即為OPWTPs。

1.3.2 抗氧化肽的分離與鑒定

1.3.2.1 超濾 OPWTPs 溶于超純水中制成粗肽溶液（500 mg/mL），12 000×g 離心5 min，上清液依次通過3種超濾膜（截留相對分子質(zhì)量5，3，1 ku）進(jìn)行分離，分別獲得相對分子質(zhì)量>5 ku、3～5 ku、1～3 ku、<1 ku 的4 個肽段，其中<1 ku 的肽段經(jīng)Hitrap Desalting 預(yù)裝柱脫鹽。真空濃縮后冷凍干燥，測其各肽段的ABTS+·清除率。

1.3.2.2 凝膠過濾層析 上述抗氧化活性最高的肽段溶于超純水中制成多肽溶液（100 mg/mL），12 000 ×g 離心5 min，上清液采用已平衡的Sephadex G-15 凝膠柱（?1.6 cm×120 cm）進(jìn)行分離純化。柱層析條件：上樣量20 mL、流速1 mL/min、洗脫液為超純水，分步收集，2 mL/管，每隔1 管在波長220 nm 下測其吸光值，收集洗脫峰。多次重復(fù)上樣，合并收集各洗脫峰，真空濃縮凍干后測其各洗脫峰的ABTS+·清除率并計算IC50值。

1.3.2.3 RP-HPLC 制備色譜 上述抗氧化活性最高的肽段溶于超純水中制成多肽溶液（10 mg/mL），12 000×g 離心5 min，上清液用RPHPLC 制備色譜進(jìn)行分離純化。色譜條件：SunfireTMPre C18制備柱（?19 mm×250 mm，5 μm），檢測波長214 nm，柱溫25 ℃，流動相為乙腈和水，流速6 mL/min，上樣量0.5 mL；梯度洗脫模式，30 min 內(nèi)乙腈體積分?jǐn)?shù)從0%升至50%。多次重復(fù)分離，合并收集各洗脫峰，真空濃縮凍干后測其各洗脫峰ABTS+·清除率。

1.3.2.4 UPLC-ESI-TOF-MS/MS 結(jié)構(gòu)鑒定 上述抗氧化活性最高的洗脫峰溶于超純水中制成多肽溶液（1 mg/mL），12 000 ×g 離心5 min，上清液中多肽采用UPLC-TOF-MS/MS 進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。液相色譜條件：Acquity UPLC BEH C18 色譜柱（?2.1 mm×120 mm，1.7 μm），流動相為0.1%甲酸溶液和乙腈，流速為0.3 mL/min，梯度洗脫，20 min 內(nèi)乙腈含量由0 變到20%。質(zhì)譜條件：ESI 電離源，毛細(xì)管電壓為3.5 kV，錐孔電壓為30 V，離子源溫度為100 ℃。多肽結(jié)構(gòu)通過MassLynx 軟件中Protein/Peptide sequence 程序進(jìn)行分析。

1.3.2.5 多肽合成及活性測定 以獲得的抗氧化肽為目標(biāo)肽，委托吉爾生化（上海）有限公司采用固相合成方法進(jìn)行合成，并對脫鹽合成肽的純度與一級結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。同時測定合成肽和GSH 溶液的ABTS+·清除率。

1.3.2.6 多肽含量及ABTS+·清除率的測定 多肽含量測定按照余冰賓[16]的Folin-酚試劑法方法測定。ABTS+·清除率按照Zhu等[17]的方法測定，ABTS+·清除率（%）=（Ab-As）/Ab×100，式中Ab為空白樣吸光值，As為樣品吸光值。IC50值為ABTS+·清除率達(dá)50%的多肽溶液質(zhì)量濃度，單位為mg/mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 超濾分離

目前，大部分抗氧化肽的分子質(zhì)量在500～1 800 u 范圍內(nèi)[18]，因此本文采用1，3，5 ku 的超濾膜對OPWTPs 進(jìn)行分離，獲得了4 個組分（圖1），分別為OPWTPs-Ⅰ（分子質(zhì)量>5 ku），OPWTPs-Ⅱ（3～5 ku），OPWTPs-Ⅲ（1～3 ku）和OPWTPs-Ⅳ（<1 ku）的肽段，且OPWTPs，OPWTPs-Ⅰ，OPWTPs-Ⅱ，OPWTPs-Ⅲ和OPWTPs-Ⅳ的清除ABTS+·的IC50值分別為2.47，10.21，36.16，3.36 和1.43 mg/mL。其中，OPWTPs-Ⅳ肽段清除ABTS+·能力比其它3 個肽段強(qiáng)，表明OPWTPs-Ⅳ肽段中含有更多ABTS+·清除能力強(qiáng)的抗氧化肽，與鰹魚籽和褐牙鲆肌肉酶解液中低分子質(zhì)量的肽段具有最高抗氧化活性的結(jié)論相似[19-20]。因此，推斷OPWTPs-Ⅳ肽段含有高ABTS+·清除率的小分子質(zhì)量的多肽。

圖1 超濾組分ABTS+·清除率Fig.1 ABTS+·scavenging rates of ultrafiltration fractions

圖2 OPWTPs-Ⅳ組分的Sephadex G-15 凝膠柱層析曲線（a）及各分離峰的ABTS+·清除率（b）Fig.2 Column chromatogram of fraction OPWTPs-Ⅳon Sephadex G-15（a）and ABTS+·scavenging rates of separate peaks（b）

2.2 Sephadex G-15 分離

凝膠排阻色譜是一種根據(jù)分子大小分離生物活性物質(zhì)的有效方法[21-22]。從圖2可看出，OPWTPs-Ⅳ經(jīng)Sephadex G-15 分離得到3 個組分，分別命名為P1，P2 和P3，且其IC50值分別為4.02，1.39 和1.90 mg/mL，表明分子質(zhì)量小的多肽確實具有較高的ABTS+·清除能力，與Yan等[23]的結(jié)果相似。因此，P2 組分含有高ABTS+·清除率的小肽。

2.3 半制備型RP-HPLC 分離

圖3 表明，P2 組分經(jīng)RP-HPLC 分離后其分離度較好且分離出7 個組分，依次命名為P2-1，P2-2，P2-3，P2-4，P2-5，P2-6 和P2-7。由圖可知，在1 mg/mL 時，只有P2-3 和P2-5 組分的ABTS+·清除率均在90%以上，且其IC50值分別為0.488 mg/mL 和0.201 mg/mL，而其它組分的ABTS+·清除率均低于40%以下，表明多肽抗氧能力不僅與其疏水性有關(guān)[24]，更與其氨基酸的組成和肽的序列有關(guān)[25-26]。

圖3 P2 組分的半制備型RP-HPLC 的色譜圖（a）及各分離峰的ABTS+·清除率（b）Fig.3 Semi-preparative RP-HPLC chromatogram of fraction P2 on C18 preparative column（a）and ABTS+·scavenging rates of separate peaks（b）

2.4 質(zhì)譜鑒定結(jié)果

UPLC-ESI-TOF-MS/MS 已成功應(yīng)用于多肽結(jié)構(gòu)鑒定[27]。組分P2-3 和P2-5 經(jīng)TOF-MS/MS 分析，獲得片段的質(zhì)荷比（m/z）（圖4 和圖5）。根據(jù)肽鍵斷裂過程中形成的bi和yn-i系列離子的信息，采用Masslynx 軟件中Protein/Peptide Editor 程序?qū)Λ@得的bi和yn-i系列離子的質(zhì)量碎片進(jìn)行預(yù)測，并與質(zhì)譜圖上的碎片進(jìn)行匹配，各獲得1 個可靠性在99%及以上的多肽序列，其氨基酸序列分別為Tyr-Glu-Gly（YEG）和Tyr-Glu（YE）。食源性抗氧化肽通常在N-端含有疏水性的氨基酸殘基，如Pro，His，Tyr，Met 和Cys[18]，本文所獲得的2種小肽均符合上述特征。

圖4 組分P2-3 中主成分的二級質(zhì)譜圖Fig.4 TOF-MS/MS spectra of main constituent in fraction P2-3

圖5 組分P2-5 中主成分的二級質(zhì)譜圖Fig.5 TOF-MS/MS spectra of main constituent in fraction P2-5

2.5 多肽合成及活性測定

合成肽YEG 和YE 由吉爾生化（上海）有限公司合成，其純度分別為98.04%和98.52%（圖6和圖7），分子質(zhì)量分別為367.35 u 和310.30 u（圖8 和圖9）。同時，對合成肽YEG 和YE 以及谷胱甘肽（GSH）的清除ABTS+·的IC50值進(jìn)行測定（圖10），結(jié)果顯示，合成肽YEG 和YE 的清除ABTS+·的IC50值分別0.456 mg/mL 和0.184 mg/mL，且YE 的IC50值比GSH（IC50值為0.264 mg/mL）高出30.30%，與已報道類似小肽的結(jié)果相似[28-29]。

圖6 合成肽YEG 的RP-HPLC 色譜圖Fig.6 RP-HPLC chromatogram of synthetic peptides YEG

圖7 合成肽YE 的RP-HPLC 色譜圖Fig.7 RP-HPLC chromatogram of synthetic peptides YE

圖8 合成肽YEG 的質(zhì)譜圖Fig.8 Mass spectra of synthetic peptides YEG

圖9 合成肽YE 的質(zhì)譜圖Fig.9 Mass spectra of synthetic peptides YE

圖10 合成肽YEG 和YE 以及GSH清除ABTS+·的IC50 值Fig.10 IC50 values for ABTS+·scavenging of synthetic peptide YEG and YE as well as reduced L-Glutathione

3 結(jié)論

本文采用胰蛋白酶對細(xì)點圓趾蟹含肉下腳料進(jìn)行酶解，利用超慮系統(tǒng)、Sephadex G15 和半制備型RP-HPLC 分離純化獲得2 個ABTS+·清除率較高的組分P2-3 和P2-5。應(yīng)用UPLC-TOF-MS/MS對這2 個組分進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，最終鑒定出2種小肽的氨基酸序列為Tyr-Glu-Gly 和Tyr-Glu。經(jīng)固相合成，合成肽YEG 和YE 的分子質(zhì)量分別為310.30 u 和367.35 u，純度分別為98.52%和98.04%。同時，合成肽YEG 和YE 的清除ABTS+·的IC50值分別0.456 mg/mL 和0.184 mg/mL，且YE 的IC50值比GSH 高出30.30%。本研究明確了細(xì)點圓趾蟹含肉下腳料酶解產(chǎn)物的抗氧化活性，并對其含有的抗氧化肽進(jìn)行了分離純化與結(jié)構(gòu)鑒定，為細(xì)點圓趾蟹含肉下腳料的開發(fā)與利用提供了理論依據(jù)。