張 妞 范亞葦 于化泓 鄧澤元 李 靜

（南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室 南昌330047）

反式脂肪酸對人類健康的影響受到國內(nèi)外的關(guān)注。臨床研究和流行病學(xué)表明：大量攝入反式脂肪酸（TFAs）會增加低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）的水平，降低高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）的水平，增加脂蛋白（a）和血漿甘油三酯的水平，從而增加冠狀動脈心臟疾?。–HD）的風(fēng)險[1-2]。TFAs 每日攝入量為5 g 時，缺血性心臟病的風(fēng)險將增加25%[3]。TFAs 攝入促進炎癥，增加體重指數(shù)，提高C反應(yīng)蛋白，引起內(nèi)皮功能障礙，同時與II 型糖尿病、心臟病、肥胖、癌癥、高血壓的發(fā)生有密切聯(lián)系[5-6]。伊朗食品和食品標(biāo)準(zhǔn)委員會建議，食用油中TFAs 的總量不得超過10%；丹麥等國家要求食用油脂TFAs 低于總脂肪含量2%[7]；2015年6月16日，美國食品和藥品管理局宣布，將在3年內(nèi)完全禁止在食品中使用人造脂肪，以降低心臟疾病發(fā)病率。近30年來，我國居民的膳食結(jié)構(gòu)逐漸“西化”，含TFAs 的“洋快餐”，人造奶油、蛋糕、炸薯條和炸薯片年銷量以7%～9%的速度增長。由于早期對TFAs 缺乏監(jiān)管，與其相關(guān)的疾病發(fā)病率逐年遞增。

大量研究研究表明，不同來源和不同異構(gòu)體的TFAs 對人體健康的影響不同。在一項隊列研究[8]中發(fā)現(xiàn)9t C16：1與皮膚皺褶厚度和皮下脂肪呈負(fù)相關(guān)；Mozaffarian等[9-11]報道9t C16：1可降低血脂，升高高密度脂蛋白膽固醇，降低甘油三酯水平，降低糖尿病、心血管疾病的發(fā)病率。本課題組劉小如等[12]報道9t C16：1水平在健康人群血漿紅細(xì)胞膜中高于冠心病患者。烘烤煎炸的氫化油中9t C18：1可能會增加心血管疾病的發(fā)病率，而反芻動物中11t C18：1則通過硬脂酰輔酶A 去飽和酶1 轉(zhuǎn)化為CLA，可以降低癌癥和心血管疾病的發(fā)生率。有研究[13]報道牛肉中的10t C18：1可以誘導(dǎo)脂質(zhì)基因的表達并且可以降低人肝癌細(xì)胞（HepG2）的細(xì)胞活力。Harvey等[14-15]報道trans C18：2及其異構(gòu)體與心源性猝死有很強的相關(guān)性，可誘導(dǎo)促炎癥反應(yīng)和內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙。幾項動物實驗研究報道CLA 對動脈粥樣硬化和腦血管疾病有改善作用[16-17]，其中，9c11t CLA 的調(diào)節(jié)作用，部分解釋了11t C18：1和9t C18：1對內(nèi)皮細(xì)胞損傷的不同機制[18]。調(diào)查食物中trans C16：1（反式十六碳烯酸），trans C18：1（反式十八碳烯酸），trans C18：2（反式十八碳二烯酸）和CLA 的膳食來源及其異構(gòu)體的組成和含量，為研究不同來源的TFAs 對人體健康的影響提供科學(xué)依據(jù)。

本研究利用銀離子固相萃取結(jié)合氣相色譜儀分離并定量國內(nèi)TFAs 主要來源的反芻動物油脂、食用油和煎炸油中trans C16：1，trans C18：1，trans C18：2和CLA 異構(gòu)體的組成和含量，探討其在人類膳食中的暴露劑量，為進一步研究人類膳食脂質(zhì)中trans C16：1，trans C18：1，trans C18：2和CLA 含量與健康的關(guān)系提供相關(guān)科學(xué)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葵花油、花生油、玉米油、茶籽油、芝麻油、牛肉、羊肉、牛奶、牛奶粉、牛奶酪、羊奶、羊奶粉、羊奶奶酪，購于南昌市天虹超市。

脂肪酸標(biāo)品（GLC463 標(biāo)樣），美國Nu-Chek-Prep 公司；正己烷、乙酸甲酯、甲醇鈉-甲醇（色譜級），美國天地試劑公司；氯仿、甲醇、草酸，乙腈、甲醇鈉、異丙醇等均為國產(chǎn)分析純級。

1.2 儀器與設(shè)備

FA2204B 電子天平，上海精科天美科學(xué)儀器有限公司；TDL-5-A 低速大容量離心機，上海安亭科學(xué)儀器廠；DF101B 數(shù)顯集熱式攪拌器，金壇市大地自動化儀器廠；6890N 型氣相色譜儀（配有FID 檢測器和自動進樣器），美國Agilent 公司；Ag+-SPE（750 mg/6 mL），德國Sigma 公司

1.3 方法

1.3.1 樣品的預(yù)處理 分別取葵花油、花生油、玉米油、茶籽油、菜籽油、芝麻油50 mL，倒入陶瓷坩堝中，放在電爐上加熱，用水銀溫度計測量其溫度。當(dāng)溫度分別到270 ℃時，開始計時，加熱2 h 后，分別倒出油樣5 mL，冷卻至室溫，在-20℃下保存。牛奶和羊奶直接4 ℃保存，牛肉和羊肉則洗凈，攪碎后4 ℃保存。牛奶粉、羊奶粉、牛奶酪和羊奶酪用60 ℃水按1∶7（樣品：水）的比例溶解備用。

1.3.2 樣品脂質(zhì)的提取 脂質(zhì)的提取參考Folch等[19]方法，通過氯仿、甲醇、水3種溶劑提取油脂。分別取1 g 牛肉、羊肉或1 mL 牛奶，羊奶和油放入50 mL 大試管中，加入2 mL 水，5 mL 甲醇和2.5 mL 氯仿，振蕩2 min，再加入2.5 mL 水和2.5 mL 氯仿，渦流混勻，離心，取下層有機相，用氮氣吹干，得到粗油脂。

1.3.3 脂肪酸的甲酯化脂肪酸的甲酯化采用堿法甲酯化方法，取2 mg 提取的脂肪溶于1.5 mL 正己烷，加入40 μL 乙酸甲酯溶液和100 μL 甲醇鈉-甲醇溶液，渦流混勻1 min，37 ℃反應(yīng)20 min后，置于冰箱-20 ℃冷凍10 min，取出后立即加入60 μL 草酸-乙酸乙酯溶液，離心（4 200 r/min，5 min），吸取上層液過無水硫酸鈉柱，氮氣吹干。

1.3.4 Ag+-SPE 對樣品預(yù)分離[20]將上述得到的脂肪酸甲酯，用銀離子固相萃取柱（750 mg/6 mL）分離出反式單不飽和脂肪酸甲酯和CLA。使用前，先分別依次加入4 mL 丙酮和4 mL 正己烷淋洗，活化固相萃取柱；將1～2 mg脂肪酸甲酯溶于1 mL 正己烷，上樣，分別用6 mL 正己烷-丙酮（99∶1，體積比）洗脫出飽和脂肪酸甲酯；6 mL 正己烷-丙酮（96∶4，體積比）洗脫出反式單不飽和脂肪酸甲酯和t/t 共軛亞油酸甲酯；6 mL 正己烷-丙酮（96∶10，體積比）洗脫出順式單不飽和脂肪酸甲酯和c/c 共軛亞油酸甲酯；6 mL 正己烷-丙酮（0∶100，體積比）洗脫出二烯脂肪酸甲酯，分別收集洗脫液，氮氣吹干，加入適當(dāng)體積的正己烷溶解，氣相色譜分析。

1.3.5 GC 檢測條件 色譜柱：CP-Sil88 熔融石英毛細(xì)管柱（100 m×0.25 mm×0.2μm）。

分析經(jīng)過Ag+-SPE 預(yù)分離后的脂肪酸順反異構(gòu)體。GC 程序升溫的時間為110.33 min：45 ℃保持4 min，以13 ℃/min 升至150 ℃，保持47 min，再以4 ℃/min 升至215 ℃，保持35 min；FID 溫度250 ℃，進樣口溫度250 ℃；載氣（H2）流速30 mL/min，火焰離子化檢測器為40 mL/min；凈化空氣流速300 mL/min 和補充氣體（N2）流速30 mL/min；進樣體積1 μL。

分析樣品中總的脂肪酸成分。氣相色譜程序升溫的時間為86 min：45 ℃保持4 min，以13 ℃/min 的升溫速率將溫度升至175 ℃，保持27 min后再以4 ℃/min 的升溫速率升至215 ℃，保持35 min。脂肪酸定性分析參照463 標(biāo)樣圖譜確定，定量分析采用內(nèi)標(biāo)法。

1.3.6 統(tǒng)計方法 Excel 對數(shù)據(jù)進行分析處理，所有試驗均重復(fù)3 次；SPSS 22.0 對數(shù)據(jù)進行分析，檢測結(jié)果用Mean±SD 表示并且用單因素方差分析比較均值，P<0.05 為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 反芻動物油脂、食用油和煎炸油中trans C16：1 的組成和含量

表1 為反芻動物油脂、食用油和煎炸油trans C16：1異構(gòu)體含量，在反芻動物油脂中檢測到5～7種trans C16：1異構(gòu)體，在食用油和煎炸油中檢測到1～2種trans C16：1異構(gòu)體。反芻動物油脂中總trans C16：1的含量（平均值為5.21 mg/g脂肪，3.07～7.96 mg/g脂肪）顯著高于食用油和煎炸油總trans C16：1的含量（平均值為0.77 mg/g脂肪，0.27～1.18 mg/g脂肪）（P<0.05）。其中，9t C16：1含量最高（平均值為2.49，1.45～4.03 mg/g脂肪），其次為12t C16：1（平均值為0.77 mg/g脂肪，0.21～2.32 mg/g脂肪），6t-7t C16：1（平均值為0.56 mg/g脂肪，0.29～1.00 mg/g脂肪），10t C16：1（平均值為0.46 mg/g脂肪，0.10～2.15 mg/g脂肪），8t C16：1（平均值為0.43 mg/g脂肪，0.26～0.65 mg/g脂肪），11t C16：1（平均值為0.28 mg/g脂肪，0.14～0.40 mg/g脂肪）和13t C16：1（平均值為0.15 mg/g脂肪，0.12～0.23 mg/g脂肪）。

在反芻動物食品中，羊肉的trans C16：1含量最高，達到7.96 mg/g脂肪，其次是牛奶粉（6.38 mg/g脂肪），牛肉（6.08 mg/g脂肪）；食用油和煎炸油中總trans C16：1的含量沒有顯著性差異，只檢測到了6t-7t C16：1（0.29～1.0 mg/g脂肪）和12t C16：1（0.17～0.4 mg/g脂肪）。煎炸之后，茶籽油和芝麻油中6t-7t C16：1的含量顯著增加（P<0.05）。

2.2 反芻動物油脂、食用油和煎炸油中trans C18：1 異構(gòu)體的含量

表2 為反芻動物油脂、食用油和煎炸油中trans C18：1異構(gòu)體的含量，在反芻動物油脂中檢測到8～10種trans C18：1異構(gòu)體，在食用油和煎炸油中檢測到2～7種trans C18：1異構(gòu)體。除煎炸葵花油（14.84 mg/g脂肪）外，反芻動物油脂中總trans C18：1含量（平均值18.02 mg/g脂肪，11.96～28.25 mg/g脂肪）高于食用油和煎炸油中總trans C18：1含量（平均值為7.43 mg/g脂肪，5.00～10.33 mg/g脂肪）。其中，11t C18：1的含量最高（平均值為4.24 mg/g脂肪，0.41～11.65 mg/g脂肪），其次為10t C18：1（平均值為2.40 mg/g脂肪，0.64～9.12 mg/g脂肪），9t C18：1（平均值為2.30 mg/g脂肪，0.29～6.56 mg/g脂肪），13t/14t C18：1（平均值為2.18 mg/g脂肪，0.17～3.85 mg/g脂肪），16t C18：1（平均值為1.18 mg/g脂肪，0.91～1.51 mg/g脂肪），6t-8t C18：1（平均值為1.11 mg/g脂肪，0.07～2.87 mg/g脂肪），12t C18：1（平均值為1.00 mg/g脂肪，0.19～1.73 mg/g脂肪），15t C18：1（平均值為0.79 mg/g脂肪，0.11～1.33 mg/g脂肪），4t C18：1（平均值為0.34 mg/g脂肪，0.05～1.97 mg/g脂肪），5t C18：1（平均值為0.17 mg/g脂肪，0.04～0.45 mg/g脂肪）。

在反芻動物食品中，羊肉中的trans C18：1的含量最高，達到28.25 mg/g脂肪，其次是羊肉（25.87 mg/g脂肪），羊奶（22.6 mg/g脂肪）；食用油和煎炸油trans C18：1的含量沒有顯著性差異。煎炸之后，葵花油中6t-8t C18：1，9t C18：1，10t C18：1和11t C18：1的含量顯著增加（P<0.05）；花生油中的4t C18：1，5t C18：1，6t-8t C18：1，10t C18：1和11t C18：1的含量顯著增加（P<0.05）；玉米油中9t C18：1，10t C18：1，11t C18：1，12t C18：1和13-14t C18：1的含量顯著增加（P<0.05）；芝麻油中9t C18：1和11t C18：1的含量顯著增加（P<0.05）。

2.3 反芻動物油脂、食用油和煎炸油中trans C18：2 和CLA 異構(gòu)體的含量

表3 為反芻動物油脂、食用油和煎炸油trans C18：2和CLA 異構(gòu)體含量的測定結(jié)果，在反芻動物油脂中共檢測到5～6種trans C18：2和5～6種CLA，在食用油和煎炸油共檢測到2～4種trans C18：2和3～6種CLA。食用油和煎炸油中總trans

C18：2的含量（平均值為6.91 mg/g脂肪，1.97～13.83 m/g脂肪）高于反芻動物油脂（平均值為4.39 mg/g脂肪，3.78～6.06 mg/g脂肪）；其中，9t12c C18：2含量最高（平均值為2.17 mg/g脂肪，0.76～6.81 mg/g脂肪），其次是9c12t C18：2（平均值為2.10 mg/g脂肪，0.51～6.60 mg/g脂肪），9t12t C18：2（平均值為1.05 mg/g脂肪，0.31～1.71 mg/g脂肪），17cyclo（平均值為0.87 mg/g脂肪，0.42 ～2.03 mg/g脂肪），8c12t C18：2（平均值為0.49 mg/g脂肪，0.32～0.66 mg/g脂肪）。

表1 反芻動物油脂、食用油和煎炸油中trans C16：1 異構(gòu)體的含量（mg/g脂肪）Table 1 Fatty acids compositions of trans C16：1 isomers in ruminant animals fat，edible oils and frying oils（mg/g fat）

表2 反芻動物油脂、食用油和煎炸油中trans C18：1 異構(gòu)體的含量（mg/g脂肪）Table 2 Fatty acids compositions of trans C18：1 isomers in ruminant animals fat，edible oils and frying oils（mg/g fat）

表3 反芻動物油脂、食用油和煎炸油中trans C18：2 和CLA 異構(gòu)體的含量（mg/g脂肪）Table 3 Fatty acids compositions of trans C18：2 and CLA isomersin ruminant animals fat，edible oils and frying oils（mg/g fat）

在反芻動物油脂中，牛奶粉中的trans C18：2的含量最高，達到6.06 mg/g脂肪，其次是羊奶粉（4.69 mg/g脂肪）；食用油和煎炸油中，煎炸葵花油的trans C18：2的含量最高，達到13.83 mg/g脂肪，其次是煎炸玉米油（13.66 mg/g脂肪）和玉米油（12.38 mg/g脂肪）。煎炸之后，葵花油和芝麻油中的9t12c C18：2和9c12t C18：2的含量顯著增加（P<0.05）。

反芻動物油脂中CLA 的含量（平均值為4.32 mg/g脂肪，2.16～6.26 mg/g脂肪）顯著高于食用油和煎炸油中CLA 的含量（平均值為1.88 mg/g脂肪，1.41～3.08 mg/g脂肪）（P<0.05）；其中10t12c C18：2的含量最高（平均值為1.00 mg/g脂肪，0.40～2.44 mg/g脂肪），其次是11t13t C18：2（平均值 為0.98 mg/g脂肪，0.15～2.11 mg/g脂肪），11c13t C18：2（平均值為0.76 mg/g脂肪，0.15～1.51 mg/g脂肪），9c11t/8t10c C18：2（平均值為0.52 mg/g脂肪，0.06～0.94 mg/g脂肪），8t10t C18：2（平均值為0.49 mg/g脂肪，0.03～1.86 mg/g脂肪），10t12t C18：2（平均值為0.15 mg/g脂肪，0.02～0.42 mg/g脂肪）。

在反芻動物油脂中，牛奶粉中的CLA 的含量最高，達到6.26 mg/g脂肪，其次是羊奶（5.86 mg/g脂肪）；食用油和煎炸油中總CLA 的含量沒有顯著差異。煎炸之后，葵花油中除10t12c C18：2外的其它異構(gòu)體的含量均顯著增加（P<0.05）；花生油中 的10t12c C18：2和10t12t C18：2的含量顯著增加（P<0.05）；玉米油中9c11t/8t10c C18：2的含量顯著增加（P<0.05）；茶籽油中11t13t C18：2的含量顯著增加（P<0.05）；芝麻油中8t10t C18：2和9c11t/8t10c C18：2的含量顯著增加（P<0.05）。

3 討論

trans C16：1主要存在于反芻動物脂質(zhì)中，占總脂肪酸的0.36%～0.85%，其中，9t C16：1（1.45～4.03 mg/g脂肪）是主要異構(gòu)體，占總trans C16：1的34.33%～57.00%；食用油中的trans C16：1極其微量，占總脂肪酸的0.03%～0.14%。牛奶脂質(zhì)trans C16：1的含量與Kramer等[20]的研究結(jié)果 一致，牛肉脂質(zhì)中trans C16：1的含量高于丹麥居民食用牛肉的含量[21]，而羊肉中含量與之一致，可能與動物種類和采取部分以及放養(yǎng)季節(jié)有關(guān)；主要異構(gòu)體9t C16：1的含量也與研究報道一致[22]。trans C16：1主要來源于反芻動物脂質(zhì)，反芻動物中trans C18：1通過β 氧化可形成trans C16：1異構(gòu)體，其次飼料中的7t10t13t C16：3經(jīng)過生物氫化也可以合成trans C16：1異構(gòu)體[23-25]。研究報道[23，26-27]9t C16：1可以降低2 型糖尿病和冠狀動脈疾病的發(fā)生率，降低甘油三脂，升高高密度脂蛋白膽固醇，減少代謝調(diào)節(jié)異常，并抑制肝臟脂肪重生。

trans C18：1是反芻動物中一類重要的脂肪酸，占總脂肪酸的1.84%～3.88%，與Wolff等[28]結(jié)果一致，其中，11t C18：1是主要的異構(gòu)體，占總trans C18：1的19.85%～54.00%；而食用油和煎炸油中trans C18：1分別占總脂肪酸0.72%～0.90%和0.79%～1.03%，其中，9t C18：1是主要的異構(gòu)體，分別占食用油和煎炸油中總trans C18：1的5.80%～50.16%和29.32%～74.04%；煎炸之后，由高于活化能的熱能作用下，食用油中的多不飽和脂肪酸異構(gòu)化，trans C18：1的含量增加。大量研究證明[29-30]反芻動物具有大量異構(gòu)化酶和還原酶，其脂質(zhì)中的trans C18：1是由飼料中的不飽和脂肪酸（油酸、亞油酸等）在反芻動物瘤胃內(nèi)經(jīng)微生物（丁酸弧菌等）的生物氫化作用產(chǎn)生，經(jīng)血液循環(huán)傳遞到乳脂和自身脂肪中。氫化油中9t C18：1與心血管疾病和動脈粥樣硬化呈正相關(guān)。有研究報道反芻動物油脂中主要異構(gòu)體是11t C18：1可改善脂質(zhì)代謝紊亂，而9t C18：1則會誘發(fā)心血管疾病的發(fā)生[31]。本課題組比較了相同濃度的11t C18：1和9t C18：1對內(nèi)皮細(xì)胞的影響，發(fā)現(xiàn)兩者均會誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞炎癥，但是11t C18：1對內(nèi)皮細(xì)胞的損傷明顯低于9t C18：1[18]。

trans C18：2的主要來源是煎炸油，占總脂肪酸的0.28%～1.84%，其中，葵花油和芝麻油經(jīng)煎炸后trans C18：2的含量顯著增加，分別達到13.83 mg/g脂肪和7.46 mg/g脂肪，與楊波濤等[32-33]報道一致。食用油中的亞油酸在高溫煎炸下會發(fā)生異構(gòu)化，全順式亞油酸會轉(zhuǎn)化為反式亞油酸。反芻動物脂質(zhì)由微生物作用產(chǎn)生少量的trans C18：2，占總脂肪酸的0.44%～0.91%。研究顯示[34]trans C18：2相對于trans C18：1具有更強的促人臍靜脈平滑肌細(xì)胞增殖的作用；紅細(xì)胞膜中的trans C18：2的水平和院外心臟驟停呈正相關(guān)[35]。

CLA 的主要來源是反芻動物油脂，占總脂肪酸的0.48%～0.94%，其中羊奶CLA 的含量與Alonso等[36]研究一致，食用油和煎炸油中含有微量的CLA，占總脂肪酸的0.16%～0.33%，芝麻油中含有相對較高的CLA（2.94 mg/g脂肪），占總脂肪酸的0.13%。在反芻動物瘤胃中亞油酸和亞麻酸通過異構(gòu)化和生物脫氫反應(yīng)生成CLA，11t C18：1在動物細(xì)胞內(nèi)經(jīng)Δ-9 脫氫酶的脫氫作用也能形成CLA，可以增強免疫力，抗動脈粥樣硬化，抗癌[37-39]。

4 結(jié)論

本研究是以反芻動物油脂、食用油和煎炸油為研究對象，結(jié)合Ag+-SPE 和GC 色譜2種升溫程序測定食物中trans C16：1，trans C18：1，trans C18：2和CLA 異構(gòu)體的含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，樣品中共檢測出23種反式脂肪酸，其中7種trans C16：1，10種trans C18：1，6種trans C18：2和6種CLA 異構(gòu)體。

反芻動物油脂中trans C16：1，trans C18：1和CLA顯著高于食用油和煎炸油，而煎炸油中trans C18：2含量較高。反芻動x物油脂中9t C16：1，11t C18：1，9t12t C18：2是主要TFAs異構(gòu)體，10t12c C18：2是主要的CLA 異構(gòu)體；而食用油和煎炸油中12t C16：1，9t C18：1，9t12c C18：2，9c12t C18：2為主要的TFAs 異構(gòu) 體，10t12c C18：2和11c13t C18：2是CLA的主要異構(gòu)體?？梢姡雌c動物油脂和食用油、煎炸油中主要TFAs 異構(gòu)體不同，而不同來源的TFAs 的組成和含量的差別，是不同來源TFAs 對人體健康影響的差異原因之一。對比食用油煎炸前后，茶籽油脂肪酸組成變化最小，而大部分煎炸油比未煎炸油中trans C18：2，trans C18：1的含量顯著增加，由此可見茶籽油適合煎炸，富含多不飽和脂肪酸的食用油經(jīng)煎炸后會產(chǎn)生較多的trans C18：2，而trans C18：2比trans C18：1對人體健康存在更大的潛在隱患，因此對煎炸油品質(zhì)的控制應(yīng)引起高度重視。