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        Ag+-SPE/GC測定食物中trans C16:1,trans C18:1,trans C18:2和共軛亞油酸的含量

        2020-10-16 06:36:40范亞葦于化泓鄧澤元
        中國食品學(xué)報 2020年9期
        關(guān)鍵詞:油脂

        張 妞 范亞葦 于化泓 鄧澤元 李 靜

        (南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室 南昌330047)

        反式脂肪酸對人類健康的影響受到國內(nèi)外的關(guān)注。臨床研究和流行病學(xué)表明:大量攝入反式脂肪酸(TFAs)會增加低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)的水平,降低高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)的水平,增加脂蛋白(a)和血漿甘油三酯的水平,從而增加冠狀動脈心臟疾?。–HD)的風(fēng)險[1-2]。TFAs 每日攝入量為5 g 時,缺血性心臟病的風(fēng)險將增加25%[3]。TFAs 攝入促進炎癥,增加體重指數(shù),提高C反應(yīng)蛋白,引起內(nèi)皮功能障礙,同時與II 型糖尿病、心臟病、肥胖、癌癥、高血壓的發(fā)生有密切聯(lián)系[5-6]。伊朗食品和食品標(biāo)準(zhǔn)委員會建議,食用油中TFAs 的總量不得超過10%;丹麥等國家要求食用油脂TFAs 低于總脂肪含量2%[7];2015年6月16日,美國食品和藥品管理局宣布,將在3年內(nèi)完全禁止在食品中使用人造脂肪,以降低心臟疾病發(fā)病率。近30年來,我國居民的膳食結(jié)構(gòu)逐漸“西化”,含TFAs 的“洋快餐”,人造奶油、蛋糕、炸薯條和炸薯片年銷量以7%~9%的速度增長。由于早期對TFAs 缺乏監(jiān)管,與其相關(guān)的疾病發(fā)病率逐年遞增。

        大量研究研究表明,不同來源和不同異構(gòu)體的TFAs 對人體健康的影響不同。在一項隊列研究[8]中發(fā)現(xiàn)9t C16:1與皮膚皺褶厚度和皮下脂肪呈負(fù)相關(guān);Mozaffarian等[9-11]報道9t C16:1可降低血脂,升高高密度脂蛋白膽固醇,降低甘油三酯水平,降低糖尿病、心血管疾病的發(fā)病率。本課題組劉小如等[12]報道9t C16:1水平在健康人群血漿紅細(xì)胞膜中高于冠心病患者。烘烤煎炸的氫化油中9t C18:1可能會增加心血管疾病的發(fā)病率,而反芻動物中11t C18:1則通過硬脂酰輔酶A 去飽和酶1 轉(zhuǎn)化為CLA,可以降低癌癥和心血管疾病的發(fā)生率。有研究[13]報道牛肉中的10t C18:1可以誘導(dǎo)脂質(zhì)基因的表達并且可以降低人肝癌細(xì)胞(HepG2)的細(xì)胞活力。Harvey等[14-15]報道trans C18:2及其異構(gòu)體與心源性猝死有很強的相關(guān)性,可誘導(dǎo)促炎癥反應(yīng)和內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙。幾項動物實驗研究報道CLA 對動脈粥樣硬化和腦血管疾病有改善作用[16-17],其中,9c11t CLA 的調(diào)節(jié)作用,部分解釋了11t C18:1和9t C18:1對內(nèi)皮細(xì)胞損傷的不同機制[18]。調(diào)查食物中trans C16:1(反式十六碳烯酸),trans C18:1(反式十八碳烯酸),trans C18:2(反式十八碳二烯酸)和CLA 的膳食來源及其異構(gòu)體的組成和含量,為研究不同來源的TFAs 對人體健康的影響提供科學(xué)依據(jù)。

        本研究利用銀離子固相萃取結(jié)合氣相色譜儀分離并定量國內(nèi)TFAs 主要來源的反芻動物油脂、食用油和煎炸油中trans C16:1,trans C18:1,trans C18:2和CLA 異構(gòu)體的組成和含量,探討其在人類膳食中的暴露劑量,為進一步研究人類膳食脂質(zhì)中trans C16:1,trans C18:1,trans C18:2和CLA 含量與健康的關(guān)系提供相關(guān)科學(xué)理論依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        葵花油、花生油、玉米油、茶籽油、芝麻油、牛肉、羊肉、牛奶、牛奶粉、牛奶酪、羊奶、羊奶粉、羊奶奶酪,購于南昌市天虹超市。

        脂肪酸標(biāo)品(GLC463 標(biāo)樣),美國Nu-Chek-Prep 公司;正己烷、乙酸甲酯、甲醇鈉-甲醇(色譜級),美國天地試劑公司;氯仿、甲醇、草酸,乙腈、甲醇鈉、異丙醇等均為國產(chǎn)分析純級。

        1.2 儀器與設(shè)備

        FA2204B 電子天平,上海精科天美科學(xué)儀器有限公司;TDL-5-A 低速大容量離心機,上海安亭科學(xué)儀器廠;DF101B 數(shù)顯集熱式攪拌器,金壇市大地自動化儀器廠;6890N 型氣相色譜儀(配有FID 檢測器和自動進樣器),美國Agilent 公司;Ag+-SPE(750 mg/6 mL),德國Sigma 公司

        1.3 方法

        1.3.1 樣品的預(yù)處理 分別取葵花油、花生油、玉米油、茶籽油、菜籽油、芝麻油50 mL,倒入陶瓷坩堝中,放在電爐上加熱,用水銀溫度計測量其溫度。當(dāng)溫度分別到270 ℃時,開始計時,加熱2 h 后,分別倒出油樣5 mL,冷卻至室溫,在-20℃下保存。牛奶和羊奶直接4 ℃保存,牛肉和羊肉則洗凈,攪碎后4 ℃保存。牛奶粉、羊奶粉、牛奶酪和羊奶酪用60 ℃水按1∶7(樣品:水)的比例溶解備用。

        1.3.2 樣品脂質(zhì)的提取 脂質(zhì)的提取參考Folch等[19]方法,通過氯仿、甲醇、水3種溶劑提取油脂。分別取1 g 牛肉、羊肉或1 mL 牛奶,羊奶和油放入50 mL 大試管中,加入2 mL 水,5 mL 甲醇和2.5 mL 氯仿,振蕩2 min,再加入2.5 mL 水和2.5 mL 氯仿,渦流混勻,離心,取下層有機相,用氮氣吹干,得到粗油脂。

        1.3.3 脂肪酸的甲酯化脂肪酸的甲酯化采用堿法甲酯化方法,取2 mg 提取的脂肪溶于1.5 mL 正己烷,加入40 μL 乙酸甲酯溶液和100 μL 甲醇鈉-甲醇溶液,渦流混勻1 min,37 ℃反應(yīng)20 min后,置于冰箱-20 ℃冷凍10 min,取出后立即加入60 μL 草酸-乙酸乙酯溶液,離心(4 200 r/min,5 min),吸取上層液過無水硫酸鈉柱,氮氣吹干。

        1.3.4 Ag+-SPE 對樣品預(yù)分離[20]將上述得到的脂肪酸甲酯,用銀離子固相萃取柱(750 mg/6 mL)分離出反式單不飽和脂肪酸甲酯和CLA。使用前,先分別依次加入4 mL 丙酮和4 mL 正己烷淋洗,活化固相萃取柱;將1~2 mg脂肪酸甲酯溶于1 mL 正己烷,上樣,分別用6 mL 正己烷-丙酮(99∶1,體積比)洗脫出飽和脂肪酸甲酯;6 mL 正己烷-丙酮(96∶4,體積比)洗脫出反式單不飽和脂肪酸甲酯和t/t 共軛亞油酸甲酯;6 mL 正己烷-丙酮(96∶10,體積比)洗脫出順式單不飽和脂肪酸甲酯和c/c 共軛亞油酸甲酯;6 mL 正己烷-丙酮(0∶100,體積比)洗脫出二烯脂肪酸甲酯,分別收集洗脫液,氮氣吹干,加入適當(dāng)體積的正己烷溶解,氣相色譜分析。

        1.3.5 GC 檢測條件 色譜柱:CP-Sil88 熔融石英毛細(xì)管柱(100 m×0.25 mm×0.2μm)。

        分析經(jīng)過Ag+-SPE 預(yù)分離后的脂肪酸順反異構(gòu)體。GC 程序升溫的時間為110.33 min:45 ℃保持4 min,以13 ℃/min 升至150 ℃,保持47 min,再以4 ℃/min 升至215 ℃,保持35 min;FID 溫度250 ℃,進樣口溫度250 ℃;載氣(H2)流速30 mL/min,火焰離子化檢測器為40 mL/min;凈化空氣流速300 mL/min 和補充氣體(N2)流速30 mL/min;進樣體積1 μL。

        分析樣品中總的脂肪酸成分。氣相色譜程序升溫的時間為86 min:45 ℃保持4 min,以13 ℃/min 的升溫速率將溫度升至175 ℃,保持27 min后再以4 ℃/min 的升溫速率升至215 ℃,保持35 min。脂肪酸定性分析參照463 標(biāo)樣圖譜確定,定量分析采用內(nèi)標(biāo)法。

        1.3.6 統(tǒng)計方法 Excel 對數(shù)據(jù)進行分析處理,所有試驗均重復(fù)3 次;SPSS 22.0 對數(shù)據(jù)進行分析,檢測結(jié)果用Mean±SD 表示并且用單因素方差分析比較均值,P<0.05 為差異顯著。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 反芻動物油脂、食用油和煎炸油中trans C16:1 的組成和含量

        表1 為反芻動物油脂、食用油和煎炸油trans C16:1異構(gòu)體含量,在反芻動物油脂中檢測到5~7種trans C16:1異構(gòu)體,在食用油和煎炸油中檢測到1~2種trans C16:1異構(gòu)體。反芻動物油脂中總trans C16:1的含量(平均值為5.21 mg/g脂肪,3.07~7.96 mg/g脂肪)顯著高于食用油和煎炸油總trans C16:1的含量(平均值為0.77 mg/g脂肪,0.27~1.18 mg/g脂肪)(P<0.05)。其中,9t C16:1含量最高(平均值為2.49,1.45~4.03 mg/g脂肪),其次為12t C16:1(平均值為0.77 mg/g脂肪,0.21~2.32 mg/g脂肪),6t-7t C16:1(平均值為0.56 mg/g脂肪,0.29~1.00 mg/g脂肪),10t C16:1(平均值為0.46 mg/g脂肪,0.10~2.15 mg/g脂肪),8t C16:1(平均值為0.43 mg/g脂肪,0.26~0.65 mg/g脂肪),11t C16:1(平均值為0.28 mg/g脂肪,0.14~0.40 mg/g脂肪)和13t C16:1(平均值為0.15 mg/g脂肪,0.12~0.23 mg/g脂肪)。

        在反芻動物食品中,羊肉的trans C16:1含量最高,達到7.96 mg/g脂肪,其次是牛奶粉(6.38 mg/g脂肪),牛肉(6.08 mg/g脂肪);食用油和煎炸油中總trans C16:1的含量沒有顯著性差異,只檢測到了6t-7t C16:1(0.29~1.0 mg/g脂肪)和12t C16:1(0.17~0.4 mg/g脂肪)。煎炸之后,茶籽油和芝麻油中6t-7t C16:1的含量顯著增加(P<0.05)。

        2.2 反芻動物油脂、食用油和煎炸油中trans C18:1 異構(gòu)體的含量

        表2 為反芻動物油脂、食用油和煎炸油中trans C18:1異構(gòu)體的含量,在反芻動物油脂中檢測到8~10種trans C18:1異構(gòu)體,在食用油和煎炸油中檢測到2~7種trans C18:1異構(gòu)體。除煎炸葵花油(14.84 mg/g脂肪)外,反芻動物油脂中總trans C18:1含量(平均值18.02 mg/g脂肪,11.96~28.25 mg/g脂肪)高于食用油和煎炸油中總trans C18:1含量(平均值為7.43 mg/g脂肪,5.00~10.33 mg/g脂肪)。其中,11t C18:1的含量最高(平均值為4.24 mg/g脂肪,0.41~11.65 mg/g脂肪),其次為10t C18:1(平均值為2.40 mg/g脂肪,0.64~9.12 mg/g脂肪),9t C18:1(平均值為2.30 mg/g脂肪,0.29~6.56 mg/g脂肪),13t/14t C18:1(平均值為2.18 mg/g脂肪,0.17~3.85 mg/g脂肪),16t C18:1(平均值為1.18 mg/g脂肪,0.91~1.51 mg/g脂肪),6t-8t C18:1(平均值為1.11 mg/g脂肪,0.07~2.87 mg/g脂肪),12t C18:1(平均值為1.00 mg/g脂肪,0.19~1.73 mg/g脂肪),15t C18:1(平均值為0.79 mg/g脂肪,0.11~1.33 mg/g脂肪),4t C18:1(平均值為0.34 mg/g脂肪,0.05~1.97 mg/g脂肪),5t C18:1(平均值為0.17 mg/g脂肪,0.04~0.45 mg/g脂肪)。

        在反芻動物食品中,羊肉中的trans C18:1的含量最高,達到28.25 mg/g脂肪,其次是羊肉(25.87 mg/g脂肪),羊奶(22.6 mg/g脂肪);食用油和煎炸油trans C18:1的含量沒有顯著性差異。煎炸之后,葵花油中6t-8t C18:1,9t C18:1,10t C18:1和11t C18:1的含量顯著增加(P<0.05);花生油中的4t C18:1,5t C18:1,6t-8t C18:1,10t C18:1和11t C18:1的含量顯著增加(P<0.05);玉米油中9t C18:1,10t C18:1,11t C18:1,12t C18:1和13-14t C18:1的含量顯著增加(P<0.05);芝麻油中9t C18:1和11t C18:1的含量顯著增加(P<0.05)。

        2.3 反芻動物油脂、食用油和煎炸油中trans C18:2 和CLA 異構(gòu)體的含量

        表3 為反芻動物油脂、食用油和煎炸油trans C18:2和CLA 異構(gòu)體含量的測定結(jié)果,在反芻動物油脂中共檢測到5~6種trans C18:2和5~6種CLA,在食用油和煎炸油共檢測到2~4種trans C18:2和3~6種CLA。食用油和煎炸油中總trans

        C18:2的含量(平均值為6.91 mg/g脂肪,1.97~13.83 m/g脂肪)高于反芻動物油脂(平均值為4.39 mg/g脂肪,3.78~6.06 mg/g脂肪);其中,9t12c C18:2含量最高(平均值為2.17 mg/g脂肪,0.76~6.81 mg/g脂肪),其次是9c12t C18:2(平均值為2.10 mg/g脂肪,0.51~6.60 mg/g脂肪),9t12t C18:2(平均值為1.05 mg/g脂肪,0.31~1.71 mg/g脂肪),17cyclo(平均值為0.87 mg/g脂肪,0.42 ~2.03 mg/g脂肪),8c12t C18:2(平均值為0.49 mg/g脂肪,0.32~0.66 mg/g脂肪)。

        表1 反芻動物油脂、食用油和煎炸油中trans C16:1 異構(gòu)體的含量(mg/g脂肪)Table 1 Fatty acids compositions of trans C16:1 isomers in ruminant animals fat,edible oils and frying oils(mg/g fat)

        表2 反芻動物油脂、食用油和煎炸油中trans C18:1 異構(gòu)體的含量(mg/g脂肪)Table 2 Fatty acids compositions of trans C18:1 isomers in ruminant animals fat,edible oils and frying oils(mg/g fat)

        表3 反芻動物油脂、食用油和煎炸油中trans C18:2 和CLA 異構(gòu)體的含量(mg/g脂肪)Table 3 Fatty acids compositions of trans C18:2 and CLA isomersin ruminant animals fat,edible oils and frying oils(mg/g fat)

        在反芻動物油脂中,牛奶粉中的trans C18:2的含量最高,達到6.06 mg/g脂肪,其次是羊奶粉(4.69 mg/g脂肪);食用油和煎炸油中,煎炸葵花油的trans C18:2的含量最高,達到13.83 mg/g脂肪,其次是煎炸玉米油(13.66 mg/g脂肪)和玉米油(12.38 mg/g脂肪)。煎炸之后,葵花油和芝麻油中的9t12c C18:2和9c12t C18:2的含量顯著增加(P<0.05)。

        反芻動物油脂中CLA 的含量(平均值為4.32 mg/g脂肪,2.16~6.26 mg/g脂肪)顯著高于食用油和煎炸油中CLA 的含量(平均值為1.88 mg/g脂肪,1.41~3.08 mg/g脂肪)(P<0.05);其中10t12c C18:2的含量最高(平均值為1.00 mg/g脂肪,0.40~2.44 mg/g脂肪),其次是11t13t C18:2(平均值 為0.98 mg/g脂肪,0.15~2.11 mg/g脂肪),11c13t C18:2(平均值為0.76 mg/g脂肪,0.15~1.51 mg/g脂肪),9c11t/8t10c C18:2(平均值為0.52 mg/g脂肪,0.06~0.94 mg/g脂肪),8t10t C18:2(平均值為0.49 mg/g脂肪,0.03~1.86 mg/g脂肪),10t12t C18:2(平均值為0.15 mg/g脂肪,0.02~0.42 mg/g脂肪)。

        在反芻動物油脂中,牛奶粉中的CLA 的含量最高,達到6.26 mg/g脂肪,其次是羊奶(5.86 mg/g脂肪);食用油和煎炸油中總CLA 的含量沒有顯著差異。煎炸之后,葵花油中除10t12c C18:2外的其它異構(gòu)體的含量均顯著增加(P<0.05);花生油中 的10t12c C18:2和10t12t C18:2的含量顯著增加(P<0.05);玉米油中9c11t/8t10c C18:2的含量顯著增加(P<0.05);茶籽油中11t13t C18:2的含量顯著增加(P<0.05);芝麻油中8t10t C18:2和9c11t/8t10c C18:2的含量顯著增加(P<0.05)。

        3 討論

        trans C16:1主要存在于反芻動物脂質(zhì)中,占總脂肪酸的0.36%~0.85%,其中,9t C16:1(1.45~4.03 mg/g脂肪)是主要異構(gòu)體,占總trans C16:1的34.33%~57.00%;食用油中的trans C16:1極其微量,占總脂肪酸的0.03%~0.14%。牛奶脂質(zhì)trans C16:1的含量與Kramer等[20]的研究結(jié)果 一致,牛肉脂質(zhì)中trans C16:1的含量高于丹麥居民食用牛肉的含量[21],而羊肉中含量與之一致,可能與動物種類和采取部分以及放養(yǎng)季節(jié)有關(guān);主要異構(gòu)體9t C16:1的含量也與研究報道一致[22]。trans C16:1主要來源于反芻動物脂質(zhì),反芻動物中trans C18:1通過β 氧化可形成trans C16:1異構(gòu)體,其次飼料中的7t10t13t C16:3經(jīng)過生物氫化也可以合成trans C16:1異構(gòu)體[23-25]。研究報道[23,26-27]9t C16:1可以降低2 型糖尿病和冠狀動脈疾病的發(fā)生率,降低甘油三脂,升高高密度脂蛋白膽固醇,減少代謝調(diào)節(jié)異常,并抑制肝臟脂肪重生。

        trans C18:1是反芻動物中一類重要的脂肪酸,占總脂肪酸的1.84%~3.88%,與Wolff等[28]結(jié)果一致,其中,11t C18:1是主要的異構(gòu)體,占總trans C18:1的19.85%~54.00%;而食用油和煎炸油中trans C18:1分別占總脂肪酸0.72%~0.90%和0.79%~1.03%,其中,9t C18:1是主要的異構(gòu)體,分別占食用油和煎炸油中總trans C18:1的5.80%~50.16%和29.32%~74.04%;煎炸之后,由高于活化能的熱能作用下,食用油中的多不飽和脂肪酸異構(gòu)化,trans C18:1的含量增加。大量研究證明[29-30]反芻動物具有大量異構(gòu)化酶和還原酶,其脂質(zhì)中的trans C18:1是由飼料中的不飽和脂肪酸(油酸、亞油酸等)在反芻動物瘤胃內(nèi)經(jīng)微生物(丁酸弧菌等)的生物氫化作用產(chǎn)生,經(jīng)血液循環(huán)傳遞到乳脂和自身脂肪中。氫化油中9t C18:1與心血管疾病和動脈粥樣硬化呈正相關(guān)。有研究報道反芻動物油脂中主要異構(gòu)體是11t C18:1可改善脂質(zhì)代謝紊亂,而9t C18:1則會誘發(fā)心血管疾病的發(fā)生[31]。本課題組比較了相同濃度的11t C18:1和9t C18:1對內(nèi)皮細(xì)胞的影響,發(fā)現(xiàn)兩者均會誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞炎癥,但是11t C18:1對內(nèi)皮細(xì)胞的損傷明顯低于9t C18:1[18]。

        trans C18:2的主要來源是煎炸油,占總脂肪酸的0.28%~1.84%,其中,葵花油和芝麻油經(jīng)煎炸后trans C18:2的含量顯著增加,分別達到13.83 mg/g脂肪和7.46 mg/g脂肪,與楊波濤等[32-33]報道一致。食用油中的亞油酸在高溫煎炸下會發(fā)生異構(gòu)化,全順式亞油酸會轉(zhuǎn)化為反式亞油酸。反芻動物脂質(zhì)由微生物作用產(chǎn)生少量的trans C18:2,占總脂肪酸的0.44%~0.91%。研究顯示[34]trans C18:2相對于trans C18:1具有更強的促人臍靜脈平滑肌細(xì)胞增殖的作用;紅細(xì)胞膜中的trans C18:2的水平和院外心臟驟停呈正相關(guān)[35]。

        CLA 的主要來源是反芻動物油脂,占總脂肪酸的0.48%~0.94%,其中羊奶CLA 的含量與Alonso等[36]研究一致,食用油和煎炸油中含有微量的CLA,占總脂肪酸的0.16%~0.33%,芝麻油中含有相對較高的CLA(2.94 mg/g脂肪),占總脂肪酸的0.13%。在反芻動物瘤胃中亞油酸和亞麻酸通過異構(gòu)化和生物脫氫反應(yīng)生成CLA,11t C18:1在動物細(xì)胞內(nèi)經(jīng)Δ-9 脫氫酶的脫氫作用也能形成CLA,可以增強免疫力,抗動脈粥樣硬化,抗癌[37-39]。

        4 結(jié)論

        本研究是以反芻動物油脂、食用油和煎炸油為研究對象,結(jié)合Ag+-SPE 和GC 色譜2種升溫程序測定食物中trans C16:1,trans C18:1,trans C18:2和CLA 異構(gòu)體的含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn),樣品中共檢測出23種反式脂肪酸,其中7種trans C16:1,10種trans C18:1,6種trans C18:2和6種CLA 異構(gòu)體。

        反芻動物油脂中trans C16:1,trans C18:1和CLA顯著高于食用油和煎炸油,而煎炸油中trans C18:2含量較高。反芻動x物油脂中9t C16:1,11t C18:1,9t12t C18:2是主要TFAs異構(gòu)體,10t12c C18:2是主要的CLA 異構(gòu)體;而食用油和煎炸油中12t C16:1,9t C18:1,9t12c C18:2,9c12t C18:2為主要的TFAs 異構(gòu) 體,10t12c C18:2和11c13t C18:2是CLA的主要異構(gòu)體??梢姡雌c動物油脂和食用油、煎炸油中主要TFAs 異構(gòu)體不同,而不同來源的TFAs 的組成和含量的差別,是不同來源TFAs 對人體健康影響的差異原因之一。對比食用油煎炸前后,茶籽油脂肪酸組成變化最小,而大部分煎炸油比未煎炸油中trans C18:2,trans C18:1的含量顯著增加,由此可見茶籽油適合煎炸,富含多不飽和脂肪酸的食用油經(jīng)煎炸后會產(chǎn)生較多的trans C18:2,而trans C18:2比trans C18:1對人體健康存在更大的潛在隱患,因此對煎炸油品質(zhì)的控制應(yīng)引起高度重視。

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