徐 嬋，黃慧琪，呂奕兵，林親雄，宋 萍，楊新洲*

(1. 華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院藥學部，武漢 430030；2.青海民族大學科學科技處，西寧 810007； 3.中南民族大學藥學院，武漢 430074)

原發(fā)性肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是世界上最常見的腫瘤之一，每年診斷出約78萬新的病例，超過745 000例死亡[1]，在各種致死惡性腫瘤中居第二位[2-3]，且有逐年升高的趨勢.男性相較于女性患病幾率更高，在30～50歲之間最為常見，約占患病人口的一半.盡管在診斷和治療技術方面取得了一定的進步，但大多數肝癌患者在確診后12個月內將喪生.手術治療通常被認為是治療肝癌的有效方法，但肝癌患者適用于這種策略仍然很少.因此，大多數肝癌患者必須接受全身化學療法.順鉑是臨床上治療多種癌癥較為有效的抗腫瘤藥物之一，但其毒副作用給患者帶來嚴重的疼痛和后遺癥.一些廣泛應用的抗腫瘤藥物都是直接或間接從天然產物中得到的，其中來自天然產物的抗癌藥物如長春新堿和紫杉醇在臨床上得到廣泛應用，并且大量的從植物中提取的抗癌藥物已經通過臨床評審[4].因此，從天然產物中提取出具有毒副作用小、結構新穎、效果強等優(yōu)勢的抗腫瘤藥物，已經成為當今社會研究的熱點.

藏木香，又稱總狀土木香，藏文名為“瑪奴”，是菊科旋覆花屬植物藏木香(InularacemosaHook. f.)的干燥根[5].藏木香具有健脾和胃、調氣解郁等功能，用于胃腸功能失調，岔氣作痛等癥[5].據文獻報道，旋覆花屬植物藏木香主要成分為倍半萜、二萜、三萜、甾體和黃酮[5].倍半萜類化學成分是旋覆花屬植物的特征性成分，以桉葉烷型、吉馬烷型和愈創(chuàng)木烷型為主.研究表明，旋覆花屬植物在抗炎、抗腫瘤、抗菌、護肝及糖尿病治療等方面具有良好的生物活性，其主要的藥效成分為倍半萜類物質.從旋覆花屬植物中提取出的倍半萜類化合物具有明顯的腫瘤細胞毒性[5].例如從Inulaviscaosa葉中提取出的倍半萜內酯對SK-28等人黑素瘤細胞株有細胞毒性[6].從I.graveolens的地上部分分離出的倍半萜ivalin對腫瘤細胞P-388等有明顯的細胞毒性[7].因此，從旋覆花屬藏藥藏木香中尋找抗腫瘤藥物存在著巨大的潛能.本文采用溶劑加壓提取技術制備了藏木香的石油醚、乙酸乙酯和甲醇三個部位的提取物，以供其體外抗肝癌活性篩選.研究選用HepG2和Hep3B兩個肝癌細胞株，采用MTT法測試三種提取物的抗肝癌活性；選用L-02人正常肝細胞株評估藏木香對于人體正常肝細胞的毒性.結果顯示了藏木香石油醚提取物具有潛在的抗肝癌活性，本研究能為從藏藥中開發(fā)新抗癌藥物提供想法與思路.

1材料與方法

1.1材料試劑與儀器設備

藏木香藥材2015年7月采集于青海省互助縣北山林場，經過青海民族大學化學與生命科學學院毛繼祖教授鑒定為菊科旋覆花屬植物總狀土木香的根(InularacemosaHook. f.)，藥材標本(No. SC0184)存放于中南民族大學藥學院標本館.

細胞株：HepG2和Hep3B人肝癌細胞株及L-02人正常肝細胞株(American Type Culture Collection，Rockville，MD，USA)；RPMI 1640培養(yǎng)基：上海拜力生物科技有限公司；小牛血清：上海拜力生物科技有限公司；雙抗：上海博耀生物科技有限公司；CDDP(順鉑)：Sigma公司；石油醚、乙酸乙酯和甲醇(AR)：國藥集團；MTT：Sigma公司.酶標儀：Spectra Max 340PC型；CO2培養(yǎng)箱：上海博訊實業(yè)有限公司；倒置熒光顯微鏡：Olympus B202型；96孔、24孔培養(yǎng)板：上海拜力生物科技有限公司.

1.2樣品制備方法

采用BUCHI E-916型快速溶劑萃取儀對該藥材進行提取[8].使用3個溶劑通道，依次為石油醚、乙酸乙酯和甲醇，待儀器啟動，初始化完畢后，執(zhí)行1次清洗，中途更換使用溶劑種類，各沖洗1次，每次 20 mL，最后用60 s氮氣的吹掃.在40 mL的萃取池中加入少量的干凈河沙覆蓋底層，再將10 g藥材粉末加入到萃取池中，表面用干凈河沙覆蓋，最后用濾紙片封蓋，連接上溶劑萃取通道.選擇序列模式控制運行，1個樣品萃取通道，每個溶劑萃取時間10 min，設定壓力為10 MPa，溫度為 60 ℃，單個溶劑萃取重復3次，依次切換到另2個溶劑系統(tǒng)，設定參數和次數同第1 個溶劑系統(tǒng)，獲得了該藥材的3 種溶劑石油醚、乙酸乙酯和甲醇萃取液，用旋轉蒸發(fā)儀揮發(fā)干有機溶劑，得到該藥材干燥的石油醚部位(IR-Pe)0.25 g，乙酸乙酯部位(IR-Et)0.48 g，甲醇部位(IR-Me)0.73 g.抗肝癌活性成分篩選采用已制備的IR-Pe、IR-Et和IR-Me，臨用前將提取物分別用DMSO溶解，然后用培養(yǎng)基分別稀釋到所需濃度.

1.3細胞培養(yǎng)

HepG2和Hep3B人肝癌細胞株及L-02人正常肝細胞株均從美國模式培養(yǎng)物集存庫購買(American Type Culture Collection，Rockville，MD，USA)，在恒溫37 ℃、含有5%CO2的培養(yǎng)箱內生長.細胞培養(yǎng)在DMEM培養(yǎng)基(Hyclone)中，其含有1%抗生素(包括100 U·mL-1青霉素和100 μg·mL-1鏈霉素)和10%胎牛血清(FBS，Hyclone，USA).

1.4抗肝癌活性篩選

取對數生長期的HepG2和Hep3B人肝癌細胞株及L-02人正常肝細胞，在恒溫37 ℃、含有5%CO2的培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，然后接種在96孔板中，接種密度為每孔5×104個.運用MTT法測試細胞活力和細胞毒性[9].藏木香提取物溶解在DMSO溶液中，配制濃度為200 μg·mL-1的母液.使用無血清的培養(yǎng)基將母液稀釋到終濃度為10、20、30和40 μg·mL-1的待測樣品(DMSO濃度低于0.1%).待細胞在96孔板長滿后，吸棄培養(yǎng)液.每孔加入200 μL的不同濃度的藏木香提取物；本研究設不加需檢測樣品的實驗對照組和不加需檢測樣品以及細胞的空白對照組，每種濃度一式5孔，分別在培養(yǎng)基中培養(yǎng)12、24、48 h后，棄去培養(yǎng)液，每孔加入以DMEM配制的5 mg·mL-1MTT溶液100 μL，繼續(xù)孵育0.5～1 h.然后棄去上清液，加入150 μLDMSO溶解藍紫色甲臜結晶，酶標儀于562 nm下測定每孔吸光值A.生長抑制率=[1-(實驗組吸光值-空白組吸光值)/(對照組吸光值-空白組吸光值)]×100%[10].依據文獻[11]說明計算半數抑制濃度(IC50).

1.5抑制HepG2和Hep3B增殖的時效及量效研究

將對數生長期的HepG2和Hep3B人肝癌細胞株以每孔5×104的密度接種在96孔板中，24 h后，每孔加入濃度分別為10、30、50、70 μg·mL-1具有最好抗癌活性的藏木香提取物，同時設不加需檢測樣品的實驗對照組和不加需檢測樣品以及細胞的空白對照組，每種濃度一式5孔，繼續(xù)分別培養(yǎng)12 h、24 h和48 h.然后棄掉培養(yǎng)液，每孔加入DMEM配制的5 mg·mL-1MTT溶液100 μL，孵育3～5 h，棄去上清液，加入150 μL DMSO溶解藍紫色甲臜結晶.在562 nm波長下，運用酶標儀測定每孔OD值.生長抑制率= [1-(實驗組吸光值-空白組吸光值)/(對照組吸光值-空白組吸光值)]×100%[10].

1.6倒置相差顯微鏡觀察形態(tài)學變化

取對數生長期的HepG2和Hep3B細胞以4×105的細胞密度分別接種到6孔板中.37 ℃，5%CO2條件下孵育24 h后，每孔加入具有最好抗癌活性的藏木香提取物，濃度分別為 0、10、30、50 μg·mL-1以及濃度為25 μg·mL-1CDDP.繼續(xù)培養(yǎng)一定時間后，使用倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)學變化.

1.7Hoechst 33258染色實驗研究[10]

Hoechst 33258能染色凋亡的細胞核，取對數生長期的HepG2和Hep3B細胞以4×105的細胞密度分別接種到6孔板中.恒溫37 ℃，5% CO2條件下孵育24 h后，吸棄培養(yǎng)液，加入濃度為 0、10、30、50 μg·mL-1的具有最佳抗癌活性的藏木香提取物為給藥組，加入25 μg·mL-1CDDP為陽性藥組[12].繼續(xù)培養(yǎng)一定時間后，棄去培養(yǎng)液，加入固定液(甲醇與冰醋酸比例為3∶1)1 mL.固定液固定細胞30 min后吸棄，并用PBS洗滌3次后風干，每孔加入5 μg·mL-1Hoechst 33258熒光染色液1 mL，避光染色30 min.然后用PBS洗滌兩次后，加入1 mL甘油封片，在熒光顯微鏡下觀察細胞核形態(tài)[12].

1.8Annexin V-FITC /PI雙染測定細胞凋亡

取對數生長期的HepG2和Hep3B細胞以4×105的細胞密度分別接種到6孔板中.37 ℃，5%CO2條件下孵育24 h后，吸棄培養(yǎng)液，加入具有最佳抗癌活性的IR-Pe使其濃度為0、10、30、50 μg·mL-1，每孔2 mL[12].培養(yǎng)24 h后，加入不含EDTA的胰酶消化并收集細胞，預冷的PBS洗滌3次，每次1 000 r·min-1，離心5 min，取出離心管，倒掉上清，每管分別加入100 μL Binding Buffer(1×)液，并輕柔吹打混勻，重懸細胞后，每管分別避光加入Annexin V-FITC 5 μL并混勻，再避光加入PI 5 μL，吹打混勻，室溫下避光孵育15 min后，每管分別加入400 μL Binding Buffer(1×)，混勻，采用流式細胞儀檢測.

1.9Western blot分析

將細胞用預冷的PBS洗三次后每孔加1 mL冰的PBS，并用細胞刮刀刮下置EP管中，1 500 r·min-1，離心10 min，棄上清液，加入適量體積的蛋白裂解液(加入蛋白酶抑制劑)，置冰上裂解5 min后，4 ℃，10 000 r·min-1，離心10 min，上清液轉入1.5 mL EP管中，存放于-20 ℃冰箱中.按照BCA蛋白質定量試劑盒方法測定蛋白含量.樣品與蛋白上樣緩沖液5∶1比例混合，在沸水中變性8 min.配置8%的SDS-PAGE凝膠進行電泳分離蛋白，濕轉法將蛋白質轉移至NC膜上，以含5%脫脂奶粉的TBST溶液室溫封閉2 h，加入相應的蛋白抗體(如caspase-3抗體，按說明書比例稀釋)，4 ℃振蕩器孵育過夜，用TBST洗膜3次后室溫孵育二抗2 h，TBST洗膜三次后進行ECL顯色、通過Bio-RAD凝膠成像儀成像并用Image Lab3.0.1軟件進行光密度值分析.

1.10統(tǒng)計學分析

本研究使用Pearson相關分析法進行分析.多組比較運用單因素方差分析.數據用平均值±標準偏差(mean±SD)表示.*為p≤0.05表示有顯著性差異，**為p≤ 0.01表示具有較大顯著性差異，***為p≤0.001表示具有極大顯著性差異.運用軟件GraphPad Prism 5.0統(tǒng)計分析[12].

2結果

2.1藏木香提取物的抗肝癌活性

用兩種肝癌細胞株HepG2和Hep3B來測試藏木香三種提取物(IR-Pe、IR-Et、IR-Me)的抗肝癌活性，選取人正常肝細胞株L-02作為對照，初步判定對人體正常細胞的毒性.運用MTT法進行檢測，其抗肝癌活性結果見表1.結果表明，藏木香提取物中，藏木香的乙酸乙酯和甲醇提取物均對HepG2和Hep3B細胞未表現(xiàn)出抗腫瘤活性，初篩結果顯示IC50大于100 μg·mL-1.藏木香的IR-Pe對HepG2和Hep3B細胞表現(xiàn)出抗腫瘤活性，并且給藥24 h后IC50值分別為21.9 μg·mL-1和27.6 μg·mL-1，在濃度大于100 μg·mL-1時對正常肝細胞L-02沒有顯示出毒性.對培養(yǎng)的HepG2和Hep3B兩種肝癌細胞株分別給予0、10、30、50 μg·mL-1的藏木香IR-Pe和25 μg·mL-1CDDP，繼續(xù)培養(yǎng)12 h、24 h和48 h后，檢測相關細胞的存活力以及細胞毒性，以百分比表示(圖1).

表1 藏木香三種提取部位對細胞活力的影響(IC50，mean ± SD，n=3)Tab.1 Cell viability and cytotoxicity was determinedusing MTT method /(μg·mL-1)

圖1 藏木香石油醚部位抑制HepG2和Hep3B增殖的時效和量效圖Fig.1 The Petroleum ether fraction of I. racemose time-dependently provoked HepG2 and Hep3B cells apoptosis in vitro

2.2運用倒置相差顯微鏡觀察HepG2和Hep3B細胞株形態(tài)學變化

經IR-Pe給藥24h后，倒置相差顯微鏡下觀察人肝癌細胞HepG2和Hep3B，形態(tài)如下(圖2)：經藏木香石油醚提取物處理后，細胞皺縮變圓，貼壁性降低，有的凋亡細胞出現(xiàn)凋亡小體，大多數凋亡細胞懸浮于培養(yǎng)液中，并且隨著給藥濃度的增大，細胞的狀態(tài)也越來越差，對腫瘤細胞抑制呈現(xiàn)一定的量效關系.對于未經藏木香石油醚提取物處理的HepG2和Hep3B細胞則生長狀態(tài)良好，細胞圓潤飽滿、輪廓清晰，細胞緊密排列、貼壁性好.

圖2 倒置相差顯微鏡觀察給藥后細胞形態(tài)學變化Fig.2 Morphologic changes of HepG2 and Hep3B cells were observed by a phase contrast microscope after IR-Pe treatment

2.3運用熒光顯微鏡觀察Hoechst33258對HepG2和Hep3B細胞染色后的形態(tài)學變化

人肝癌細胞HepG2和Hep3B細胞經IR-Pe給藥處理24 h后，Hoechst 33258熒光染色液染色，在熒光顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，如圖3所示：當IR-Pe作用于HepG2和Hep3B細胞后，細胞核變形皺縮并發(fā)出明顯的藍色熒光，并且隨著給藥劑量的增加，出現(xiàn)典型凋亡細胞核變化的細胞不斷增多，即細胞染色質密集皺縮，并出現(xiàn)高亮的凋亡小體.未經藥處理的HepG2和Hep3B細胞生長狀態(tài)良好，細胞核形態(tài)均一，并且整體細胞呈現(xiàn)較均勻的藍色熒光，無明顯凋亡細胞.

圖3 Hoechst 33258染色觀察細胞形態(tài)學變化Fig.3 Morphologic changes of HepG2 and Hep3B cells by Hoechst 33258 staining after IR-Pe treatment

2.4Annexin V-FITC/PI雙染法檢測IR-Pe誘導HepG2和Hep3B細胞凋亡的情況

采用Annexin V-FITC/PI雙染法進一步對IR-Pe誘導HepG2和Hep3B 細胞的凋亡情況進行驗證.在流式細胞術雙染檢測中，Annexin V與PI不能標記非凋亡細胞，它們出現(xiàn)在散點圖的左下象限Q4；在凋亡細胞中，早期凋亡細胞可以被Annexin V標記，出現(xiàn)在右下象限Q3，晚期凋亡細胞可以被被Annexin V與PI同時標記，出現(xiàn)在右上象限Q2).分析結果如圖4所示，給藥24 h后，隨著IR-Pe濃度的增加，Q2和Q3早、晚期凋亡的細胞數量不斷增加.上面結果表明IR-Pe能以劑量依賴的方式誘導肝癌細胞調亡.

2.5Western blot法分析IR-Pe誘導HepG2和Hep3B細胞凋亡的情況

線粒體通路是是細胞凋亡的主要途徑之一，受到Bcl-2蛋白家族的調控.抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xl可以用來抑制細胞的凋亡[13].Bax蛋白是該家族的促凋亡成員，它的表達增加與靶細胞的凋亡增加聯(lián)系密切[14].caspase家族在細胞凋亡的起始和執(zhí)行中起著重要作用.Bcl-2家族通過調節(jié)線粒體膜的通透性來控制細胞色素c的釋放，從線粒體中被釋放到細胞質里的細胞色素c激活caspase級聯(lián)使下游的caspase-3發(fā)生切割并激活，并最終誘導細胞的凋亡.使用western blot法檢測Bax、Bcl-2和caspase-3的表達.用不同濃度的IR-Pe處理肝癌細胞(圖5)后，Bax和caspase-3的表達上調，Bcl-2的表達下調.利用western blot法分析，IR-Pe降低了Bcl-2與Bax的比例，增加了caspase-3的表達，說明IR-Pe在體外通過線粒體通路顯著誘導肝癌細胞發(fā)生凋亡.

A) Control group；B) IR-Pe 10 μg·mL-1；C)IR-Pe 30 μg·mL-1；D) IR-Pe 50 μg·mL-1；E) CDDP 25 μg·mL-1圖4 IR-Pe對HepG2和Hep3B細胞凋亡的影響Fig.4 Effects of IR-Pe on apoptosis of HepG2 and Hep3B cells

A) Western blot檢測Bax、Bcl-2、切割后的caspase-3在HepG2肝癌細胞中的表達，β-actin為內參；B) Western blot法檢測Bax、Bcl-2、切割后的caspase-3在Hep3B癌細胞中的表達，β-actin為內參A) Expression level of Bax, Bcl-2, cleaved caspase-3 in HepG2 cells by western blot with β-actin as internal reference; B) Expression level of Bax, Bcl-2, cleaved caspase-3 in Hep3B cells by western blot with β-actin as internal reference圖5 IR-Pe通過線粒體凋亡通路誘導凋亡Fig.5 Effects of IR-Pe on the apoptosis regulatory proteins of liver cancer cells

3討論

本研究中，常用藏藥藏木香的三種不同溶劑的提取物(IR-Pe、IR-Et、IR-Me)由快速溶劑萃取法制備，其體外抗肝癌活性研究運用MTT法.結果顯示出藏木香具有一定的抗肝癌活性，其石油醚提取物IR-Pe顯示出較好的活性，其對HepG2和Hep3B細胞的IC50值分別為21.9 μg·mL-1和27.6 μg·mL-1，且對L-02細胞的毒性較小.腫瘤的發(fā)生是基因突變累積導致的生長失控，然而，許多腫瘤仍然保留了啟動細胞凋亡的功能.因此，誘導腫瘤細胞凋亡是控制腫瘤的一種重要手段.進一步研究顯示IR-Pe抑制肝癌細胞HepG2和Hep3B的活性過程顯示出良好的時效、量效關系，倒置相差顯微鏡與熒光倒置顯微鏡可以觀察出肝癌細胞HepG2和Hep3B的形態(tài)變化，如細胞皺縮、核凋亡小體等典型的凋亡特征；并通過流式細胞術雙染法，確認了IR-Pe能誘導 HepG2和Hep3B細胞發(fā)生凋亡且隨著給藥劑量增大，凋亡率也隨之增加；Western blot分析顯示IR-Pe可以激活線粒體凋亡通路而誘導肝癌細胞凋亡.文獻表明，從藥用植物中提取出的萜類成分具有較好的抗肝癌活性[15].綜上所述，藏木香石油醚部位能通過激活線粒體通途誘導細胞凋亡，從而發(fā)揮抗腫瘤的作用.但是，關于藏木香石油醚提取物的抗肝癌有效化學成分，還待進一步的研究.藏木香極具有開發(fā)為腫瘤藥物的價值，繼續(xù)深入研究藏木香石油醚部位是充分利用中藥植物藥用價值手段之一，為資源豐富的民族藥的開發(fā)和利用打下一定的基礎.