李 宇，劉翠君，廖璐婧，郭漢玖，冉亞蘭，劉 丹，羅建群，何美軍*

(1.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院中藥材研究所，湖北 恩施 445000； 2.恩施土家族苗族自治州農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，湖北 恩施 445000；3.湖北民族大學(xué)醫(yī)學(xué)部，湖北 恩施 445000； 4.恩施硒司令生態(tài)農(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限公司，湖北 恩施 445000)

顯齒蛇葡萄Ampelopsisgrossedentata(Hand. -Mazz.) W. T. Wang，俗名藤茶(vine tea)，屬葡萄科(Vitaceae)、蛇葡萄屬(Ampelopsis Michx)植物，廣泛分布于我國中、南部的山區(qū)，其干燥葉和莖經(jīng)加工后是常見的藥食兩用飲品[1].研究發(fā)現(xiàn)顯齒蛇葡萄粗提取物具有抗氧化、消炎、保護(hù)肝臟、抗腫瘤、抗酪氨酸酶、抗糖尿病、降血脂等多種生理功效.顯齒蛇葡萄粗提取物能顯著清除1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基，能顯著抑制肉制品的硫代巴比妥酸值(thiobarbituric acid reactive substances，TBARS)的升高和羰基化合物的形成，延長肉制品的保質(zhì)期[2].代謝組表明顯齒蛇葡萄通過參與調(diào)節(jié)葡萄糖代謝(包括糖異生和糖酵解)，嘌呤代謝和氨基酸代謝等相關(guān)途徑，降低小鼠模型的血清葡萄糖和總膽固醇水平[3].有文獻(xiàn)報(bào)道顯齒蛇葡萄總黃酮提取物能明顯抑制體外培養(yǎng)的胃癌細(xì)胞SGC-7901生長[4].顯齒蛇葡萄粗提取物的單寧餾分組分(主要成分gallotannins) 具有抗氧化活性(清除1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基)和葡萄糖苷酶抑制活性[5].顯齒蛇葡萄總黃酮對原發(fā)性高血壓大鼠有明顯的降血壓效果，其潛在的機(jī)理是參與調(diào)節(jié)醛固酮系統(tǒng)與抗氧化系統(tǒng)有關(guān)，而且對正常大鼠的血壓沒有影響[6].從葉和莖中分離到的與酸性蛋白結(jié)合的雜多糖具有較強(qiáng)的抗氧化活性和葡萄糖苷酶抑制活性[7].顯齒蛇葡萄提取物能改善患血吸蟲病小鼠的肝臟纖維化病理狀況，對患血吸蟲病肝纖維化有明顯治療作用[8].顯齒蛇葡萄的莖葉提取物對D-半乳糖胺導(dǎo)致的大鼠肝損傷具有保護(hù)作用[9].

研究發(fā)現(xiàn)顯齒蛇葡萄黃酮總含量≥40%，通過高效液相色譜法(high performance liquid chromatography)、質(zhì)譜(mass spectrum)和核磁共振(nuclear magnetic resonance)分析鑒定技術(shù)發(fā)現(xiàn)顯齒蛇葡萄中二氫楊梅素(dihydromyricetin)含量高達(dá)37%[10].二氫楊梅素被證明有多種生理功能：能通過線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑誘導(dǎo)人絨毛膜癌細(xì)胞(choriocarcinoma cell line JAR)凋亡[11]；能有效減弱增生性瘢痕(Hypertrophic scar，HPS)的形成[12]；能顯著減輕深度睡眠(deep sleep)導(dǎo)致的空間學(xué)習(xí)和記憶障礙[13].有文獻(xiàn)報(bào)道從顯齒蛇葡萄粗提取物中分離鑒定了5個(gè)黃酮苷類化合物：6，7-二羥基-30-甲氧基-40，50-亞甲二氧基異黃酮6-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、6，7-二羥基-30-甲氧基-40，50-亞甲二氧基異黃酮 6-O-α-L-吡喃鼠李糖苷、6，7-二羥基-30-甲氧基-40，50-亞甲二氧基異黃酮 6-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、5，7-二羥基-3′，4′-三羥基黃酮-3-O-6″-鼠李糖、5，7-二羥基-3′，4′-二羥基黃酮-3-O-6″-鼠李糖[14-15].

顯齒蛇葡萄具有多種生理活性，但是關(guān)于顯齒蛇葡萄總黃酮的組分、各組分含量、黃酮類化合物的生物合成途徑、及二氫楊梅素積累機(jī)制等科學(xué)問題，暫無文獻(xiàn)報(bào)道.本論文對顯齒蛇葡萄總黃酮組分和抑菌活性進(jìn)行了全面分析，可為顯齒蛇葡萄在保健食品領(lǐng)域，及食品保鮮領(lǐng)域的充分開發(fā)與利用提供理論依據(jù).

1材料與方法

1.1儀器與材料

Bruker maXis高分辨飛行時(shí)間質(zhì)譜儀，Agilent 1260高效液相色譜儀(配DAD檢測器)，Phenomenex 色譜柱(50 mm × 4.6 mm，ODS 5 μm)，imark酶標(biāo)儀(Bio-Rad美國伯樂)，Agilent Poroshell 反相色譜柱 120 EC-C18(4.6×150 mm，4 μm)，RE-200A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(廣州市星爍儀器有限公司)，Thermo Fisher世爾電導(dǎo)儀(型號(hào)：3-star)，HS-GF254硅膠薄層板；J&K色譜純乙腈，黃酮化合物標(biāo)準(zhǔn)品二氫楊梅素、三葉豆苷、山柰酚、楊梅苷(myricitrin)、楊梅素(myricetin)、花旗松素(taxifolin)、槲皮素(quercetin)均購自于阿拉丁試劑公司，其它試劑均為國產(chǎn)分析純.所有供試菌都是中國科學(xué)院南海海洋研究所中國科學(xué)院熱帶海洋生物資源與生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室鑒定.顯齒蛇葡萄樣品是從湖北省利川市齊岳山(海拔1 000 m～1 200 m)采集，湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院中藥材研究所高級(jí)農(nóng)藝師由金文鑒定.

LB培養(yǎng)基配制：酵母提取物5 g·L-1，胰蛋白胨10 g·L-1，NaCl 10 g·L-1，pH 7.2～7.4，121 ℃滅菌30 min(固體LB培養(yǎng)基加入瓊脂20 g·L-1).

MH液體培養(yǎng)基配制：牛肉粉2 g·L-1，可溶性淀粉1.5 g·L-1，酸水解酪蛋白 17.5 g·L-1，pH 7.2～7.6，121 ℃滅菌30 min.

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1顯齒蛇葡萄嫩葉總黃酮提取 干重為5 g的顯齒蛇葡萄嫩葉磨成粉，按料液比1∶50，用250 mL乙醇溶液(60%)浸泡18 h，200 W超聲提取30 min.10 000 r· min-1離心獲得上清液，上清液減壓旋蒸，得到浸膏.

1.2.2顯齒蛇葡萄嫩葉總黃酮組分鑒定 顯齒蛇葡萄嫩葉總黃酮提取上清液樣品稀釋10倍備用，高效液相色譜(HPLC)進(jìn)樣條件：時(shí)間0 min～20 min，B相95%～20%，時(shí)間20 min～25 min，B相20%～0%，時(shí)間25 min ～27 min，B相0%～0%，時(shí)間27.1 min～30 min，B相95%～95%.A相：95%H2O、5%甲醇、0.1%乙酸，B相：100%甲醇、0.1%乙酸.MS分析條件：質(zhì)譜儀器micrOTOF (Q)，離子化模式positive，離子源電壓4 500 V，End Plate Offset -500 V，Dry Heater 180 ℃，Corrector Fill 70 V，Dry Gas 5.0 I·min-1，Reflector 2 107.7 V，F(xiàn)light Tube 10 000.0 V，Detector TOF 3 250.0 V，Corrector Extract 429.5 V，一級(jí)質(zhì)譜掃描范圍：100～2 000 m·z-1.運(yùn)用Bruker compass DataAnalysis 4.0數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析處理，并在中藥成分高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫Orbitrap Traditional Chinese Medicine Library (OTCML)檢索分析[16].

1.2.3顯齒蛇葡萄嫩葉各黃酮組分含量測定 利用HPLC外標(biāo)法[17]測定顯齒蛇葡萄嫩葉各黃酮組分含量，將7個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品二氫楊梅素、楊梅苷、楊梅素、花旗松素、槲皮素配制成6個(gè)濃度梯度(10.0 μg·mL-1、20.0 μg·mL-1、40.0 μg·mL-1、80.0 μg·mL-1、160.0 μg·mL-1、320.0 μg·mL-1)的混標(biāo)，運(yùn)用1.2.2的HPLC進(jìn)樣條件測量.測定儀器信噪比(S/N) ，當(dāng)各標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋至信噪比3

其中，C為顯齒蛇葡萄樣品中黃酮組分含量，n為HPLC檢測濃度，m為顯齒蛇葡萄樣品干重

1.2.4顯齒蛇葡萄嫩葉總黃酮抗菌活性測試 采用濾紙片法[18]測試顯齒蛇葡萄嫩葉總黃酮物對10株供試菌的抑菌活性，取20 μL培養(yǎng)至A600為0.6的測試菌菌液與20 mL LB固體培養(yǎng)基混合均勻倒平板.取15 μL顯齒蛇葡萄嫩葉總黃酮(二甲基亞砜DMSO溶解)，分三次滴加于濾紙片(直徑為6 mm)上，將濾紙片置于混有菌液的培養(yǎng)基上，另設(shè)氨芐青霉素(100 mg·mL-1)作陽性對照、添加DMSO作陰性對照，37 ℃培養(yǎng)12 h，測抑菌圈.參照抗生素藥敏標(biāo)準(zhǔn)：高敏(抑菌圈直徑>20 mm)、中敏(10～20 mm)、輕敏或耐藥(<10 mm).采用微量肉湯稀釋法測定顯齒蛇葡萄嫩葉總黃酮對供試菌的MIC值，按美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)M07-A9的標(biāo)準(zhǔn)操作程序：在96孔板上3～12列的每孔加入含總黃酮樣品的MH液體培養(yǎng)基100 μL，設(shè)置顯齒蛇葡萄總黃酮終濃度分別為128.0，64.0，32.0，16.0，8.0，4.0，2.0，1.0，0.5和0.25 mg·mL-1(3～12列).將培養(yǎng)好的菌液稀釋1 000倍，每孔加入稀釋菌液100 μL，設(shè)氨芐青霉素(100 μg·mL-1)作陽性對照，第1列為空白培養(yǎng)基對照，第2列為菌液生長空白對照(加DMSO)，第3～12列為樣品測試列.37 °C培養(yǎng)16 h后使用imark酶標(biāo)儀檢測A600，根據(jù)CLSI M100-S26標(biāo)準(zhǔn)：與陽性生長對照管比較抑制80%細(xì)菌生長的藥物濃度為受試菌的MIC值[19-20].

1.2.5數(shù)據(jù)處理 所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)運(yùn)用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示.P<0.05，表明具有顯著性差異，P<0.01，表明具有極顯著性差異.

2試驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1顯齒蛇葡萄嫩葉總黃酮獲得

共獲得250 mL總黃酮提取液，取10 mL加甲醇稀釋10倍，用于顯齒蛇葡萄嫩葉總黃酮組分鑒定和含量檢測.240 mL總黃酮提取液減壓旋蒸共獲得提取浸膏2.026 g，加入4 052 μL DMSO溶解，獲得濃度為0.5 g·mL-1的總黃酮溶液備用.

2.2顯齒蛇葡萄嫩葉總黃酮組分鑒定

運(yùn)用Bruker Compass DataAnalysis 4.0數(shù)據(jù)分析軟件，依據(jù)黃酮類化合物的UV吸收特征(紫外吸收區(qū)域內(nèi)存在2個(gè)主要的峰帶Ⅰ和峰帶Ⅱ)，共從顯齒蛇葡萄嫩葉總黃酮組分中鑒定出21個(gè)類似黃酮類化合物離子峰，進(jìn)一步在中藥成分高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫 (OTCML)檢索計(jì)算，共從顯齒蛇葡萄嫩葉總黃酮中鑒定出7個(gè)黃酮類化合物(如表1).

表1 顯齒蛇葡萄嫩葉總黃酮組分鑒定Tab. 1 Identification of the total flavonoids in the tender leaves of vine tea

注 1)a：mSigma同位素匹配度；

2)b：設(shè)定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)差≤10 ppm(單位ppm)

運(yùn)用1.2.2的HPLC進(jìn)樣條件，HPLC外標(biāo)法測量7個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線、重復(fù)性、檢出限定量線如表2所示，線性相關(guān)性好(R2≥0.9990).每個(gè)混標(biāo)重復(fù)測試6次，測得相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(S)范圍為0.654 μg·mL-1～0.982 μg·mL-1.

通過配制本底含量標(biāo)準(zhǔn)品濃度溶液，加入定濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，HPLC檢測，獲得標(biāo)準(zhǔn)品的加標(biāo)回收率為98.58%～102.01%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.06%～3.01%，如表3.

表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線、重復(fù)性及檢測限Tab.2 Regression equation，correlation coefficient and detection limit

注:A為峰面積，單位mAU;y為濃度，單位μg·mL-1.

表3 標(biāo)準(zhǔn)品的回收率(means±SD，n=6)Tab.3 Recovery rate of standard substance

利用HPLC外標(biāo)法檢測顯齒蛇葡萄嫩葉總黃酮各組分的含量：二氫楊梅素(18.57%)、楊梅苷(0.53%)、楊梅素(1.29%)、花旗松素(1.38%)、槲皮素(0.51%)、三葉豆苷(0.78%)、山柰酚(0.45%)，加標(biāo)回收率為97.55%～102.51%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.7%～5.80%(如表4).

2.3顯齒蛇葡萄嫩葉總黃酮抗菌活性

利川顯齒蛇葡萄嫩葉總黃酮對蘇云金芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)、溶藻弧菌4株供試菌有中度敏感抑制活性(抑菌圈為11～15 mm)，其MIC值為1.0 mg·mL-1、2.0 mg·mL-1、2.0 mg·mL-1、1.0 mg·mL-1.對肺炎克雷伯菌、金黃色葡萄球菌2株供試菌有輕度敏感抑制活性(抑菌圈<11 mm)，其MIC值為4.0 mg·mL-1、8.0 mg·mL-1.顯齒蛇葡萄是重要的藥食同源飲品，其對6株供試菌的抑菌活性功能為開發(fā)顯齒蛇葡萄功能性飲品提供了重要參考.

表4 顯齒蛇葡萄嫩葉總黃酮各組分含量表( means±SD，n=6)Tab.4 contents of flavones of the totalflavonoids in the tender leaves of vine tea

表5 顯齒蛇葡萄嫩葉總黃酮的抗菌活性( means±SD，n=3)Tab.5 Antibacterial activity of the total flavonoids in the tender leaves of vine tea

續(xù)表5

3結(jié) 論

通過質(zhì)譜數(shù)據(jù)和紫外吸收光譜，從利川顯齒蛇葡萄嫩葉總黃酮中鑒出7個(gè)黃酮類組分：二氫楊梅素、楊梅苷、楊梅素、花旗松素、槲皮素、山柰酚、三葉豆苷.利川顯齒蛇葡萄嫩葉總黃酮對蘇云金芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、溶藻弧菌有中度敏感抑制活性，推測其良好抑菌活性、廣譜性與各活性黃酮組分的種類、含量密切相關(guān)，是多種活性黃酮組分共同作用的結(jié)果.已有研究數(shù)據(jù)表明在顯齒蛇葡萄總黃酮組分中：二氫楊梅素對金黃色葡萄球菌、多耐銅綠假單胞菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌有抑菌作用；楊梅素對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌有抑菌作用；花旗松素對MRSA有抑菌作用；山柰酚對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌有抑菌作用；楊梅苷對MRSA有抑菌作用[21].富含多種黃酮活性組分的顯齒蛇葡萄總黃酮提取物，具有良好抑菌活性，在植物源綠色抑菌制劑開發(fā)領(lǐng)域具有良好的市場前景.