王鋒尖，周向宇，劉 杰，常 堃，饒咬成

(1.漢江師范學(xué)院化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，湖北 十堰 442000； 2.十堰市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所，湖北 十堰 442000；3.江漢大學(xué)湖北省漢江流域特色生物資源保護(hù)開發(fā)與利用工程技術(shù)研究中心，武漢 430056；4.漢江師范學(xué)院生態(tài)文明研究中心，湖北 十堰 442000)

粉褶菌屬Entoloma物種分布廣泛，種類繁多，現(xiàn)已知全球有1 000多個物種[1].粉褶菌屬子實(shí)體的形態(tài)多樣[2-3]，一般呈傘菌狀(臍菇狀、金錢菌狀、小菇狀、口蘑狀、側(cè)耳或靴耳狀)[3-5]，菌褶粉紅色，擔(dān)孢子多邊形[2]；然而，近年來在日本[6]、西班牙[7]等地發(fā)現(xiàn)有呈塊狀無菌褶且生于地下的腹菌化粉褶菌.2016年7月，于湖北省十堰市張灣區(qū)采集到1份腹菌狀的粉褶菌屬標(biāo)本，經(jīng)顯微觀察、分子系統(tǒng)發(fā)育分析，發(fā)現(xiàn)其為粉褶菌屬Entoloma的棱柱孢粉褶菌EntolomaprismaticumHir. Sasaki，A. Kinosh. & K. Nara，該物種此前在中國未見報道.

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

標(biāo)本采集于湖北省十堰市張灣區(qū)百龍?zhí)堵糜螀^(qū)，采集樣地為闊葉林，土壤類型為黃棕壤.張灣區(qū)地處秦嶺、大巴山和武當(dāng)山之間，屬秦嶺、大巴山東延余脈，地理坐標(biāo)范圍為32°23′～32°47′ N，110°26′～110°57′ E，屬北亞熱帶大陸性季風(fēng)氣候區(qū)，光、熱、水條件較為適宜，年均日照時數(shù)1 889.3 h，年均氣溫15.3 ℃，年均無霜期246 d，年均降雨量1 000.8 mm，境內(nèi)動植物資源豐富，其中植物資源有113科828種[8].

發(fā)現(xiàn)子實(shí)體后，首先對其進(jìn)行實(shí)地拍照；其次觀察外部形態(tài)特征，測量外觀尺寸并及時記錄相關(guān)數(shù)據(jù)；然后采集完整的子實(shí)體，并切取一小塊干凈的組織用硅膠保存制成分子材料，分別編號后帶回室內(nèi)處理；完整的子實(shí)體在40 ℃左右的溫度下烘干后經(jīng)低溫冷凍處理制成憑證標(biāo)本(HMHNU1522)用于保藏，并用作形態(tài)學(xué)鑒定的材料；經(jīng)硅膠保存的分子材料帶回實(shí)驗(yàn)室后存放于-20 ℃以下的低溫中或及時用于分子系統(tǒng)學(xué)研究.憑證標(biāo)本(HMHNU1522)存放于漢江師范學(xué)院真菌標(biāo)本室.

用于分子系統(tǒng)學(xué)分析的粉褶菌屬物種序列來源于GenBank數(shù)據(jù)庫，詳情見表1.

1.2形態(tài)學(xué)鑒定

依據(jù)新鮮標(biāo)本的野外觀察記錄對宏觀形態(tài)特征進(jìn)行描述[9].依據(jù)干燥標(biāo)本的顯微觀察結(jié)果對微觀結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行描述.使用5%KOH(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純)對干燥標(biāo)本進(jìn)行顯微制片，以3個子實(shí)體為依據(jù)，每個子實(shí)體至少隨機(jī)觀測20個成熟孢子的顏色、形狀及大小，孢子大小的測量參照王鋒尖等[10]的方法.

表1 系統(tǒng)樹構(gòu)建所用標(biāo)本信息及GenBank登錄號Tab.1 Specimens information used for phylogenetic tree construction and their GenBank accession numbers

1.3分子系統(tǒng)學(xué)研究

采用植物基因組提取試劑盒(天根生化科技有限公司，北京)對樣本的基因組DNA進(jìn)行抽提；參照王鋒尖等[11]的反應(yīng)體系及程序，采用真菌通用引物ITS1、ITS4對基因組DNA進(jìn)行PCR反應(yīng)擴(kuò)增特征片段，PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送測序公司(生工生物工程(上海)有限公司)測序.對獲得的ITS序列仔細(xì)核對后提交GenBank數(shù)據(jù)庫，并進(jìn)行BLAST比對.從比對結(jié)果中選擇同源性較高的序列，采用MEGA6.06軟件構(gòu)建序列矩陣，采用最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(Entolomaversatile作外類群)，Bootstrap共1 000次.

2結(jié)果與分析

2.1形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果

EntolomaprismaticumHir. Sasaki，A. Kinosh. & K. Nara，F(xiàn)ungal Biology 116(12): 1253 (2012)

圖1 棱柱孢粉褶菌的子實(shí)體Fig.1 Fruiting body of Entoloma prismaticum

圖2 棱柱孢粉褶菌的微觀特征Fig.2 Microscopic features of Entoloma prismaticum

模式產(chǎn)地：日本[6].

生境：散生，于闊葉林中半地下生.

標(biāo)本信息：湖北省十堰市張灣區(qū)百龍?zhí)堵糜螀^(qū)(HMHNU1522)，32.590583°N，110.696833°E，海拔476 m，采集人：王鋒尖和周向宇，采集時間：2016年07月22日.

2.2分子系統(tǒng)發(fā)育分析

BLAST比對顯示，研究標(biāo)本HMHNU1522的ITS序列(GenBank登錄號為MN749380)與學(xué)名為Entolomaprismaticum的序列(GenBank登錄號：NR_119415、AB691998、AB691999、AB692000)同源性均為99.84%.以E.versatile為外類群，將HMHNU1522ITS序列和其他粉褶菌屬物種的ITS序列(見表1)構(gòu)建序列矩陣，進(jìn)行分子系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果如圖3所示，HMHNU1522與E.prismaticum(GenBank登錄號：NR_119415、AB691998、AB691999、AB692000)聚為一類，支持率達(dá)100%.

圖3 利用ML法基于ITS序列推斷HMHNU1522的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系(以Entoloma versatile為外類群)Fig.3 Phylogenetic relationships of HMHNU1522 and other taxa of Entoloma inferred from ITS data using ML method (the tree is rooted with Entoloma versatile)

3結(jié)論與討論

綜合考慮形態(tài)學(xué)鑒定與系統(tǒng)樹構(gòu)建結(jié)果，最終確定研究標(biāo)本HMHNU1522為Entolomaprismaticum，根據(jù)Kinoshita等[6]在發(fā)表新種時的詞源釋義“prismaticum(prism-like)，referring to the prismatoid basidiospores”，可將其中文名翻譯為棱柱孢粉褶菌.

棱柱孢粉褶菌的區(qū)別于其他同屬物種的主要特征為：子實(shí)體半地下生，腹菌化，棱柱形孢子，孢子小尖位于以五角面為中心的頂端[12].和Entolomaprismaticum一樣，Entolomaasterosporum、Entolomahypogaeum等也為生于地下的腹菌化子實(shí)體[6]，但Entolomaasterosporum的包被先是白色，后來變成紅褐色，孢子為十字形；Entolomahypogaeum的包被純白色，孢子5～6角，異徑.

真菌為適應(yīng)環(huán)境選擇壓力(如傳播媒介、干旱等)而多次發(fā)生腹菌化的現(xiàn)象，已被眾多的研究所證實(shí)[13-20].按照Lebel & Catcheside、Justo等[21-22]的觀點(diǎn)，在粉褶菌這樣的非腹菌支系中，出現(xiàn)個別腹菌，表明是近期發(fā)生的腹菌化事件.近年來，發(fā)現(xiàn)了較多的近期腹菌化的蕈菌，如Entoloma[6-7]、Cortinarius[18]、Guyanagaster[20]、Amanita[22]、Chlorophyllum[23]、Spongiforma[24]、Mackintoshia[25]等.無親緣或親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的類群趨同演化產(chǎn)生相似的結(jié)構(gòu)，趨同演化在大型真菌物種進(jìn)化中的重要意義毋庸置疑.傳統(tǒng)分類學(xué)以形態(tài)特征為基礎(chǔ)，而形態(tài)上的趨同演化易導(dǎo)致誤判的出現(xiàn)，因此需要采取分子系統(tǒng)學(xué)與分子遺傳學(xué)相關(guān)研究手段，為親緣關(guān)系的確立提供更為可靠的依據(jù)[26].