王 丹，趙康云，薛虎貴，賀倩鈺，馬 超，徐 斌，李 妍*

（1.吉林醫(yī)藥學院 公共衛(wèi)生學院，吉林 吉林 132013；2.吉林醫(yī)藥學院 基礎(chǔ)醫(yī)學院，吉林 吉林 132013）

啤酒糟是啤酒釀造中麥芽糖轉(zhuǎn)化的主要副產(chǎn)物，主要為麥芽皮殼類物質(zhì)，約占總副產(chǎn)物的85%[1]。有研究表明，在干燥的啤酒糟中含纖維55%～61%、蛋白質(zhì)24%～28%、脂肪8%～11%、糖1%～3%以及3%～5%的灰分[2]。我國是世界上最大的啤酒生產(chǎn)國，盡管2018年產(chǎn)量下降2.2%，年產(chǎn)量達到3 900萬kL。啤酒糟約占啤酒產(chǎn)量的25%，僅一年我國啤酒糟的產(chǎn)量就將近1 000萬t，由于不宜貯存，極易腐敗，造成資源浪費且污染環(huán)境。

目前，國內(nèi)外研究將啤酒糟主要應用于動物飼料[3-6]、農(nóng)業(yè)[7-8]、能源[9-10]、生活性物質(zhì)[11-12]等方面。在食品方面也有開發(fā)利用，劉軍[13]將啤酒糟作為輔料制作醬油，質(zhì)量與傳統(tǒng)工藝相當，李爽等[14]利用啤酒糟餅干配方進行了研究，郭萌萌等[15]利用啤酒糟和玉米混合制作膨化食品，F(xiàn)ERREIRA A M等[16]利用啤酒糟制作餐具，王然[17]在牛乳中加入啤酒糟進行酸奶的研制。蘋果醋是經(jīng)發(fā)酵而得到的一種飲料，以新鮮蘋果為原料先發(fā)酵得到果酒，然后接入醋酸菌發(fā)酵得到果醋，LIU G P等[18]對蘋果醋醋酸發(fā)酵工藝進行了優(yōu)化，李曦等[19]分析了蘋果醋飲料中的有機酸。啤酒糟中的營養(yǎng)成分和谷物的相近，將其作為原料用于發(fā)酵果醋，不僅能充分利用啤酒糟的剩余價值，還能賦予果醋獨特的風味，張霽紅等[20]研究了我國蘋果醋產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀、存在的問題和發(fā)展趨勢，在國外有關(guān)果醋調(diào)味品、果醋保健品的產(chǎn)品比較多，美國H.J.Heinz公司生產(chǎn)的蘋果醋遠銷全球，意大利VARVALLO生產(chǎn)的系列果醋在歐洲市場有很大的影響力[21]。

本研究通過頂空固相微萃取（headspace solid-phase microextraction，HS-SPME）結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）法分析實驗室自制啤酒糟蘋果醋發(fā)酵的三個不同階段（啤酒糟蘋果汁、啤酒糟蘋果酒、啤酒糟蘋果醋）香氣成分，探究啤酒糟蘋果醋不同發(fā)酵階段揮發(fā)性香氣成分及抗氧化性變化，對今后啤酒糟果醋及相關(guān)產(chǎn)品開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

啤酒糟蘋果醋：實驗室自制；氯化鈉（分析純）：天津市致遠化學試劑有限公司；C8～C40正構(gòu)烷烴、2-辛醇（純度≥97.0%）、1,1-二苯基-2-苦肼基（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：上海源葉生物技術(shù)有限公司。其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DK-98-II型恒溫水浴鍋：天津市泰斯特儀器公司；C-MAG HS7型加熱磁力攪拌器：艾卡（廣州）儀器設(shè)備有限公司；20 mL頂空瓶、Agilent 7890/5977氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀、HP-5ms色譜柱（30 m×250 μm×0.25 μm）：美國Agilent公司；SPME進樣手柄、100 μm聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）萃取纖維頭：美國Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 啤酒糟蘋果醋的加工工藝流程及操作要點

挑選新鮮蘋果→清洗→切塊去核→壓榨→調(diào)節(jié)酸糖含量→加啤酒糟→殺菌→酒精發(fā)酵→醋酸發(fā)酵→離心→裝瓶→殺菌→冷藏

原料前處理：將蘋果去核切碎加水1∶1榨汁，新鮮啤酒糟在80 ℃烘箱中烘烤5 h，粉碎后用100目篩子過篩。

酒精發(fā)酵：酵母菌接種量為0.6%，發(fā)酵溫度為28 ℃。

醋酸發(fā)酵：醋酸菌接種量為1.0%，發(fā)酵溫度為32 ℃，搖床轉(zhuǎn)速為120 r/min。

離心：果酒和果醋發(fā)酵完成后裝瓶前均需在3 000 r/min離心5 min，將上清液裝瓶。

1.3.2 揮發(fā)性香氣成分測定[22-23]

（1）樣品處理

取5 mL啤酒糟蘋果汁、果酒、果醋樣液裝入20 mL頂空瓶中，加入1.5 g NaCl，放入磁力攪拌器轉(zhuǎn)子，加蓋密封墊。每次萃取前40 ℃水浴平衡15 min，使得被分析物質(zhì)與頂空瓶達到平衡狀態(tài)。將進樣手柄先在250 ℃老化5 min后插入頂空瓶，推出纖維頭，調(diào)整插入深度，40 ℃水浴吸附30 min，GC進樣口解吸5 min，每組實驗至少重復3次。

（2）GC-MS參數(shù)及分析條件

GC條件：進樣口溫度250 ℃；載氣為氦氣（He），流速為1 mL/min，采用不分流進樣；毛細管色譜柱為Agilent HP-5ms（30 m×250 μm×0.25 μm）；程序升溫條件為初始溫度40 ℃保持12 min，以3 ℃/min升至108 ℃保持2 min，再以5 ℃/min升至250 ℃保持5 min。MS條件：離子源溫度為230 ℃，四級桿溫度為150 ℃，電子電離（electronic ionization，EI）源，電子能量70 eV，掃描范圍45～550 amu。

（3）香氣成分定性、定量分析

總離子流色譜圖（total ion chromatogram，TIC）積分后對照美國國家標準技術(shù)研究所（national institute of standards and technology，NIST）14.L譜庫檢索化合物（匹配度＞80），并參考文獻、資料進行鑒定。以2-辛醇（純度≥97.0%）為內(nèi)標對香氣成分計算各化合物的相對含量。

1.3.3 體外抗氧化活性評價

（1）樣品處理

取不同的啤酒糟蘋果汁、蘋果酒、蘋果醋上清液為試驗樣液，測定抗氧化活性。

（2）清除DPPH自由基的能力[24-25]

分別取0.1 g/100 mL的VC標準溶液1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL、6 mL、7 mL定容于50 mL容量瓶中，配制成系列濃度梯度。準確量取DPPH溶液4.85 mL（DPPH的配制：精確稱取0.025 g DPPH加無水乙醇于100 mL棕色容量瓶避光保存，臨用時稀釋10倍）于10 mL離心管中，分別添加150 μL不同濃度的VC標準溶液，室溫避光靜置30 min，在波長517 nm處測量吸光度值，同時用無水乙醇做空白對照。樣品稀釋成不同體積分數(shù)（10%、20%、30%、40%、50%）的溶液混勻，黑暗中放置30 min，取上清液，在波長517 nm處測吸光度值。DPPH自由基清除率計算公式如下：

式中：A0是空白對照組的吸光度值，A1是系列梯度濃度VC標準溶液吸光度值。

（3）還原Fe3+能力的測定[26]

取1 mL系列濃度VC標準溶液，加入2.5 mL磷酸鹽緩沖液（0.2 mol/L，pH 6.6）中混勻，再加入鐵氰化鉀（1%）2.5 mL混勻，50 ℃恒溫水浴反應20 min后，加1 mL三氯乙酸（10%）混勻；取2.5 mL混合溶液，加水2.5 mL稀釋，再加入氯化鐵（0.1%）0.5 mL避光反應10 min后，樣品稀釋成不同體積分數(shù)（5%、10%、15%、20%、25%）的溶液混勻，避光反應10 min后，在波長700 nm處測量吸光度值，樣品中的還原性物質(zhì)可將Fe3+還原為Fe2+，該物質(zhì)在波長700 nm處有特征吸收峰，吸光度值的大小可以反映抗氧化性的強弱，吸光度值越大，則表示樣品的還原能力越強，抗氧化性越高。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2016、Orgin 7.5軟件分析數(shù)據(jù)及作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 啤酒糟蘋果醋不同階段揮發(fā)性物質(zhì)的色譜圖及定性分析

運用HS-SPME-GC-MS技術(shù)對啤酒糟蘋果醋發(fā)酵過程中的揮發(fā)成分進行分析，其總離子流色譜圖（total ion chromatogram，TIC）見圖1，發(fā)酵過程中的揮發(fā)性成分及相對含量見表1。

圖1 啤酒糟蘋果汁（A）、蘋果酒（B）及蘋果醋（C）中揮發(fā)性成分GC-MS分析總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram of volatile components in apple juice (A),apple cider (B) and cider vinegar (C) with brewer's grains analysis by GC-MS

表1 啤酒糟蘋果醋不同發(fā)酵階段揮發(fā)性香氣成分GC-MS分析結(jié)果Table 1 Results of volatile components in brewer's grains cider vinegar at different fermentation stages analysis by GC-MS

續(xù)表

由圖1及表1可知，啤酒糟蘋果醋發(fā)酵過程中共鑒定出50種揮發(fā)性香氣成分，其中包括酯類16種、醇類8種、醛類8種、酸類7種、酚類4種、其他4種、酮類2種、醚類1種。果汁中檢測出12種揮發(fā)性物質(zhì)，主要包括2-己烯醛、DL-薄荷醇、乙酸己酯、2-甲基丁基乙酸酯、6-甲基-5-庚烯-2-醇，相對含量最高的是2-己烯醛（12.36%），其中2-己烯醛、DL-薄荷醇、乙酸己酯只在果汁中檢測到，可作為它的特征化合物。果酒中檢測出15種揮發(fā)性物質(zhì)，主要包括苯乙醇、異戊醇、5-甲基呋喃醛、2-甲基丁酸、2-乙?；秽?，相對含量最高的是苯乙醇（24.64%），是果酒的主要呈香物質(zhì)。果醋中檢測出24種揮發(fā)性物質(zhì)，主要包括糠醛、辛酸、正己酸、苯乙醇、乙酸異戊酯、2-甲基丁醇、丁酸、庚酸，相對含量最高的是糠醛（10.19%），可用來評價果醋發(fā)酵時間，丁酸、庚酸、4-乙基苯酚并未在果汁和果酒中檢測到，可作為果醋的特征物質(zhì)。

醇類在果醋中含量相對較高，包括異戊醇、2-甲基丁醇、2,3-丁二醇、正己醇、6-甲基-5-庚烯-2-醇、2-乙基己醇、苯乙醇，且檢測到的大部分是碳原子數(shù)＞6的高級醇。其中一部分是在果酒發(fā)酵過程中酵母菌在磷酸-戊糖途徑產(chǎn)生的，另一部分是發(fā)酵中氨基酸在轉(zhuǎn)氨酶作用下生成酮酸，經(jīng)一系列轉(zhuǎn)化生成的高級醇[27]，作為發(fā)酵過程中的底物，苯乙醇含量最高是24.64%，到最后發(fā)酵成果醋含量下降至8.14%。苯乙醇有一定的殺菌作用，香味獨特，具有玫瑰香、紫羅蘭香、茉莉花香等，給人帶來愉悅的感覺[28]。

酯類是乙酰輔酶A與氨基酸或碳水化合物降解生成的高級醇的反應產(chǎn)物[29]，主要包括乙酸酯類、乙酯類、丁酯類和其他酯類，是果醋的特征香氣成分。其中乙酸異戊酯在果醋里的最終含量為7.21%，它也是啤酒中的香味物質(zhì)，出現(xiàn)在啤酒糟果醋中，對果醋增添別樣的香氣。在發(fā)酵后期，2-甲基丁基乙酸酯、2-甲基丁酸丁酯、己酸丁酯、異戊酸己酯等未檢出，可能是由于在發(fā)酵過程中因揮發(fā)含量太低未能檢出，這與鄧娜娜等[30]在桑椹果醋、張強等[31]在紅樹莓果醋未檢測出己酸丁酯一致。

酸類是果醋的主要呈味物質(zhì)，對果醋的風味有直接影響，其中辛酸和癸酸在果醋中增添水果香味和花香，低濃度的酸類可為果醋賦予清淡的香味，但過量又會表現(xiàn)出腐敗的酸臭味[32]，對果醋的品質(zhì)產(chǎn)生消極的影響，發(fā)酵結(jié)束后辛酸和癸酸的含量分別下降至8.92%和5.24%，使得果醋香氣清淡，符合果醋的特征。

此外，還檢測到8種醛類，在啤酒糟蘋果汁階段獨有的是2-己烯醛，有濃郁的新鮮水果和綠葉清香氣味[26]，在果酒和果醋階段未檢測到，可能是在發(fā)酵過程轉(zhuǎn)化成其他物質(zhì)。果酒和果醋階段含量較高的有糠醛和苯甲醛，糠醛的含量從果酒階段的2.4%，上升到果醋階段的的10.19%，CAMARAJ S等[33]在研究Madeira葡萄酒過程中發(fā)現(xiàn)糠醛濃度和酒的釀造時間有良好的相關(guān)性，認為糠醛可以作為酒的陳釀時間指示劑。苯甲醛可能來自果酒階段醇的進一步氧化，最終果醋中苯甲醛的含量為2.23%，雖然相對含量少，但對啤酒糟果醋的風味形成仍有一定的影響。

除醇類、酯類、酸類、醛類這些主要化合物外，還檢測到一些其他的香氣成分，它們的相對含量都比較低，對啤酒糟蘋果醋的香氣特性影響不是很大。

2.2 啤酒糟蘋果醋發(fā)酵過程中體外抗氧化特性分析

2.2.1 DPPH自由基的清除能力

圖2 啤酒糟蘋果汁、蘋果酒及蘋果醋對DPPH自由基的清除作用Fig.2 Scavenging effects of apple juice,apple cider and cider vinegar with brewer's spent grains on DPPH free radical

由圖2可知，啤酒糟蘋果汁、蘋果酒、蘋果醋都具有較強的DPPH自由基清除能力，隨著體積分數(shù)的增加而增加。在相同體積分數(shù)下，其中啤酒糟蘋果汁和蘋果酒的清除能力趨勢相似，在體積分數(shù)為20%時，二者清除率都在50%以上，體積分數(shù)達到50%時，對DPPH自由基的清除能力趨于穩(wěn)定，啤酒糟蘋果酒對DPPH自由基的清除率達到91.25%，而啤酒糟蘋果汁對DPPH自由基的清除率也達到83.42%，啤酒糟蘋果醋的清除效果也比較好，在最大試驗濃度時清除率達到79.22%，與啤酒糟蘋果汁DPPH自由基清除率相差不大，對DPPH的清除率順序為啤酒糟蘋果酒＞啤酒糟蘋果汁＞啤酒糟蘋果醋。孫強偉等[34]研究啤酒糟揮發(fā)油對DPPH自由基的清除作用明顯，這與薛淑琴[22]對蘋果醋的研究結(jié)果相一致，其原因可能與果醋里的多酚和黃酮等抗氧化活性物質(zhì)含量有關(guān)。

2.2.2 Fe3+還原能力

圖3 啤酒糟蘋果汁、蘋果酒及蘋果醋Fe3+還原能力Fig.3 Fe3+reducing capacity of apple juice,apple cider and cider vinegar with brewer's spent grains

由圖3可知，三個階段都具有較強的還原能力，各曲線呈上升趨勢，啤酒糟蘋果醋的還原能力明顯比啤酒糟蘋果汁、果酒低，可能是由于在果酒發(fā)酵階段產(chǎn)生大量還原性物質(zhì)，發(fā)酵成果醋后，一部分活性物質(zhì)在長時間發(fā)酵后失活，使得果醋的還原能力有所下降，F(xiàn)e3+還原能力由強到弱依次是啤酒糟蘋果汁＞啤酒糟蘋果酒＞啤酒糟蘋果醋。

3 結(jié)論

本實驗對啤酒糟蘋果醋發(fā)酵過程中揮發(fā)性香氣成分進行分析，共檢出50種化合物，其中酯類16種、醇類8種、醛類8種、酸類7種、酚類4種、其他4種、酮類2種及醚類1種。果汁中檢測出12種揮發(fā)性物質(zhì)，其中2-己烯醛、DL-薄荷醇、乙酸己酯只在果汁中檢測到，可作為它的特征化合物。果酒中檢測出15種揮發(fā)性物質(zhì)，相對含量最高的是苯乙醇（24.64%），是果酒的主要呈香物質(zhì)。果醋中檢測出24種揮發(fā)性物質(zhì)，丁酸、庚酸、4-乙基苯酚并未在果汁和果酒中檢測到，可作為果醋的特征物質(zhì)。這些物質(zhì)在不同階段都有著不同的貢獻，其中苯乙醇、乙酸異戊酯、2-己烯醛、糠醛共同作用形成了果酒、果醋特有的風味和口感?？寡趸钚栽囼灲Y(jié)果表明，DPPH自由基的清除率順序為啤酒糟蘋果酒＞啤酒糟蘋果汁＞啤酒糟蘋果醋，F(xiàn)e3+還原能力順序為啤酒糟蘋果汁＞啤酒糟蘋果酒＞啤酒糟蘋果醋。