常新見，周金柱，范寶超，郭容利，朱琳，趙永祥，牛家強，何孔旺，李彬*

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所，江蘇 南京 210014;2.西藏農(nóng)牧學(xué)院動物科學(xué)學(xué)院，西藏 林芝 860000)

豬輪狀病毒腹瀉是由豬輪狀病毒(porcine rotavirus)引起的一種以腹瀉、厭食、嘔吐、脫水為特征的急性傳染病。該病多發(fā)于寒冷季節(jié)，呈地方性流行，各種年齡的豬皆可感染，感染率最高可達90%～100%[1-2]。疫苗接種是目前唯一的防控豬輪狀病毒腹瀉的方法，因此豬輪狀病毒疫苗的研發(fā)具有非常重要的意義[3]。輪狀病毒(rotavirus)屬于呼腸孤病毒科輪狀病毒屬[4]，基因組由11個不連續(xù)的雙股RNA片段組成，編碼6種結(jié)構(gòu)蛋白(VPs)和6種非結(jié)構(gòu)蛋白(NSPs)，該病毒粒子由3層衣殼組成，最外層衣殼由VP7和纖突蛋白VP4組成[5-6]。輪狀病毒的主要抗原蛋白VP4經(jīng)胰蛋白酶作用后，可裂解為2條長度不等的肽段VP8*和VP5*，其中VP8*片段具有高度的同型特異性[7]。胰蛋白酶可將VP4切割形成VP8*和VP5*，提高輪狀病毒的感染性[8]。盡管外衣殼蛋白VP4是重組輪狀病毒疫苗開發(fā)的重要靶蛋白，可是完整的VP4蛋白的溶解性差，所以在過去幾年科研人員將VP8蛋白作為候選蛋白進行了探索[9]。VP8蛋白具有VP4蛋白的主要抗原表位，且決定著VP4蛋白的特異性血清中和反應(yīng)[10]。陳思靜[11]發(fā)現(xiàn)VP8*蛋白可誘導(dǎo)病毒中和抗體和小鼠相關(guān)保護，細菌表達的VP8*蛋白可誘導(dǎo)高水平的病毒中和抗體，具有可觀的疫苗潛力。目前已經(jīng)上市的輪狀病毒疫苗均為減毒活疫苗，有較高的腸套疊風(fēng)險，所以研究更加安全有效的輪狀病毒亞單位疫苗具有重要意義[12]。Dunn等[13]所做小鼠模型的結(jié)果表明，VP4、VP8*和VP5*均能刺激小鼠產(chǎn)生中和抗體。本實驗室前期對豬輪狀病毒開展流行病學(xué)調(diào)查，發(fā)現(xiàn)G9P7型已經(jīng)成為臨床優(yōu)勢基因型[14]。因此，本文對實驗室分離到的G9P7型毒株NJ2012的VP8基因進行了克隆，并在原核系統(tǒng)中進行融合蛋白的重組表達，為進一步研究VP8蛋白的結(jié)構(gòu)功能及開發(fā)新型輪狀病毒疫苗、診斷試劑和治療藥物奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

G9P7型豬輪狀病毒毒株NJ2012，由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所人獸共患病防控研究室分離保存。PrimeScript RT reagent Kit、NdeⅠ、BamHⅠ均購自大連寶生物技術(shù)有限公司；Trans5α感受態(tài)細胞購自TransGen Biotech；DE3感受態(tài)細胞購自康為世紀(jì)有限公司；pET28a表達載體(卡那霉素抗性)由本實驗室保存；HRP標(biāo)記的羊抗鼠單抗購自Abclonal；抗His-tag鼠單克隆抗體購自Abclonal公司；脫脂奶粉購自伊利；BSA蛋白定量檢測試劑盒購自碧云天公司；PVDF膜購自Sigma公司。

1.2 引物設(shè)計及PCR擴增

根據(jù)NJ2012基因組序列，利用Primer 5.0軟件設(shè)計引物并將交由南京擎科生物科技有限公司合成。引物序列如下，上游: 5′-GATCCATATGTTATTAGATGGTCCATACC-3′，下游: 5′-CGCGGATCCTATCATCCATGATTGATATACTCAG-3′，并在序列兩端分別引入NdeⅠ和BamHⅠ酶切位點。使用Magen公司的RNA提取試劑盒提取NJ2012病毒全基因組并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。PCR擴增反應(yīng)參數(shù)如下：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，54 ℃退火45 s，72 ℃延伸10 min，共35個循環(huán)。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。

1.3 VP8序列同源性分析

選取10株來自不同宿主、常用作疫苗株的輪狀病毒的VP8序列作為參考序列(表1)，應(yīng)用軟件DNAStar MegAlign中的Clustalw Method與DNAman中的Mulitiple Alignment進行核苷酸序列與氨基酸序列的同源性比對分析。

表1 參考毒株信息

1.4 目的基因原核表達載體的構(gòu)建

將PCR產(chǎn)物連接到pMD19-T載體，使用熱轉(zhuǎn)化方法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到Trans5α感受態(tài)細胞，隨后，提取質(zhì)粒，對其進行PCR和質(zhì)粒雙酶切鑒定，分別收取PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物使用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，將鑒定為陽性的重組質(zhì)粒命名為pMD19T-VP8，送至南京思普金生物科技有限公司進行測序鑒定。將測序正確的pMD19T-VP8質(zhì)粒與表達載體共同使用NdeⅠ和BamHⅠ內(nèi)切酶進行雙酶切處理，進行膠回收。將回收的目的基因與表達載體pET28a(+)進行連接，使用熱轉(zhuǎn)化方法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Trans5α感受態(tài)細胞中，提取重組質(zhì)粒，對其進行PCR和質(zhì)粒雙酶切鑒定，將PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物使用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，將鑒定為陽性的重組質(zhì)粒命名為pET28a-VP8。

1.5 重組VP8蛋白的誘導(dǎo)表達與純化

將鑒定成功的陽性重組菌接種于含卡那霉素的LB培養(yǎng)基，每管3 mL，在37 ℃搖床振蕩培養(yǎng)，每隔1 h檢測菌液的OD600值，當(dāng)菌液OD600值為0.6～0.8時加入IPTG終濃度為5 mmol/L，37 ℃搖床振蕩培養(yǎng)6 h。隨后，分別從2個試管中吸取1 mL菌液，4 ℃，12 000 r/min離心3 min，收取沉淀，同時以誘導(dǎo)的空載體全菌作為對照，SDS-PAGE檢測重組VP8蛋白是否成功表達。按照1∶100的比例將成功表達純化培養(yǎng)的菌液接種于100 mL含有卡那霉素抗性的LB液體培養(yǎng)基中，在37 ℃的條件下?lián)u床振蕩培養(yǎng)，當(dāng)菌液OD600值為0.6～0.8時，終濃度為5 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)重組蛋白表達，37 ℃搖床低溫振蕩誘導(dǎo)6 h后收集菌液。將誘導(dǎo)后的菌液8 000 r/min離心30 min，棄上清，用PBS(不含尿素)重懸于冰浴中進行超聲破碎(功率：40%，60 min)，將超聲破碎的菌液4 ℃、8 000 r/min離心30 min，分離上清和沉淀，收取獲得沉淀使用2 mol/L尿素吹懸并重懸于冰浴中進行超聲破碎(功率：40%，10 min)；分別按照4、6和8 mol/L增加溶液尿素含量至最終完全溶解且呈透亮狀態(tài)，之后離心，收集上清，將獲得的溶液放入透析袋中，依次使用6、4、2、1 和0.5 mol/L尿素溶液和1×PBS溶液在4 ℃條件下對其進行透析，每次4 h。將獲得的蛋白溶液使用PEG-8000進行濃縮處理即可獲得純化蛋白，使蛋白濃度為1 mg/mL。

1.6 重組VP8蛋白Western blot檢測

將經(jīng)SDS-PAGE檢測的蛋白在115 mA的電流下轉(zhuǎn)膜45 min使其轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，使用1×PBST清洗3次，每次10 min；使用5%脫脂乳溶液室溫封閉2 h，封閉后使用1×PBST清洗3次，每次10 min；抗His-tag鼠單克隆抗體(1∶4 000)作為一抗，室溫孵育1 h，孵育后使用1×PBST清洗3次，每次10 min；羊抗鼠HRP-IgG(1∶4 000)作為二抗，孵育1 h，孵育后使用1×PBST清洗3次，每次10 min；在PVDF膜上加入ECL顯色液，使用化學(xué)發(fā)光成像儀拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 VP8序列同源性分析

測序結(jié)果表明，從NJ2012毒株克隆的VP8基因片段長為480 bp，編碼氨基酸160 aa，該序列與參考毒株序列的核苷酸同源性為53.9%～99.2%，氨基酸同源性為42.1%～97.5%，如表2所示。

表2 NJ2012與參考毒株的VP8序列同源性分析 %

2.2 VP8基因PCR擴增

PCR擴增后，產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示(圖1)，擴增出約480 bp的片段，與VP8基因預(yù)期大小一致。

M.DL2000 DNA Marker；1～5.VP8基因

2.3 重組表達質(zhì)粒雙酶切鑒定

對重組質(zhì)粒進行雙酶切鑒定，如圖2所示?；蚱未笮∨c預(yù)期相符，陽性質(zhì)粒測序結(jié)果與NJ2012-VP8基因測序結(jié)果進行比對，兩者序列完全一致，表明重組表達質(zhì)粒構(gòu)建成功。

M.DL5000 DNA Marker;1.重組pET28a-VP8質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物

2.4 重組蛋白SDS-PAGE檢測

重組表達菌DE3(pET28a-VP8)由IPTG誘導(dǎo)表達經(jīng)SDS-PAGE檢測，如圖3所示，裂解菌體和包涵體在17～25 kDa處出現(xiàn)了1條清晰的條帶，約為20 kDa，與目的蛋白大小相符。

M.蛋白Marker；1.pET28a誘導(dǎo)后；2.pET28a-VP8誘導(dǎo)后全菌；3.pET28a-VP8誘導(dǎo)后上清；4.pET28a-VP8誘導(dǎo)后包涵體

2.5 重組VP8蛋白Western blot檢測

Western blot檢測表明重組VP8蛋白能夠與抗His-Tag鼠單克隆抗體發(fā)生結(jié)合反應(yīng)，如圖4所示，進一步證實了VP8蛋白在DE3宿主菌得到表達。

M.蛋白Marker；1.誘導(dǎo)pET28a；2.未誘導(dǎo)pET28a-VP8；3.誘導(dǎo)pET28a-VP8

2.6 重組VP8蛋白純化后鑒定

包涵體中有大量重組VP8蛋白存在，經(jīng)尿素溶解，SDS-PAGE檢測可知重組蛋白存在于8 mol/L尿素中(如圖5A)；經(jīng)Western blot鑒定，在17～25 kDa處出現(xiàn)1條清晰條帶(如圖5B)，與目的蛋白大小一致。

A.重組VP8蛋白純化后SDS-PAGE檢測結(jié)果：M.蛋白Marker；1.未純化VP8蛋白；2.純化后VP8蛋白

3 討論

研究表明，豬輪狀病毒NJ2012毒株的VP8基因片段大小為480 bp，編碼160 aa，與參考毒株的核苷酸序列同源性為53.9%～99.2%，氨基酸序列同源性為42.1%～97.5%。為了提高VP8重組蛋白的表達量，本研究在試驗過程中對表達條件進行了優(yōu)化，結(jié)果表明，在37 ℃、IPTG終濃度為5 mmol/L、誘導(dǎo)時間為6 h的條件下VP8蛋白得到最大程度表達。該包涵體在含8 mol/L尿素溶液中可完全溶解，利用尿素梯度透析使其復(fù)性，獲得的重組蛋白經(jīng) SDS-PAGE 鑒定純度大，蛋白濃度測定為1 mg/mL。畢艷鐸等[15]利用原核表達系統(tǒng)所表達的豬輪狀病毒VP8*(64～223 aa)具有良好的免疫原性，且產(chǎn)量高可溶，具有極大的商品化潛力。魏曉曼等[16]通過對Gottfried和SB-1A株豬輪狀病毒截短VP8*蛋白的免疫原性分析，免疫小鼠后發(fā)現(xiàn)蛋白具有較好的免疫原性。本研究獲得VP8蛋白存在于包涵體中，蛋白不可溶，考慮到后期蛋白免疫原性及操作簡便性，應(yīng)重新考慮更換表達載體及優(yōu)化密碼子。

本研究室前期經(jīng)流行病調(diào)查發(fā)現(xiàn)G9P7型已成為優(yōu)勢基因型，同時本室分離獲得的毒株為G9P7型，同類型的毒株相似報道較少。聞曉波等[17]在大腸桿菌中表達輪狀病毒株Wa的P8、DS-1的P4和1076的P6，其產(chǎn)量高且高度可溶性，于豚鼠肌內(nèi)免疫VP8*蛋白(即P8、P4或P6)可產(chǎn)生高水平的中和抗體。2012年，Wen等[18]進一步研究發(fā)現(xiàn)，在僅融合6個組氨酸的情況下，VP8核心區(qū)也能以可溶形式高效表達，該蛋白在豚鼠模型中可產(chǎn)生高滴度的中和抗體。將VP8蛋白與GST融合表達則可以獲得可溶性的VP8蛋白，免疫雞后可產(chǎn)生高滴度的卵黃抗體[19]。完整的VP8蛋白在大腸桿菌中也以包涵體的形式表達，但其刺激小鼠產(chǎn)生中和抗體的能力與真核表達的VP8蛋白無顯著差異，免疫牛和家兔也能產(chǎn)生高滴度的中和抗體[20]。這提示輪狀病毒的VP8蛋白是一個重要潛在亞單位疫苗的候選蛋白，需要進一步進行免疫原性的研究。鑒于不同型毒株之間的抗原免疫交叉保護較差，VP8蛋白能否針對臨床的毒株產(chǎn)生保護性，需要更為深入的探索。