藍肇煜，王小月，李丹，武靜橋，范真瑋，姚景麗，趙微，何敬文，陳婷，金天明

(天津農學院動物科學與動物醫(yī)學學院，天津 300384)

起源于乳腺上皮組織的惡性腫瘤稱為乳腺癌(breast cancer)。乳腺腫瘤是雌性動物中最常見的腫瘤，特別是小動物的重要臨床疾病之一[1]。犬是乳腺腫瘤發(fā)病率最高的動物，未絕育的母犬發(fā)病率高達71%[2]。采用常規(guī)腫瘤治療方法后，高風險乳腺癌病畜仍會死于腫瘤復發(fā)和轉移。因此，尋找合適的載體和治療藥物將會極大改善乳腺癌對雌性動物的傷害。

研究顯示，實體瘤有一個顯著特性，即伴隨著腫瘤的快速生長，導致供氧不足，在其內部會出現低氧區(qū)(氧含量為1%，正常組織中為3%～15%)。腫瘤低氧區(qū)的存在形成了天然的厭氧環(huán)境，又由于腫瘤內部的免疫抑制作用，壞死區(qū)中細胞裂解產生的營養(yǎng)物質，以及新生血管破裂等原因，為兼性或厭氧菌生長提供了有利環(huán)境，使有些厭氧菌或兼性厭氧菌可以靶向腫瘤，并在腫瘤中生長，這一發(fā)現預示著某些厭氧菌或兼性厭氧菌有望成為攜帶抗腫瘤藥物的載體，這其中尤以沙門菌為典型代表[3]。減毒菌株鼠傷寒沙門菌LH430(phoP/phoQ基因缺失)在敲除了鼠傷寒沙門菌的phoP/phoQ基因后，菌株毒力與親本菌株相比大為降低，但仍保留了親本菌株的侵襲力，是適宜的疫苗及載體候選菌株[4]。

腫瘤靶向肽精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)是細胞能夠識別的最小的蛋白質一級結構上所特有的結構單位，可有效識別腫瘤血管整合素αvβ3[5]。由于乳腺癌細胞表面存在整合素αvβ3，RGD能夠高度靶向乳腺癌細胞，進而抑制乳腺癌細胞的增殖和侵襲。

細胞穿膜肽(CPPs)又稱蛋白質轉導結構域(PTDs)，是一組不超過35個氨基酸殘基，可有效地內化細胞，攜帶偶聯藥物進入細胞的小肽，且不引起細胞毒性反應。TAT是一種11聚體的細胞穿膜肽，來源于人類免疫缺陷病毒1型(HIV-1)編碼的轉錄反式激活蛋白，是保持細胞穿膜能力的最小蛋白，也是自發(fā)現細胞穿膜肽以來研究和使用最廣泛的肽。

白樹毒素(gelonin，簡稱GEL)是一種Ⅰ型核糖體失活蛋白(RIPs)，單鏈核糖體失活蛋白，具有RNA N-糖苷酶活性，可專一性水解真核細胞核糖體28S rRNA中第4 324位腺苷酸的N-C鍵，釋放1個腺嘌呤(A)使核糖體失活，從而抑制蛋白質生物合成，導致細胞死亡[6-7]。同時，GEL又具有類 DNase 活性，可使細胞核中 DNA降解[8]。

本研究選擇GEL基因作為乳腺癌的治療基因，同時利用LH430和RGD對腫瘤細胞的雙靶向作用及TAT細胞穿透作用，構建了攜帶RGD-TAT-GEL三基因的減毒沙門菌，增強GEL基因的穿透細胞能力，使其更高效地殺傷腫瘤細胞。同時，借助雙靶向作用，可進一步降低GEL基因對正常細胞的損傷，從而實現靶向抑瘤的目的。

1 材料與方法

1.1 主要材料

沙門菌LH430由吉林大學基礎獸醫(yī)學實驗室惠贈；乳腺癌細胞MDA-MB-231由天津師范大學朱長軍教師惠贈；含質粒pMD-RGD-TAT-GEL、pMD-TAT-GEL和pMD-RGD-GEL的重組大腸桿菌由上海捷瑞生物工程有限公司合成；HEK-293細胞和pEGFP-N1質粒由本實驗室保存。

TRIzol Reagent購自北京天恩澤基因科技有限公司；SanPrep柱式質粒DNA小提試劑盒、SanPrep 柱式 DNA膠回收試劑盒均購自生工生物工程(上海)公司；限制性內切酶、T4 DNA連接酶購自Thermo Scientific公司。

1.2 引物設計

根據GenBank 中 RGD 基因序列(1FUL_A)、TAT基因序列(ADK70247.1)第47-57氨基酸序列(YGRKKRRQRRR)和GEL基因序列(AAB47013.1)設計RGD-TAT-GEL基因引物；根據RGD基因序列(1FUL_A)和GEL基因序列(AAB47013.1)設計RGD-GEL基因引物；根據TAT基因序列(ADK70247.1)第47-57氨基酸序列(YGRKKRRQRRR)和GEL基因序列(AAB47013.1)設計TAT-GEL基因引物，所有引物均由上海捷瑞生物工程有限公司合成(表1)。

表1 引物信息

1.3 pEGFP-RGD-TAT-GEL、pEGFP-RGD-GEL、pEGFP-TAT-GEL質粒制備與鑒定

根據試劑盒說明書提取大腸桿菌中的pMD-RGD-TAT-GEL、pMD-TAT-GEL、pMD-RGD-GEL和pMD-GEL重組質粒，用限制性內切酶EcoRⅠ/BamHⅠ分別進行雙酶切。回收RGD-TAT-GEL基因、RGD-GEL基因、TAT-GEL基因和真核表達載體pEGFP-N1雙酶切產物。采用T4連接酶將回收的目的基因與載體16 ℃連接過夜，并測序。

1.4 重組沙門菌的構建

將減毒沙門菌LH430轉化為感受態(tài)細胞，按照文獻[9]方法將質粒pEGFP-RGD-TAT-GEL、pEGFP-RGD-GEL、pEGFP-TAT-GEL和pEGFP-N1分別轉化至LH430感受態(tài)細胞，通過卡那霉素抗性培養(yǎng)基篩選出陽性菌株，利用引物F1/R1對RGD-TAT-GEL基因和RGD-GEL基因進行PCR鑒定，引物F2/R1對TAF-GEL基因進行PCR鑒定，陽性重組菌分別命名為 LH430/pEGFP-RGD-TAT-GEL、LH430/pEGFP-RGD-GEL和LH430/pEGFP-TAT-GEL，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 重組減毒沙門菌侵染MDA-MB-231細胞及外源基因檢測

將MDA-MB-231細胞分為5組，每組3孔，每孔1×105個細胞加入6孔板中，并加入2 mL含10% FBS的DMEM完全培養(yǎng)液。待細胞融合度至70%～80%時，PBS洗滌2次，用無血清無抗DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)2 h，每組分別加入50 μL(1×106CFU/mL)LH430/pEGFP-RGD-TAT-GEL、LH430/pEGFP-RGD-GEL、LH430/pEGFP-TAT-GEL 和LH430/pEGFP，置于 5% CO2培養(yǎng)箱，37 ℃孵育3 h，PBS洗滌2次，每孔加入10% FBS的DMEM完全培養(yǎng)液2 mL，于37 ℃培養(yǎng)箱孵育3 h后，換為無血清無抗DEME培養(yǎng)液，培養(yǎng)6～48 h后，利用熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白表達情況。采用 TRIzol法從侵染 48 h后的MDA-MB-231細胞中提取細胞總 RNA，利用逆轉錄試劑盒獲得cDNA后，以其為模板，分別以 F1/R1、F2/R1為引物，PCR 檢測目的基因。反應程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，73 ℃ 1 min，35 個循環(huán)；73 ℃ 15 min。

1.6 CCK-8法檢測重組沙門菌對細胞增殖的影響

將MDA-MB-231細胞、HEK-293細胞各分5組，分別重懸于含10% FBS的DMEM和MEM完全培養(yǎng)液中，調整細胞濃度至5×104個/mL，于96孔板中加入100 μL細胞懸液，37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細胞融合度至60%時，換為無血清無抗DMEM培養(yǎng)基，每組加入LH430/pEGFP-RGD-TAT-GEL、LH430/pEGFP-RGD-GEL、LH430/pEGFP-TAT-GEL 和LH430/pEGFP各10 μL，每個重組菌用無血清無抗培養(yǎng)液依次稀釋1×108、1×107、1×106、1×105、1×104CFU/μL，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48和72 h。到達檢測時間時，于每孔加入10 μL的CCK-8溶液，在37 ℃孵育1 h，用酶標儀在450 nm波長處檢測光吸收值。

使用GraphPad Prism軟件繪制抑制率圖表，通過SPSS軟件用One-way ANOVA方法計算抑制率和標準差，利用SPSS軟件中的Probit分析CCK-8結果計算出半數抑制濃度(IC50)值并用One-way ANOVA方法計算其標準差。抑制率計算方法：各重復孔的OD值取“均數±標準差”，用1-(OD值-空白OD值)/(陰性對照孔OD值-空白OD值)×100%獲得各種藥物的抑制率。

2 結果與分析

2.1 pEGFP-RGD-TAT-GEL、pEGFP-RGD-GEL、pEGFP-TAT-GEL質粒的鑒定

將提取后的pMD-RGD-TAT-GEL、pMD-TAT-GEL、pMD-RGD-GEL和pMD-GEL重組質粒用限制性內切酶EcoRⅠ/BamHⅠ進行雙酶切。將膠回收的基因片段經T4連接酶連接后，測序結果與預期相符，表明上述重組質粒構建成功。

2.2 構建重組沙門菌的鑒定

將含質粒pEGFP-RGD-TAT-GEL、pEGFP-RGD-GEL、pEGFP-TAT-GEL的重組減毒沙門菌，進行PCR鑒定，獲得857、824和830 bp的預期目的片段(圖1)，表明成功構建重組減毒沙門菌。

M.250 bp-Ⅰ DNA ladder；1.LH430/pEGFP-RGD-TAT-GEL(857 bp)；2.LH430/pEGFP-TAT-GEL(830 bp)；3.LH430/pEGFP-RGD-GEL(824 bp)

2.3 重組減毒沙門菌侵染MDA-MB-231細胞檢測

重組減毒沙門菌LH430/pEGFP-RGD-TAT-GEL、LH430/pEGFP-RGD-GEL和LH430/pEGFP-TAT-GEL侵染MDA-MB-231細胞24、48和72 h后，熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光(圖2)。經LH430/pEGFP-RGD-TAT-GEL侵染的細胞表達綠色熒光最明顯。

a.LH430/pEGFP-RGD-TAT-GEL; b.LH430/pEGFP-TAT-GEL; c.LH430/pEGFP-RGD-GEL; d.LH430/pEGFP-N1

2.4 RT-PCR檢測目的基因

PCR檢測重組減毒沙門菌LH430/pEGFP-RGD-TAT-GEL、LH430/pEGFP-RGD-GEL、LH430/pEGFP-TAT-GEL中的RGD-TAT-GEL、RGD-GEL 和TAT-GEL基因，在857、824和830 bp處獲得目的片段(圖3)，表明重組菌在MDA-MB-231細胞中成功表達RGD-TAT-GEL、RGD-GEL 和TAT-GEL基因。

M.250 bp-Ⅰ DNA ladder; 1.RGD-GEL(824 bp); 2.TAT-GEL(830 bp); 3.RGD-TAT-GEL(857 bp)

2.5 CCK-8法檢測重組沙門菌對細胞增殖的影響

2.5.1 不同時間濃度重組菌對MDA-MB-231細胞的抑制效果

重組減毒沙門菌對MDA-MB-231細胞的抑制力隨劑量增加而增強，但沒有出現時間和劑量的依賴性，LH430/pEGFP-RGD-TAT-GEL組48 h時抑制率為68%，顯著高于其他組(P<0.05)(圖4)。

A.LH430/pEGFP-RGD-TAT-GEL；B.LH430/pEGFP-RGD-GEL；C.LH430/pEGFP-TAT-GEL；D.LH430/pEGFP-N1；同一處理組間比較，不同字母表示差異顯著(P<0.05)，相同字母或無字母表示差異不顯著(P>0.05)。下同

2.5.2 不同時間濃度重組菌對HEK-293細胞的抑制效果

重組減毒沙門菌對HEK-293細胞的抑制力普遍較低，明顯低于對MDA-MB-231細胞的抑制力，且沒有出現時間和劑量的依賴性(圖5)。說明重組菌對腫瘤細胞靶向性較好，對正常細胞損傷較小。

A.LH430/pEGFP-RGD-TAT-GEL；B.LH430/pEGFP-RGD-GEL；C.LH430/pEGFP-TAT-GEL；D.LH430/pEGFP-N1

2.6 各組重組菌對腫瘤細胞及正常細胞的IC50值

將CCK-8數據進行分析并計算各重組菌對MDA-MB-231細胞和HEK-293細胞的IC50值。結果顯示LH430/pEGFP-RGD-TAT-GEL組對MDA-MB-231細胞的IC50值最低，為(4.643±0.514)×107CFU/μL，對HEK-293細胞的IC50值最高，為(2.376±0.260)×109CFU/μL，說明其抑瘤效果最佳，且對正常細胞損傷較小(圖6)。

圖6 各重組菌對MDA-MB-231細胞和HEK-293細胞的IC50值分析結果

3 討論

目前，癌癥治療的主要障礙是藥物的低效力，因此，人們更多地利用蛋白質或基因開展腫瘤治療研究，然而，這些大分子卻不能穿透細胞膜[10]。研究表明，PTDs是將生物活性大分子傳遞到完整細胞中最有效的工具，能夠將小分子藥物、大分子甚至納米顆粒送入所有類型的細胞中，其轉導機制強于其他內化途徑[11]。Shin等[12]的研究表明，經穿膜肽TAT修飾后，GEL基因的表達效率與GEL單基因相比提高了177倍，但因缺乏腫瘤特異性，故需其他靶向修飾。Low等[13]和Robert[14]改造出VNP20009和A1-R等擁有抑瘤能力的菌株，由于安全性原因，改造菌的抑瘤效果并不顯著，因此，尋找有效的靶向基因和治療基因顯得尤為重要。進一步研究顯示，鼠傷寒沙門菌是眾多治療腫瘤細菌中的理想候選[15]。Ham等[16]將穿膜肽F3與GEL基因構建成嵌合肽，對HeLa、LnCaP、9L和U87 MG癌細胞進行靶向性試驗，結果顯示，在所測癌細胞中觀察到F3-GEL表達量都較高，殺傷作用較強，說明GEL基因殺傷力極強，在穿膜肽的協(xié)同作用下，可高效率消滅腫瘤細胞。

本研究首次構建出能夠高效穩(wěn)定表達外源基因的重組減毒沙門菌LH430/pEGFP-RGD-TAT-GEL、LH430/pEGFP-RGD-GEL、LH430/pEGFP-TAT-GEL、LH430/pEGFP-GEL和LH430/pEGFP。CCK-8試驗結果顯示，重組沙門菌沒有出現對時間和劑量的依賴性，對于MDA-MB-231細胞，LH430/pEGFP-RGD-TAT-GEL 組48h時抑制效果最佳，IC50值最低。對于HEK-293細胞，各重組沙門菌均顯示出較低的殺傷力，且LH430/pEGFP-RGD-TAT-GEL 組的IC50值最高，說明對腫瘤細胞具有更高的靶向性。

本研究結果中，LH430/pEGFP-N1組對腫瘤細胞同樣有殺傷作用，其原因為一方面細菌可以通過其自身的毒力物質，如內毒素和侵襲素等誘導宿主細胞凋亡；另一方面宿主細胞經刺激后可產生如腫瘤壞死因子、白細胞介素、凋亡蛋白等作用于自身并引起凋亡[17]。由于減毒沙門菌 LH430 本身便具有抑制腫瘤生長的能力，因此，亦可誘導細胞凋亡。同時因本研究采用重組減毒沙門菌治療，在侵入腫瘤組織后能夠誘導機體產生細胞免疫和體液免疫反應，使免疫細胞集中于腫瘤組織，從而促進腫瘤細胞的凋亡，與Felgner等[15]的結論一致。

本試驗的研究結果證明，重組減毒沙門菌LH430/pEGFP-RGD-TAT-GEL靶向效果良好，抑瘤效果明顯，為下一步腫瘤動物模型的試驗研究奠定了基礎。