趙宏吉，張金花，司朵朵，張珠明，李繼東

(寧夏大學農(nóng)學院，寧夏 銀川 750021)

山羊痘是由山羊痘病毒(goatpox virus, GTPV)引起山羊的一種高度接觸性傳染病，發(fā)病率高，同群感染的山羊發(fā)病率可達100%[1]。主要通過空氣飛沫傳染和接觸傳染等方式傳播，發(fā)熱、呼吸道癥狀及在皮膚黏膜出現(xiàn)痘疹為該病的特征，在中國被列為一類動物疫病[2]。山羊痘可導致山羊的體重減輕，懷孕母羊的流產(chǎn)率上升[3]，還會對皮毛造成損壞[4]，這給養(yǎng)羊業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失，而且還有山羊痘感染人的相關報道[5]，說明研究該病具有公共衛(wèi)生學意義。世界上很多國家有山羊痘的相關報道，該病在希臘、越南、蒙古等出現(xiàn)過暴發(fā)流行[6]。國內(nèi)多呈地方性流行，如云南、寧夏、湖南、山東、黑龍江、內(nèi)蒙古、甘肅、青海、江蘇等地也有山羊痘的發(fā)生[7]。

GTPV屬于痘病毒科山羊痘病毒屬，是一種有囊膜包被的DNA病毒。GTPV基因組呈雙股線形，約有150 kb，(A+T)含量約為75%。病毒大小約為300 nm×270 nm×200 nm，可在羔羊睪丸和羊腎的單層細胞、雞胚絨毛尿囊膜上良好地生長[8]。GTPV的基因組中約有147個開放閱讀框(ORF)，病毒基因編碼的部分蛋白是重要的結(jié)構(gòu)蛋白[9]。當前，人們對痘苗病毒(vaccinia virus，VACV)的基因組以及編碼的功能蛋白已經(jīng)有了較為系統(tǒng)、深入的研究。有研究顯示，在VACV中，有12種蛋白參與病毒對細胞的侵入和融合[10]。而在侵入和融合作用的蛋白中，A16和G9是較早被鑒定為與侵入、融合相關的病毒膜蛋白，該蛋白是可溶性的肉豆蔻?；鞍?，在病毒復制組裝或有感染性的病毒顆粒產(chǎn)生過程中起到重要作用[11]。有試驗證明，當VACV缺失了G9、A16基因就不能進行復制，說明G9、A16基因參與病毒的復制[12]；在不誘導G9、A16表達蛋白時，病毒只能停留在宿主細胞表面，無法進入細胞內(nèi)，說明這2個蛋白與病毒侵襲宿主細胞的毒力有關[13]。各種痘病毒在基因組成、排列方式以及核苷酸序列等方面具有不同程度的保守性，保守性較高的基因在病毒復制、組裝以及感染宿主細胞等過程中起著重要作用[14]。借鑒和參考VACV感染宿主細胞相關膜蛋白的研究成果，通過比對分析GTPV和VACV的基因組，發(fā)現(xiàn)VACV的部分基因在GTPV基因組中具有對應的同源基因[15]。由此推斷，GTPV 中G9、A16的同源基因在病毒的復制與感染中具有與VACV G9、A16基因相似的作用。

本研究通過NCBI數(shù)據(jù)庫查找VACV G9、A16基因在GTPV中的同源基因序列gp055、gp103，克隆編碼GTPV疫苗株G9、A16蛋白的基因序列，利用生物信息學方法分析G9、A16蛋白的性質(zhì)與功能，為進一步開展相關研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 病毒株

本試驗所用山羊痘病毒疫苗株GTPV AV41來源于中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，由本實驗室保存。

1.2 試劑

2×TaqPlus Master Mix，購自紐英侖生物技術(北京)有限公司；凝膠回收試劑盒，購自上海百賽生物技術股份有限公司。

1.3 引物設計和合成

參考山羊痘病毒Goatpox Virus Pellor(登錄號：NC_004003)的基因組序列設計引物，從山羊痘病毒弱毒疫苗GTPV AV41的基因組中擴增編碼G9蛋白和A16蛋白的基因序列，大小分別為1 011和1 134 bp，使用Primer Premier 5.0軟件設計2對特異性引物，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。引物序列為：GTPV G9-F：5′-ATGGGTTCTTCTTTTACAGTTC-3′；GTPV G9-R：5′-TTAAATAGCTACAATTAATACCCAT-3′；GTPVA16-F：5′-ATGGGTGGATCTGTATCTGTAAC-3′；GTPV A16-R：5′-TTATCGTCTACGAACATTTATATTATT-3′。

1.4 基因擴增和鑒定

以提取的山羊痘病毒疫苗毒株GTPV AV41基因組為模板，使用引物GTPV G9-F、GTPV G9-R、GTPV A16-F、GTPV A16-R進行PCR擴增。

PCR反應體系為：50 μL，2×TaqPlus Master Mix 25 μL、模板3 μL、上下引物各2 μL、ddH2O 18 μL。

PCR反應為：95 ℃ 預變性5 min；98 ℃ 變性10 s，55 ℃退火10 s，72 ℃延伸80 s，共30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

PCR擴增產(chǎn)物在1.2%瓊脂糖凝膠進行電泳鑒定并切膠回收目的片段，將回收的目的片段放入4 ℃冰箱保存并送公司進行測序。

1.5 序列比對及進化樹構(gòu)建

從NCBI數(shù)據(jù)庫中截取痘病毒科不同屬中常見的痘病毒G9、A16的同源基因序列進行比對(表1)，使用DNAStar的MegAlign軟件進行核苷酸序列一致性比對分析，并用MEGA軟件構(gòu)建分子進化樹。

表1 基因序列

1.6 生物信息學分析

將GTPV AV41 G9、A16基因核苷酸序列利用DNAStar的EditSeq軟件翻譯成蛋白序列，通過在線工具ExPASy(http://www.expasy.org/tools/#proteome)預測蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)；通過SOPMA(http://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)預測蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)；通過MEME(http://meme-suite.org/tools/meme)預測蛋白質(zhì)的保守結(jié)構(gòu)域；通過ProtScale(http://web.expasy.org/cgi-bin/protscale/protscale.pl)對蛋白質(zhì)疏水性進行分析；通過NetPhos 3.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)預測蛋白質(zhì)的磷酸化位點；通過TMHMM Server v.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)預測蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)；通過EMBOSS Needle(https://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/)比對蛋白序列差異；通過DNAStar的Protean軟件預測蛋白質(zhì)的抗原表位；通過Phyre2(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index)分析蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與分析

2.1 A16、G9基因擴增

PCR產(chǎn)物在1.2%的瓊脂糖凝膠上進行電泳鑒定，有2處明亮且單一的目的條帶(圖1)，與預期片段1 134 bp(A16)和1 011 bp(G9)大小相符。

M.DL2000 DNA Marker；1.A16基因；2.G9基因

2.2 G9、A16基因序列比對

使用DNAStar的MegAlign軟件對GTPV AV41的G9、A16基因測序結(jié)果與其他毒株的相應序列進行核苷酸序列一致性比對分析，GTPV AV41與GTPV Pellor的G9基因一致性為99.4%，與SHPV 17077-99、LSDV NI-2490的G9基因一致性為96.3%和97.1%，與VACV IHD-J的G9基因一致性為56.8%(圖2A)。GTPV AV41與GTPV Pellor的A16基因一致性為99.4%，與SHPV 17077-99、LSDV NI-2490的A16基因一致性為97.5%和98.4%，與VACV IHD-J的A16基因一致性為63.8%(圖2B)。

圖2 G9(A)、A16(B)基因的一致性比較

2.3 進化樹的構(gòu)建

使用MEGA軟件Neighbor Joining方法將所篩選的不同物種的蛋白序列構(gòu)建進化樹，結(jié)果顯示GTPV AV41與GTPV Pellor的親緣關系最近，與SHPV 17077-99次之，與VACV IHD-J的親緣關系較遠，GTPV AV41與VACV IHD-J分別在2個不同的大分支上(圖3)。

圖3 G9(A)、A16(B)蛋白序列進化樹

2.4 蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)

通過在線工具ExPASy對GTPV AV41的G9、A16蛋白理化性質(zhì)進行預測，發(fā)現(xiàn)G9蛋白由336個氨基酸組成，相對分子質(zhì)量為39 021.61，理論等電點為7.39，不穩(wěn)定系數(shù)為38.52。A16蛋白由377個氨基酸組成，相對分子質(zhì)量為43 976.80，理論等電點為9.09，不穩(wěn)定系數(shù)為44.60。

2.5 磷酸化位點分析

通過NetPhos 3.1 Server預測G9、A16蛋白的磷酸化位點。結(jié)果顯示，GTPV AV41的G9蛋白共有34個磷酸化位點，其中絲氨酸(Ser)磷酸化位點有23個，位于288位的氨基酸置信度最高，為0.997；酪氨酸(Tyr)磷酸化位點有6個，位于46位的氨基酸置信度最高，為0.823；蘇氨酸(Thr)磷酸化位點有5個，位于256位的氨基酸置信度最高，為0.847(圖4A)。在VACV IHD-J的G9蛋白中共有29個磷酸化位點，其中Ser 磷酸化位點有15個，位于105位的氨基酸置信度最高，為0.988；Tyr磷酸化位點有5個，位于108位的氨基酸置信度最高，為0.965；Thr磷酸化位點有9個，位于124位的氨基酸置信度最高，為0.912(圖4B)。

GTPV AV41的A16蛋白共有36個磷酸化位點，其中Ser 磷酸化位點有18個，位于118位的氨基酸置信度最高，為0.993；Tyr磷酸化位點有9個，位于110位的氨基酸置信度最高，為0.953；Thr磷酸化位點有9個，位于191位的氨基酸置信度最高，為0.875(圖4C)。在VACV IHD-J的A16蛋白中共有41個磷酸化位點，其中Ser 磷酸化位點有15個，位于198位的氨基酸置信度最高，為0.990；Tyr磷酸化位點有11個，位于44位的氨基酸置信度最高，為0.970；Thr磷酸化位點有15個，位于6位的氨基酸置信度最高，為0.871(圖4D)。

A.GTPV AV41的G9蛋白；B.VACV IHD-J的G9蛋白；C.GTPV AV41的A16蛋白；D.VACV IHD-J的A16蛋白

2.6 抗原表位預測

通過DNAStar的Protean軟件預測GTPV AV41和VACV IHD-J G9、A16蛋白的抗原表位。GTPV AV41 G9蛋白可能的抗原表位有17個，預測結(jié)果為：第9～28、30～33、40～44、50～59、68～93、100～133、138～150、157～168、175～180、191～199、208～215、221～234、236～252、256～263、266～272、279～306、312～316位氨基酸(圖5A)；VACV IHD-J G9蛋白可能的抗原表位16個，預測結(jié)果為：第7～23、27～32、47～65、79～89、95～110、116～130、134～144、151～165、175～184、195～205、211～221、223～252、272～277、278～287、292～301、302～309位氨基酸(圖5B)。

GTPVAV41 A16可能的抗原表位有19個，預測結(jié)果為：第12～21、30～33、41～55、62～66、70～81、85～99、103～125、126～146、150～171、176～184、189～196、204～214、236～244、250～253、257～264、269～294、306～342、362～371、373～377位氨基酸(圖5C)；VACV IHD-J A16蛋白可能的抗原表位21個，預測結(jié)果為：第7～12、13～24、29～35、36～44、49～60、86～99、104～119、128～144、145～158、160～171、174～187、189～196、203～212、220～224、236～245、250～263、270～280、282～293、305～322、325～338、361～377位氨基酸(圖5D)。

A.GTPV AV41的G9蛋白；B.VACV IHD-J的G9蛋白；C.GTPV AV41的A16蛋白；D.VACV IHD-J的A16蛋白

2.7 二級結(jié)構(gòu)

通過在線工具SOPMAy對GTPV AV41和VACV IHD-J的G9、A16蛋白二級結(jié)構(gòu)進行預測。結(jié)果顯示，在GTPV AV41的G9蛋白中α-螺旋(h)由123個氨基酸組成，占36.61%；β-折疊(e)由50個氨基酸組成占14.88%，β-轉(zhuǎn)角(t)由19個氨基酸組成占5.65%，無規(guī)則卷曲(c)由144個氨基酸組成，占42.86%。在VACV IHD-J的G9蛋白中α-螺旋(h)由134個氨基酸組成，占39.41%；β-折疊(e)由50個氨基酸組成占14.71%，β-轉(zhuǎn)角(t)由17個氨基酸組成占5.00%，無規(guī)則卷曲(c)由139個氨基酸組成，占40.88%。

在GTPV AV41的A16蛋白中α-螺旋(h)由96個氨基酸組成，占25.46%；β-折疊(e)由80個氨基酸組成占21.22%，β-轉(zhuǎn)角(t)由19個氨基酸組成占5.04%，無規(guī)則卷曲(c)由182個氨基酸組成，占48.28%。在VACV IHD-J的A16蛋白中α-螺旋(h)由101個氨基酸組成，占26.79%；β-折疊(e)由87個氨基酸組成占23.08%，β-轉(zhuǎn)角(t)由23個氨基酸組成占6.10%，無規(guī)則卷曲(c)由166個氨基酸組成，占44.03%。

2.8 保守結(jié)構(gòu)域分析

使用MEME在線工具(域?qū)挾?6～50)預測比對GTPV AV41和VACV IHD-J以及其他幾種痘病毒的G9、A16蛋白保守結(jié)構(gòu)域，結(jié)果顯示，在GTPV AV41的G9蛋白序列中，有9個結(jié)構(gòu)域，最大的結(jié)構(gòu)域長度為50個氨基酸殘基，最小的為6個氨基酸殘基，VACV IHD-J的G9蛋白有10個結(jié)構(gòu)域(圖6)。在GTPV AV41的A16蛋白序列中，有10個結(jié)構(gòu)域，最大的結(jié)構(gòu)域長度為50個氨基酸殘基，最小的為8個氨基酸殘基, VACV IHD-J的A16蛋白有10個結(jié)構(gòu)域(圖7)。

1.VACV IHD-J；2.GTPV Pellor；3.SHPV 17077-99；4.LSDV NI-2490；5.FWPV strain NVSL；6.CMPV M-96；7.MPV Zaire-96-I-16；8.VARV major；9.SWPV KASZA；10.GTPV AV41

1.VACV IHD-J；2.GTPV Pellor；3.SHPV 17077-99；4.LSDV NI-2490；5.FWPV strain NVSL；6.CMPV M-96；7.MPV Zaire-96-I-16；8.VARV major；9.SWPV KASZA；10.GTPV AV41

2.9 疏水性分析與跨膜區(qū)預測

分別使用ProtScale和TMHMM Server v.2.0網(wǎng)站對GTPV AV41和VACV IHD-J的G9、A16蛋白疏水性和跨膜區(qū)進行分析。由分析結(jié)果可知，在GTPV AV41的G9蛋白中，第330位色氨酸(Trp)最高，為3.456，疏水性最強；第84位天冬酰胺(Asn)最低，為-3.200，親水性最強(圖8A)。VACV IHD-J的G9蛋白中，第334位Trp最高，為3.600，疏水性最強；第55位賴氨酸(Lys)最低，為-2.933，親水性最強(圖8B)。GTPV AV41的G9蛋白從318～335位氨基酸是跨膜區(qū)(圖9A)，VACV IHD-J的G9蛋白從322～339位氨基酸是跨膜區(qū)(圖9B)。

在GTPV AV41的A16蛋白中，第351位半胱氨酸(Cys)和第352位亮氨酸(Leu)最高，為3.411，疏水性最強；第275位精氨酸(Arg)最低，為-2.900，親水性最強(圖8C)。VACV IHD-J的A16蛋白中，第351位纈氨酸(Val)最高，為3.156，疏水性最強；第275位精氨酸(Arg)最低，為-2.867，親水性最強(圖8D)。GTPV AV41的A16蛋白從342～361位氨基酸是跨膜區(qū)(圖9C)，VACV IHD-J的A16蛋白從341～363位氨基酸是跨膜區(qū)(圖9D)。

A.GTPV AV41的G9蛋白；B.VACV IHD-J的G9蛋白；C.GTPV AV41的A16蛋白；D.VACV IHD-J的A16蛋白

A.GTPV AV41的G9蛋白；B.VACV IHD-J的G9蛋白；C.GTPV AV41的A16蛋白；D.VACV IHD-J的A16蛋白

2.10 半胱氨酸殘基位點及豆蔻?；稽c比對

通過EMBOSS Needle網(wǎng)站對比GTPV AV41和VACV IHD-J G9、A16蛋白序列中的半胱氨酸殘基位點。由比對結(jié)果可知，GTPV AV41 G9共15個半胱氨酸殘基位點，VACV IHD-J G9共14個半胱氨酸殘基位點(圖10A，黃色)；GTPV AV41 A16共21個半胱氨酸殘基位點，VACV IHD-J A16共20個半胱氨酸殘基位點(圖10B，黃色)。GTPV AV41與VACV IHD-J G9、A16蛋白各有一個豆蔻酰化位點(圖10,紫色)。

圖10 G9(A)、A16(B)蛋白半胱氨酸殘基位點比對結(jié)果

2.11 三級結(jié)構(gòu)

通過Phyre2網(wǎng)站使用同源建模方法分析GTPV AV41 G9、A16蛋白的三級結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示，G9蛋白第39～88位氨基酸序列形成類似于甲烷球菌產(chǎn)生的精氨酸脫羧ase2突變體結(jié)構(gòu)，具有裂解酶的相似功能；第317～334位氨基酸序列形成類似于小鼠的fas/cd95細胞死亡受體跨膜結(jié)構(gòu)域，具有細胞凋亡和跨膜功能。A16蛋白第50～107位氨基酸序列具有鏈霉菌2419-svt2蛋白的晶體結(jié)構(gòu)(apo2型)，是用于生物合成的一種蛋白質(zhì)；第347～361位氨基酸序列具有新穎的跨膜螺旋結(jié)構(gòu)，可以形成跨膜蛋白。

3 討論

本研究通過克隆山羊痘病毒弱毒苗毒株GTPV AV41的G9、A16基因序列并進行測序，將測序得到的G9、A16核苷酸序列翻譯為氨基酸序列，利用生物信息學軟件和在線分析網(wǎng)站將VACV IHD-J以及其他痘病毒的同源序列與GTPV AV41的G9、A16序列進行比對并構(gòu)建分子進化樹，對G9、A16蛋白進行理化性質(zhì)和生物信息學分析。結(jié)果顯示GTPV AV41與VACV IHD-J的G9、A16核苷酸序列以及氨基酸序列的一致性很低且親緣關系較遠。GTPV AV41的G9蛋白是堿性的性質(zhì)穩(wěn)定的蛋白，A16蛋白是堿性的性質(zhì)不穩(wěn)定的蛋白。在G9蛋白中有23個絲氨酸磷酸化位點，5個蘇氨酸磷酸化位點，在A16蛋白中有18個絲氨酸磷酸化位點，9個蘇氨酸磷酸化位點，這些磷酸化位點可以促進該蛋白和其他蛋白相互作用，從而形成多蛋白聚合體，為G9、A16形成二聚體提供了依據(jù)[16]；G9蛋白中的6個酪氨酸磷酸化位點和A16蛋白中的9個酪氨酸磷酸化位點可以影響宿主細胞的信號轉(zhuǎn)導機制，從而控制宿主細胞生長[17]，這些磷酸化位點的識別對于研究蛋白質(zhì)功能有重要作用。G9和A16蛋白的二級結(jié)構(gòu)中以無規(guī)則卷曲和α-螺旋為主。α-螺旋有利于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，無規(guī)則卷曲為凸出結(jié)構(gòu)，大多出現(xiàn)在蛋白質(zhì)表面，有利于形成表位。將G9和A16蛋白二級結(jié)構(gòu)和抗原表位的預測結(jié)果綜合分析發(fā)現(xiàn)，G9蛋白的7～21、139～145、209～214、236～250位氨基酸，A16蛋白的43～57、236～244、249～254位氨基酸存在形成表位的潛力，可以作為優(yōu)勢抗原表位，為以后的疫苗制備提供依據(jù)。G9和A16蛋白的氨基酸序列末端疏水性較強，可以形成跨膜區(qū)域，而且在三級結(jié)構(gòu)預測中有跨膜構(gòu)象，這對病毒吸附、侵染等過程發(fā)揮重要作用[18]。半胱氨酸是蛋白質(zhì)中唯一一個可以形成二硫鍵的氨基酸，使蛋白質(zhì)折疊成穩(wěn)定的三級結(jié)構(gòu)甚至是四級結(jié)構(gòu)，G9蛋白有15個半胱氨酸殘基位點，A16蛋白有21個半胱氨酸殘基位點，這為病毒蛋白形成功能構(gòu)象提供基礎；G9和A16蛋白的N-端還有一個豆蔻酰化位點，這與病毒的復制組裝有關[19]。

由于山羊痘病毒G9、A16蛋白的功能是從痘苗病毒的研究成果中推斷而來，所以把2個病毒的G9、A16蛋白進行了相應的比較。從氨基酸的個數(shù)上來說，GTPV與VACV的A16蛋白氨基酸數(shù)量完全相同，GTPV比VACV的G9蛋白少了4個氨基酸，但兩者對應蛋白的氨基酸序列有著很大的差異。在蛋白的磷酸化位點和抗原表位的預測結(jié)果中發(fā)現(xiàn)GTPV AV41與VACV IHD-J的G9、A16蛋白在位點和個數(shù)上有很大的不同，但有趣的是，在二者的G9、A16蛋白二級結(jié)構(gòu)和保守結(jié)構(gòu)域的預測結(jié)果中無論是在氨基酸折疊類型所占比例和位置，還是保守結(jié)構(gòu)域的個數(shù)，以及構(gòu)成結(jié)構(gòu)域的氨基酸的個數(shù)都非常的相似。再進一步對GTPV AV41和VACV的G9、A16蛋白疏水性和跨膜區(qū)進行對比分析，結(jié)果GTPV AV41的G9、A16蛋白與Wagenaar等[20]發(fā)現(xiàn)的VACV的G9、A16蛋白跨膜區(qū)結(jié)果一致。在半胱氨酸殘基位點的比對中發(fā)現(xiàn)，雖然GTPV AV41與VACV IHD-J的G9、A16蛋白序列差異很大，但在半胱氨酸殘基線性位點上除了GTPV AV41的G9序列第190位半胱氨酸和GTPV AV41的A16序列第351位半胱氨酸與VACV IHD-J不同之外，其他位點上的半胱氨酸和N-端的豆蔻?；稽c都能一一對應，說明蛋白之間的三級構(gòu)象以及作用位點非常相似。

綜上，本研究對GTPV AV41的G9、A16基因進行克隆，并對其序列進行一系列生物信息學分析，為進一步研究G9、A16蛋白提供了基本數(shù)據(jù)資料。同時，將其與VACV同源基因比較，雖然GTPV和VACV的G9、A16蛋白在氨基酸序列上存在很大差異，但兩者具有相對保守的結(jié)構(gòu)域，蛋白跨膜區(qū)、半胱氨酸殘基位點等高級結(jié)構(gòu)也高度相似。因此，山羊痘病毒G9、A16蛋白功能的進一步研究可以參考痘苗病毒的相關研究結(jié)果。