陳興浩，巫首燕，曹佳怡，劉 慶，甘玉芬，張福梅

（1.西北民族大學 生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730030；2.西北民族大學 實驗教學部，甘肅 蘭州 730030；3.甘南牦牛乳研究院，甘肅 合作 747000）

人口老齡化是當前世界各國共同面臨的重大課題。聯合國《2019世界人口展望》[1]顯示：我國自2002年（65歲及以上的老年人口占總人口的7.08%）進入“老齡化社會”，預計2025年、2035年分別進入“老年社會”和“超高齡社會”（ 65歲及以上的老年人口占總人口的14%時，稱之為“老年社會”；當超過20%即進入了“超高齡社會”）。到21世紀中葉將有5億人口超過60歲，步入深度老齡化階段[2]。由于醫(yī)療保健、疫苗接種和衛(wèi)生條件的改善我國老齡化人口規(guī)模將在未來很長一段時間內維持持續(xù)增長[3]。為了積極應對這一世界性難題，我國中共中央、國務院于2019年11月印發(fā)了《國家積極應對人口老齡化中長期規(guī)劃》，推動“健康中國”。探究衰老相關機制，尋找延緩衰老的方法，維持老年人較高的生活質量已成為各行業(yè)的重中之重。

衰老是生物隨著時間的推移，自發(fā)的必然過程，它是復雜的自然現象，表現為結構的退行性變和機能的衰退，適應性和抵抗力減退[4，5]。衰老的相關機制至今尚未完全闡述，國際公認氧化應激是發(fā)生衰老的重要原因之一[6-8]。當機體處于不良外界環(huán)境或隨著年齡的增長導致機體內氧化劑和抗氧化劑的動態(tài)平衡被打破，更有利于氧化劑的產生，將會導致構成細胞組織的各種物質如糖類、脂質、蛋白質、DNA等發(fā)生氧化反應，從而引起變性、交聯、斷裂等氧化傷害，進而引發(fā)疾病?？寡趸瘎┛汕宄杂苫耙种浦|過氧化，調整及改善機體生理功能，從而達到預防及治療慢性疾病的目的[9]。

乳清蛋白（whey protein，WP）利用生產干酪和干酪素的副產物——乳清經分離、濃縮獲得[10]，是國際公認的天然抗氧化劑[11]。乳清蛋白主要包括 β-乳球蛋白、α-乳白蛋白、血清白蛋白、免疫球蛋白和糖巨肽及少量的乳過氧化物酶、乳鐵蛋白、β-微球蛋白、溶菌酶、胰島素樣生長因子（IGF）、λ-球蛋白等[12]。乳清蛋白中不僅含有具有廣譜抗微生物和抗菌特性的組分，乳鐵蛋白還可通過胃蛋白酶產生一種抗菌肽，除具有促進蛋白質合成、礦物質吸收、修復損傷等作用外，還具有廣譜抗菌[13，14]、降低血糖和血脂水平等維持機體健康的作用。

因此，本實驗通過研究牛乳清蛋白體內外抗氧化性，探討其在延緩D-半乳糖誘導的衰老中的作用機制，以期為老年人補充乳清蛋白提高生活質量提供基礎研究數據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雌性昆明小鼠（由蘭州大學基礎醫(yī)學院動物中心提供）。

超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒、丙二醛（MDA）試劑盒購自南京建成生物技術有限公司；VC、D-半乳糖購自大連美侖生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

多功能酶標儀、高速冷凍離心機購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；蛋白印跡免染檢測分析系統(tǒng)購自時代聯想生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 牛乳清蛋白的制備 將鮮牛乳于低溫離心機（4℃），5 000 r/min，離心30 min。獲得上層乳脂部分和下層乳清、乳粒部分。棄去上層乳脂，脫脂乳在室溫下用1M的HCl調至pH 4.6，40℃水浴20 min，8 000 r/min離心20 min（4℃），收集上清液（乳清）。冷凍干燥，-4℃保存?zhèn)溆?。SDS-PAGE電泳對牛乳清蛋白進行分析。

1.3.2 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE）按照BIO-RAD公司TGX and TGX Stain-Free Fast Cast說明配置12% SDS-PAGE膠，取蛋白樣與SDS上樣緩沖液（4×）混合，沸水浴10 min，使蛋白變性；上樣；連接好正負極，起始電壓100 V，約30 min；待其進入分離膠，120 V，60 min，至溴酚藍條帶到達分離膠底部，使蛋白樣品充分分離。取出凝膠直接放在BIO-RAD凝膠成像分析系統(tǒng)的黑板上，調節(jié)好膠的成像面積，選擇protein gel，stain free gel，選擇曝光條件，激活45 s，成像。

1.3.3 牛乳清蛋白體外抗氧化活性的測定 以靈敏度最高的DPPH自由基清除能力測定實驗檢測牛乳清蛋白的抗氧化活性。取樣品溶液2 ml加入等體積0.1 mmol/L DPPH乙醇溶液混勻，避光放置30 min，酶標儀517 nm處測定At。同法取2 ml蒸餾水加入等體積 0.1 mmol/L DPPH乙醇溶液測定吸光度記為A0。取2 ml樣品液加入2 ml乙醇混勻，在517 nm處測定吸光度為Ab，按照以下公式計算DPPH自由基清除能力：

表1 牛乳清蛋白干預衰老小鼠實驗分組

式中：At為樣品溶液與DPPH乙醇溶液混勻所測得的吸光度值；A0為蒸餾水與DPPH乙醇溶液混勻所測得的吸光度值；Ab為樣品溶液與乙醇溶液混勻所測得的吸光度值

1.3.4 牛乳清蛋白體內抗氧化活性的測定

1.3.4.1 衰老動物模型制備。選25～30 g健康成年雌性昆明小鼠30只，頸背部皮下注射10%的D-半乳糖生理鹽水注射液0.25 ml/20 g，每日1次，連續(xù)42 d，制備衰老小鼠。

1.3.4.2 實驗分組。牛乳清蛋白干預衰老小鼠實驗分組（見表1）。

1.3.4.3 指標檢測。乳清蛋白干預7 w后，檢測體重。小鼠斷頭采血，4℃靜置2 h，離心3 500 r/min，15 min。按說明書檢測血清中SOD和MDA。小鼠解剖分離胸腺，稱重。

式中：M1為胸腺重量；M2為小鼠體重

2 結果

2.1 牛乳清蛋白SDS-PAGE電泳結果

乳清蛋白在SDS-PAGE中主要顯示出有4條主要的條帶，相對應Marker主要分子量位于14.4～116KDa，從圖1中可以看出，4條主要的蛋白條帶分別為分子量為14.1 KDa的α-乳白蛋白（α-lactalbumin，α-LA），18 KDa的β-乳球蛋白（β-lactoglobulin，β-LG），免疫球蛋白（immunoglobulin，IgG）裂解的Ig-H（重鏈）和80KDa的乳鐵蛋白（lactoferrin，LF）等。

圖1 牛乳清蛋白SDS-PAGE電泳圖

2.2 牛乳清蛋白體外DPPH自由基清除能力的測定

DPPH是一種穩(wěn)定的自由基，在乙醇溶液中的DPPH呈紫色，在517 nm處有最大光吸收，DPPH自由基清除反應的程度取決于抗氧化劑的清除能力，由于該方法測定簡單，所以廣泛應用于自由基清除能力的測定。

圖2 牛乳清蛋白體外DPPH自由基清除能力測定圖

由圖2顯示，牛乳清蛋白對DPPH自由基的清除能力隨著樣品濃度的增加而升高，在一定濃度內呈量效關系。陽性組VC與BHT對DPPH自由基的清除能力在0～4 mg/ml范圍內明顯高于乳清蛋白，但在牛乳清蛋白4～6 mg/ml時乳清蛋白與陽性組的差別不大，尤其是乳清蛋白和BHT之間差別較小，當濃度為4 mg/ml時，乳清蛋白的清除率為72.26%、BHT的清除率為78.87%、VC的清除率為87.81%；當濃度為6 mg/ml時，乳清蛋白的清除率為79.51%、BHT的清除率為84.34%、VC的清除率為95.33%。

2.3 牛乳清蛋白對衰老小鼠體重的影響

由圖3可知，正常對照組、不同劑量牛乳清蛋白和VC干預衰老小鼠后，體重增長率與干預時間均呈正相關，且正常對照組增長率最高，牛乳清蛋白組和VC陽性對照組體重增長率相似，無統(tǒng)計學差異。與之相對應僅衰老小鼠組體重增長率與干預時間呈負相關，并與其他組間有統(tǒng)計學差異。

圖3 不同劑量牛乳清蛋白干預衰老小鼠體重增長率的變化圖

2.4 牛乳清蛋白對衰老小鼠胸腺指數的影響

胸腺是動物體內重要的淋巴器官，具有重要的免疫作用，同時也是動物體內最先衰老的器官，從動物體內胸腺的比重可從側面看出動物衰老的程度。由圖4顯示，不同劑量牛乳清蛋白和VC干預組衰老小鼠的胸腺指數與正常對照組無統(tǒng)計學差異，而衰老組小鼠胸腺指數下降較大。說明牛乳清蛋白可以延緩衰老過程中免疫功能的降低。

圖4 不同劑量牛乳清蛋白干預衰老小鼠胸腺指數的變化圖

2.5 牛乳清蛋白干預衰老小鼠后，小鼠血清氧化應激標記物的變化

由圖5中結果可知，衰老組（NS）相比其他各組血清中MDA含量明顯增高，而SOD活力卻顯著下降，且均具統(tǒng)計學意義。牛乳清蛋白低劑量組、VC陽性組和正常組相比血清中MDA含量、SOD活力相似，無統(tǒng)計學意義，而牛乳清蛋白高劑量組(CWPH)血清中MDA含量更低，SOD活力更高。說明牛乳清蛋白體內具有較好的抗氧化活性，且高濃度組較VC陽性組抗氧化性更強。

圖5 不同劑量牛乳清蛋白干預衰老小鼠，小鼠血清中SOD活力和丙二醛（MDA）含量的變化圖

3 討論

3.1 牛乳清蛋白體外抗氧化性

DPPH自由基清除能力測定是最常用的體外抗氧化性評價方法。本實驗以VC和BHT為陽性對照，梯度稀釋牛乳清蛋白，發(fā)現在0.5～6 mg/ml范圍內，DPPH自由基清除能力隨牛乳清蛋白濃度的增高而增強。這一結果與Ahmed S Gad[15]和Yong-Eun Kim[16]等研究結果相一致：WP體外抗氧化活性呈劑量依賴。

3.2 牛乳清蛋白體內抗氧化性

機體細胞內，新陳代謝過程會產生自由基，同時體內抗氧化系統(tǒng)會有效地消除自由基。然而，由于自由基的過量產生，或抗氧化劑的消耗，體內這種平衡被打破，細胞暴露于高水平的自由基壓力下，機體發(fā)生氧化應激，導致諸如脂質過氧化、DNA鏈斷裂、氨基酸外消旋或脫羧、酶功能障礙和碳水化合物氧化分解[17]等細胞損傷。而持續(xù)的氧化應激被認為是衰老及其相關疾病[18-20]，癌癥[21,22]、心血管疾病[23,24]、糖尿病[25,26]等多種慢性疾病的致病因素。

抗氧化物活性物質可以提高機體內超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽還原酶(GSH)的活性，降低丙二醛(MDA)的含量，從而抑制由此誘導的衰老[27]。WP 的β-乳球蛋白[28]不僅自身具有較強的清除自由基、抗氧化的活性，而且在體內可以水解成多種抗氧化肽段；另外，乳鐵蛋白能抑制由鐵誘導的脂質過氧化產物硫代巴比妥酸和丙二醛的生成；乳白蛋白、乳鐵蛋白等富含胱氨酸殘基，能通過消化道進入細胞膜，還原成 GSH 的原料半胱氨酸，維持細胞和組織 GSH 水平，從而增強機體抗氧化能力[29]。

本實驗根據小鼠血清內MDA的含量反映機體脂質過氧化速度、強度和組織過氧化程度，SOD的活力反映出機體內清除自由基的能力，也就是機體體內抗氧化的能力。實驗結果證明，衰老組小鼠MDA含量升高，SOD活性則降低，而添加牛乳清蛋白后與衰老組小鼠各項指標結果相反，且有顯著差異；牛乳清蛋白干預兩組與VC陽性對照組結果無顯著差異。證明牛乳清蛋白在體內具有抗氧化活性，是一種天然、無害、營養(yǎng)價值高的抗氧化補充劑。

3.3 牛乳清蛋白對衰老小鼠免疫力的影響

大量研究顯示，乳清蛋白中的乳鐵蛋白和糖巨肽等成分均具有較好的免疫調節(jié)作用[30]。胸腺是機體重要的免疫器官，主要參與細胞免疫。胸腺指數可以在一定程度上反應機體免疫功能的強弱。本研究顯示，不同劑量牛乳清蛋白和VC干預組小鼠的胸腺指數與正常對照組無統(tǒng)計學差異，而衰老組小鼠胸腺指數下降較大。說明牛乳清蛋白可以延緩衰老過程中免疫功能的降低。

綜上所述，該研究結果證明牛乳清蛋白和VC比較，體內外抗氧化和增強機體免疫力等作用相仿，且在補充量為400 mg/kg時部分指標優(yōu)于VC。表明牛乳清蛋白可以作為一種天然、無害、營養(yǎng)價值高的抗氧化補充劑，并延緩D-半乳糖誘導的衰老。該研究為提高老年人群合理補充牛乳清蛋白，提高生活質量提供了基礎研究數據。