楊鄭州，侯保朝，謝曉娜，郭炳豪

（百色學(xué)院農(nóng)業(yè)與食品工程學(xué)院，廣西百色533000）

0 引 言

近年來，微生態(tài)制劑作為一種新興的保健品，對增強機體免疫力、促進宿主健康起到了一定的作用，由于它的安全無副作用，已被大多數(shù)人所肯定[1-2]。當(dāng)益生菌（probiotics）黏附于宿主腸道內(nèi)時，對調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)失調(diào)、促進機體免疫功能、發(fā)揮其益生功能特性起著重要的作用。黏附性能作為益生菌的重要特點之一，已被越來越多的學(xué)者所重視[3]。Collins 等提出確定益生菌株的標(biāo)準(zhǔn)是，益生菌黏附和定植于宿主腸道的能力，因為益生菌株必須對上皮細胞組織具有黏附性才能長期在腸道中存活并發(fā)揮其作用[4]。

副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）作為益生菌可應(yīng)用于食品以及營養(yǎng)保健品中，它能黏附于宿主腸道上皮細胞上，保證了其發(fā)揮益生功能[5-6]。國內(nèi)外的一些研究表明，乳酸菌通過黏附素與腸黏膜上皮細胞受體黏附，維持腸道菌群平衡及發(fā)揮益生功能，對于維護胃腸道正常的生態(tài)環(huán)境穩(wěn)定起重要作用[7-8]。因此，基于基因組學(xué)注釋乳酸菌黏附作用相關(guān)基因并探究其黏附作用，將為研究乳酸菌的益生功能提供新的理論基礎(chǔ)。本課題選用分離自西藏地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品的L. paracasei 作為乳酸菌的代表，篩選出高黏附性能的目標(biāo)菌株，利用GO 分類篩選Human Genome U133 Plus 2.0 Array 基因表達譜芯片中的黏附相關(guān)基因，同時通過研究去除L. paracasei 表面黏附素對黏附性的影響情況，并研究其對病原菌黏附的抑制作用，為深入揭示益生菌黏附機制奠定重要基礎(chǔ)，也為微生態(tài)制劑的研發(fā)與生產(chǎn)提供了深層次的理論依據(jù)，具有重要的科學(xué)理論意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

20 株分離自西藏地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品的L. para?casei；大腸桿菌（Escherichia coli）K 8，丹麥丹尼斯克公司；人結(jié)腸癌細胞Caco-2，中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究所；Trizol Reagent，Invitrogen 公司；DMEM，GIB?CO 公司；青霉素、鏈霉素，大連美羅大藥廠；PBS 磷酸鹽緩沖液、焦碳酸二乙酯（DEPC）、MRS 培養(yǎng)基，北京索萊寶生物科技有限公司；細菌基因組DNA 快速提取試劑盒，BioTeKe公司；胎牛血清、胰蛋白酶消化液，TBD 公司；細胞培養(yǎng)瓶、細胞培養(yǎng)板，Orange公司。

1.2 儀器與設(shè)備

各種規(guī)格 Eppondorf 移液器、HF90 型 CO2培養(yǎng)箱，上海力申科學(xué)儀器有限公司；AE31 型倒置顯微鏡，麥克奧迪實業(yè)集團有限公司；BCN1360 型生物潔凈工作臺，北京東聯(lián)哈爾儀器制造；低溫冷凍離心機，上海離心機械研究所；微量臺式離心機，美國Beck?man 公司；快速混勻器，姜堰市新康醫(yī)療器械有限公司；Model 680 酶標(biāo)儀，美國 Beckman 公司；YDS-10 型液氮罐，成都金鳳液氮容器有限公司；DH-101 恒溫鼓風(fēng)干燥箱，青島海爾集團公司；電熱恒溫水浴鍋，天津泰斯特儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 高黏附性能菌株的篩選

將活化后活菌數(shù)為1×107CFU/mL 的1 mL 菌液在 4 ℃ 條件下 10 000 r/min 離心 5 min，經(jīng)無菌 PBS 緩沖液洗滌兩次后重懸于DMEM 高糖培養(yǎng)液。將Ca?co-2 細胞接種于六孔板中，于加菌前24 h 更換不含青鏈霉素的細胞培養(yǎng)液，將細胞培養(yǎng)至極化狀態(tài)并加入含菌細胞培養(yǎng)液，置于37 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)2 h，每個樣品設(shè)置三個平行。共培養(yǎng)后，使用PBS緩沖液沖洗掉未黏附上的菌體，胰酶消化收集細胞并稀釋涂布，在37 ℃條件下置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h 后，平板計數(shù)。以黏附率為評價指標(biāo)篩選出高黏附性能的目標(biāo)菌株，黏附率公式如下所示：

黏附率 (%) = 100× lg 黏附的菌落數(shù)(CFU) / lg 加入的菌落數(shù)(CFU)

1.3.2 黏附基因的注釋

本實驗中采用Affymetrix 公司的U133 Plus 2.0 表達譜芯片，由上海生物芯片有限公司-生物芯片上海國家工程研究中心提供。通過GO 分類分析基因芯片中的黏附相關(guān)基因。差異基因篩選標(biāo)準(zhǔn)是：基因變化（change）為I 或MI，log ratio≥1，實驗組檢測值（De?tection）為P 的為上調(diào)基因；change 為D 或MD，log ra?tio≤-1，Detection為P 的為下調(diào)基因。

1.3.3 掃描電鏡觀察處理菌體的情況

將經(jīng)過菌體黏附實驗后的細胞先用2.5%（v/v）的戊二醛4 ℃固定1.5 h。固定后與經(jīng)過酶和化學(xué)法處理過的目標(biāo)菌株一起用0.1mol/L pH7.2 的磷酸鹽沖洗兩次，每次10min。分別用50%、70%、90%、100%的乙醇脫水兩次，每次10～15min。用100%乙醇∶叔丁醇=1∶1 的溶液以及純叔丁醇處理樣品各一次，每次15 min。冷凍干燥4 h。掃描電鏡觀察經(jīng)過酶和化學(xué)法處理過的目標(biāo)菌株。

1.3.4 處理的菌體對Caco-2細胞黏附影響

Caco-2 細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期后，PBS 緩沖液洗2 次，胰酶消化，用DMEM 培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度為5.0×104個/mL。將細胞接種于6 孔板中，培養(yǎng)15 d 后用無抗生素的PBS 緩沖液漂洗2 次，每孔分別加入1 mL DMEM 培養(yǎng)液及1 mL 處理過的目標(biāo)菌株，在37 ℃下，含5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)共同培養(yǎng)2 h。PBS洗3次，4%多聚甲醛固定30 min，PBS 洗5 次。進行革蘭氏染色。進行鏡檢，隨機讀取20 個視野100 個細胞黏附的總菌數(shù)，其值即為每100 個細胞上黏附菌數(shù)的平均數(shù)及標(biāo)準(zhǔn)差（X±SD）。

1.3.5 對病原菌黏附的抑制作用

在96 孔板中，每孔加入細胞懸液100 μL。設(shè)置三個組別分析對病原菌的競爭、排斥以及置換作用。競爭組是將Caco-2 細胞、目標(biāo)菌和經(jīng)過FITC 標(biāo)記的大腸桿菌（Escherichia coli）K 8 在37 ℃厭氧條件下共同孵育1 h；排斥組將Caco-2 細胞和目標(biāo)菌在厭氧條件下共孵育1 h 后，1 000 r/min 離心去上清，再加入經(jīng)FITC 標(biāo)記的E. coli K 8 共孵育1 h。置換組是將Ca?co-2 細胞和經(jīng)FITC 標(biāo)記的E. coli K 8 厭氧條件下共孵育1 h 后，離心去上清后再加入目標(biāo)菌，厭氧條件下共孵育1 h。三組樣品孵育完成后，1 000 r/min 離心去上清。使用PBS洗滌沉淀3次后，用PBS重懸至黑色的96 孔板，避光靜置2 h。每個培養(yǎng)孔中加入0.1 mL胰酶作用5 min，待細胞完全脫落，加入0.4 mL 胰酶使培養(yǎng)液終止反應(yīng)。收集液體，用酶標(biāo)儀測定其熒光強度，每組設(shè)置6 個重復(fù)，每個培養(yǎng)孔為1 個重復(fù)。黏附率公式如下所示：

黏附率(%) = 100×A2/A1

式中：A1為無目標(biāo)菌存在的情況下，黏附在Ca?co-2 細胞上的E. coli K 8 相對熒光強度；A2為存在目標(biāo)菌的情況下，黏附在Caco-2 細胞上的E. coli K 8 相對熒光強度。

1.3.6 統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)均采用SPSS 18.0 軟件進行t 檢驗及方差分析（ANOVA），檢測差異顯著性結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 高黏附性能菌株的篩選

乳酸菌是一類能夠維持腸道微生態(tài)平衡，對宿主起有益作用的益生菌。乳酸菌必須黏附于宿主腸道細胞，才能與正常菌群一起構(gòu)成生物屏障，通過定植保護作用發(fā)揮生理功能[9]。目前國內(nèi)外常用體外模型來檢測乳酸菌黏附于腸道的能力[10]。Caco-2 細胞是體外研究乳酸菌黏附性能的最常見的模式細胞[11]，具有與小腸相同的維持細胞極性的重要結(jié)構(gòu)（如微絨毛和緊密連接等），能表達正常人腸細胞的形態(tài)和某些生理特征。

如圖1 所示，分離自西藏地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品的20 株 L. paracasei 均能黏附于 Caco-2 細胞，不同菌株的黏附水平之間存在差異性，L. paracasei BS 08 黏附能力顯著高于其他L. paracasei 菌株，表明乳酸菌對腸道細胞黏附有種屬及菌株特異性。有研究報道，甘露糖和Ca2+在一些乳酸菌的黏附過程中起重要作用，乳酸菌細胞壁中的脂磷壁酸以及乳酸菌發(fā)酵液中菌體分泌的某些蛋白也能促進乳酸菌對腸上皮細胞的黏附[12]。本實驗采用的是培養(yǎng)至對數(shù)生長期的L. paracasei 菌株，各菌株均具有黏附能力，說明L. paracasei 對Ca?co-2 細胞的黏附不是或不完全是由發(fā)酵液中的蛋白質(zhì)介導(dǎo)的，具體的黏附機理還有待于進一步的實驗研究。

圖1 20株L.paracasei 的黏附率

2.2 黏附作用基因分析

本研究所用的人基因表達譜芯片涵蓋47 000 個轉(zhuǎn)錄本，代表38 500 個人類基因。通過該芯片雜交檢測了 L. paracasei BS 08 與 Caco-2 細胞作用 2 h 后的基因表達變化，根據(jù)GO 分類標(biāo)準(zhǔn)，將得到的差異表達基因分為24 類。其中有18 個涉及黏附作用的相關(guān)基因（見表1）。

通過比對可知，L. paracasei BS 08 的基因組中存在18 個與黏附相關(guān)的基因。黏附相關(guān)基因均屬于黏附相關(guān)的分子家族，如整合素家族、免疫球蛋白超家族、選擇素家族、黏蛋白樣血管地址素、黏著素或鈣離子依賴的細胞黏附分子家族等[13]。上述18 個基因中的prgB/asc10、EF0485、EF0149、Asa1、efaA、Ace、srtC、ebpC、ebpB、lap、esp、clpC 均屬于免疫球蛋白超家族，是淋巴細胞抗原的配基，也可與CD6和NgCAM 等蛋白結(jié)合[14]。而clpC 既是整合素家族中白細胞黏附受體組的配體，又同時屬于免疫球蛋白超家族。還有錳離子依賴或與整合素家族相互作用的細胞黏附分子。

2.3 掃描電鏡觀察處理后的菌體形態(tài)

黏附素是存在于微生物的菌毛、細胞壁、外膜蛋白、鞭毛、莢膜及小絲狀體的一類與微生物的黏附密切相關(guān)的特殊物質(zhì)，可能是蛋白質(zhì)、多肽、糖蛋白、糖脂和多糖或單糖，是一種具有多種結(jié)構(gòu)和功能的多樣化分子。許多研究表明菌體的表面成分，即表面蛋白，胞外多糖和磷壁酸，是影響菌體與細胞之間黏附的黏附素。而之前的研究大多關(guān)注去除這些菌體表面黏附素后，利用體外黏附模型觀察菌體黏附細胞數(shù)的增減[15]。乳酸桿菌和宿主腸上皮細胞的黏附已經(jīng)被證實與乳酸菌體表面成分作用有關(guān)，如胞外多糖（exopolysaccharides, EPS）、脂磷壁酸（lipoteichoic acid,LTA）和表面蛋白（surface layer protein, SLP）等，其中表面蛋白起著關(guān)鍵性的作用[16]。

由圖 2 d 可以看出，L. paracasei BS 08 為桿狀，表面平滑，處理組與非處理組并無明顯差異。無處理組的菌體長度大約為3.3 μm，經(jīng)過處理以后L. paracasei BS 08的菌體長度分別約為3.2 μm（圖2 a），3.5 μm（圖2 b）和3.5 μm（圖2 c），所以經(jīng)過處理以后并沒有引起菌體表面出現(xiàn)異常形態(tài)或者造成菌體的斷裂。但是我們可以較明顯的看到，三個處理組中的菌體都呈聚集狀態(tài)，而無處理組的菌體都是獨立存在的，說明三種處理都會增加菌體表面的黏性。

表1 黏附作用相關(guān)基因

圖2 掃描電鏡（×5000）下觀察處理后的L. paracasei BS 08的形態(tài)特征

2.4 L. paracasei BS 08對Caco-2細胞的黏附能力

隨機選取20 個視野，記錄100 個細胞黏附的菌體總數(shù)（見圖3）。從圖中可以看出，在去表面蛋白組和去胞外多糖組中，菌體與細胞的黏附數(shù)都顯著低于無處理組（P<0.01），說明表面蛋白和胞外多糖都是影響菌體與細胞之間黏附的主要因素。對于兩個處理組之間的比較可以看出，去表面蛋白組的黏附數(shù)顯著地低于去胞外多糖組（P<0.01），說明表面蛋白對菌體與細胞黏附的影響顯著地大于胞外多糖。

圖3 化學(xué)和酶處理對L.paracasei BS 08 黏附Caco-2 細胞的影響（×400）

乳酸菌表面存在SLP，這種蛋白呈單分子晶體排列結(jié)構(gòu)，具有方形或六邊形對稱結(jié)構(gòu)，與菌體黏附腸上皮細胞有關(guān)[17-18]。乳酸菌分泌的胞外多糖可以提高菌株對腸道表面的非特異性黏附能力，研究顯示乳酸菌合成的胞外多糖與細菌聚集有密切的聯(lián)系，細菌聚集是生物膜形成的一個整合的過程，而生物膜的形成對黏附有推動作用[19]。此研究去除菌體表面蛋白，去表面蛋白組與對照組相比黏附數(shù)顯著減少，說明L.paracasei BS 08 的表面蛋白在菌體與細胞黏附的過程中確實起到了重要的作用。且去除菌體表面的胞外多糖后，能顯著減低菌體與細胞之間的黏附，說明L.paracasei BS 08 的胞外多糖對菌體與細胞之間的黏附起到了一定的作用，但是不如去表面蛋白組黏附作用效果顯著。從掃描電鏡的圖中我們也可以看出，菌體在去除胞外多糖后聚集成塊，而非處理組的菌體獨立存在，也證明了胞外多糖與細菌的聚集有一定的聯(lián)系。

2.5 L.paracasei BS 08對病原菌黏附作用的影響

對于益生菌的作用機理，黏附是其發(fā)揮益生作用的前提，經(jīng)過本研究發(fā)現(xiàn)L. paracasei BS 08 對Caco-2細胞有極強的黏附力，而且L. paracasei BS 08 能顯著降低E. coli K 8 對Caco-2 細胞的侵襲能力和結(jié)合能力（見圖4）。本研究發(fā)現(xiàn)L. paracasei BS 08 能通過競爭、排斥、置換作用顯著抑制E. coli K 8 對Caco-2 細胞的黏附作用。雖然不同乳酸菌對腸道致病菌的黏附抑制作用機制不同，但是很多乳酸菌抑制腸致病菌黏附腸上皮細胞都是通過排斥、競爭或置換作用實現(xiàn)[20]。

L. paracasei BS 08 黏附于腸上皮細胞的過程中，它作為一種細胞外的刺激因素必然會引起靶細胞的跨膜信號傳導(dǎo)，啟動靶細胞內(nèi)的生理生化反應(yīng)過程。一般認(rèn)為，腸致病性大腸桿菌（EPEC）的黏附過程中通過1，4，5-三磷酸肌醇（IP3）受體系統(tǒng)而觸發(fā)胞內(nèi)鈣儲池釋放Ca2+，啟動蛋白磷酸化反應(yīng)，引起腸上皮細胞刷狀緣微絨毛局部變性，細胞與EPEC 黏附接觸處的細胞骨架聚集，胞膜形成杯狀結(jié)構(gòu)。本實驗檢測到的18 個黏附相關(guān)基因所編碼的蛋白可能是L. paracasei BS 08 的黏附受體，通過與菌體的相互作用刺激細胞的跨膜信號傳導(dǎo)，從而抑制病原菌對宿主的黏附作用。

圖4 L.paracasei BS 08對E.coli K 8黏附到Caco-2細胞的影響

3 結(jié) 論

通過比較20 株分離自西藏傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品的L.paracasei 菌株對Caco-2 細胞的黏附性能，發(fā)現(xiàn)黏附性具有菌株特異性，篩選出高黏附性能的L. paracasei BS 08 為目標(biāo)菌株。在通過化學(xué)和酶處理去除表面黏附素后，菌體表面并未出現(xiàn)異常；L. paracasei BS 08 能黏附于Caco-2 細胞的周圍和表面，并且黏附能力良好。而去表面蛋白組和去胞外多糖組都引起菌體黏附數(shù)的顯著下降，去表面蛋白組引起菌體黏附數(shù)的下降顯著地低于去胞外多糖組，說明表面蛋白對菌體的黏附影響更明顯。通過基因芯片分析注釋到了18 個黏附相關(guān)基因，包括 prgB/asc10、EF0485、EF0149、Asa1、efaA、Ace、srtC、ebpC、ebpB、lap、esp、clpC 等，并且L. paracasei BS 08 可以通過競爭、排斥和置換三種方式對病原菌E. coli K 8 的黏附具有顯著地抑制作用。此研究為深入揭示益生菌黏附機制奠定基礎(chǔ)，同時為開發(fā)應(yīng)用微生物制劑提供理論參考。