李麗梅，馮云霄，何近剛，錢 訓(xùn)，張少軍，關(guān)軍鋒,*

（1.河北省農(nóng)林科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全研究中心，河北 石家莊 050051；2.河北省農(nóng)林科學(xué)院遺傳生理研究所，河北 石家莊 050051）

梨酒以梨為原料，經(jīng)酵母發(fā)酵而成。酵母是釀造果酒的關(guān)鍵因素之一，其發(fā)酵特性直接影響著果酒的品質(zhì)[1-3]。當(dāng)前我國果酒生產(chǎn)所用酵母大多為葡萄酒發(fā)酵專用酵母，主要針對葡萄酒釀造所選育[4-6]。梨酒發(fā)酵酵母的篩選[7-8]尚處于實(shí)驗(yàn)室研究階段，沒有實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。關(guān)于葡萄酒釀酒酵母對梨酒品質(zhì)和抗氧化性能的影響目前報(bào)道較少，李麗梅等[9-11]研究確定了不同酵母發(fā)酵的不同品種梨、不同部位梨釀制梨酒中具有抗氧化功效的酚類物質(zhì)，但未涉及其他成分測定；趙國群等[12]采用主成分分析法確定了影響梨酒品質(zhì)的主要理化指標(biāo)，但未涉及梨酒抗氧化性能評價(jià)。本實(shí)驗(yàn)研究了不同酵母對發(fā)酵梨酒中還原糖、總酸、多酚、總黃酮含量以及DPPH自由基清除能力、羥自由基清除能力和鐵還原力的影響，并通過對相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行因子分析，建立了梨酒綜合品質(zhì)評價(jià)體系，并采用逐步回歸分析建立了評價(jià)梨酒綜合品質(zhì)的理論模型，期望通過此模型，簡化梨酒的評價(jià)指標(biāo)，同時為篩選適宜的釀酒酵母提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料、菌株與試劑

新鮮‘雪花’梨于成熟期采摘于河北省趙縣范莊‘雪花’梨種植基地。

釀酒酵母LA-BA、F33、2323、LA-PE、LA-RA、X16、LA-MA、EC1118、KD、F15、BO213、LA-DE、R-HST、LA-EC、RC212 法國LAFFORT公司。

酒石酸鉀鈉 天津博迪化工股份有限公司；碳酸鈉、沒食子酸、無水葡萄糖 生工生物工程（上海）股份有限公司；硫酸銅、鐵氰化鉀、硫酸亞鐵 天津市永大化學(xué)試劑有限公司；氫氧化鈉 天津市大陸化學(xué)試劑廠；亞鐵氰化鉀 天津市北辰驊躍化學(xué)試劑有限公司；乙醇（色譜純）、4-甲基-2-戊醇（色譜純）天津市康科德科技有限公司；Folin-Ciocalteu試劑北京酷來搏科技有限公司；硝酸鋁 山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司；蘆丁、水楊酸 上海BBI生命科學(xué)有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH） 上海源葉生物科技有限公司；過氧化氫、三氯乙酸、亞硝酸鈉、亞甲基藍(lán)天津市大茂化學(xué)試劑廠；三氯化鐵 北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

GC-2010氣相色譜儀、UV-2600紫外-可見分光光度計(jì)日本島津公司；ST 3100 pH計(jì) 美國奧豪斯公司。

1.3 方法

1.3.1 梨的前處理

‘雪花’梨采收后立即切分，去除果心后榨取果汁。加入蔗糖調(diào)整果汁糖度至22 °Brix，然后接種不同的市售商品化酵母，進(jìn)行乙醇發(fā)酵，待糖度不再下降時結(jié)束發(fā)酵，經(jīng)倒罐、靜置、自然澄清，得到不同的‘雪花’梨發(fā)酵酒。對成品酒進(jìn)行各指標(biāo)測定。

1.3.2 還原糖、總酸質(zhì)量濃度、pH值的測定與糖酸比的計(jì)算

參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[13]，分別采用直接滴定法和電位滴定法測定梨酒的還原糖、總酸質(zhì)量濃度。以還原糖含量/總酸含量計(jì)算得出糖酸比。采用ST 3100 pH計(jì)測定梨酒pH值。

1.3.3 總酚質(zhì)量濃度的測定

參照鞠志國[14]的改進(jìn)Folin-Ciocalteu法測定梨酒總酚質(zhì)量濃度，以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，于765 nm波長處測定OD值，計(jì)算總酚質(zhì)量濃度。

1.3.4 總黃酮質(zhì)量濃度的測定

參照趙玉平等[15]的方法測定梨酒總黃酮質(zhì)量濃度，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，于510 nm波長處測定OD值，計(jì)算總黃酮的質(zhì)量濃度。

1.3.5 DPPH自由基清除率的測定

參考Takako等[16]的方法測定梨酒DPPH自由基清除率，按下式計(jì)算。

式中：A0為DPPH-甲醇溶液的吸光度；Ai為樣品溶液的吸光度。

1.3.6 羥自由基清除能力的測定

參照馬曉華等[17]的方法測定并計(jì)算梨酒羥自由基清除率。以不同濃度VC為對照，計(jì)算羥自由基清除率，得出標(biāo)準(zhǔn)曲線。利用羥自由基清除率，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出每毫升梨酒相當(dāng)VC的質(zhì)量，以表征羥自由基清除能力（單位mg/mL）。

1.3.7 還原力的測定

采用鐵氰化鉀法[18]測定梨酒還原力。

1.3.8 乙醇體積分?jǐn)?shù)的測定

參照GB 5009.225—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 酒中乙醇濃度的測定》[19]，采用氣相色譜法測定梨酒中乙醇體積分?jǐn)?shù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS統(tǒng)計(jì)分析軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行Duncan法樣本間差異顯著性分析、Pearson相關(guān)性分析，同時進(jìn)行因子分析、逐步回歸分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同酵母釀制梨酒的品質(zhì)

表 1 不同酵母釀制梨酒的還原糖、總酸、糖酸比和pH值比較Table 1 Comparison of reducing sugar, total acid, sugar/acid ratio and pH among pear wines fermented with different yeasts

如表1所示，不同梨酒的還原糖質(zhì)量濃度差異較大，變異系數(shù)為33.9%。其中LA-BA梨酒的還原糖質(zhì)量濃度最高，為2.95 g/L，LA-RA梨酒最低，為0.97 g/L。供試?yán)婢频倪€原糖質(zhì)量濃度均低于4 g/L，說明本研究所選用酵母對梨的適應(yīng)性較好，能夠比較完全地將糖分轉(zhuǎn)化為乙醇。不同梨酒的總酸質(zhì)量濃度變異系數(shù)為26.1%，其中LA-BA梨酒的總酸含量最高，為7.43 g/L，LA-MA梨酒最低，為2.81 g/L。不同梨酒糖酸比的變異系數(shù)為18.9%，糖酸比最高的梨酒由F33酵母釀制，最低的由BO213酵母釀制。LA-BA梨酒相對于其他梨酒含有更多的糖和酸，但兩者比較平衡，糖酸比適中。除LA-BA梨酒的pH值最低（3.82）外，其余梨酒的pH值均大于4，其中RC212梨酒的pH值最高，為4.35。不同梨酒pH值差異很小，變異系數(shù)僅為3.1%。說明酵母雖然對梨酒的pH值有一定影響，但產(chǎn)生的差異較小。

2.2 不同酵母對梨酒乙醇含量的影響

如表2 所示， 不同梨酒的乙醇體積分?jǐn)?shù)在12.36%～13.26%，變異系數(shù)僅為2.0%，KD梨酒的乙醇體積分?jǐn)?shù)最高，為13.26%，LA-BA梨酒的乙醇體積分?jǐn)?shù)最低，為12.36%，兩者的乙醇體積分?jǐn)?shù)相差0.9%。本研究中梨酒的乙醇體積分?jǐn)?shù)和市售葡萄酒相當(dāng)，說明所選用酵母盡管是葡萄酒的釀酒酵母，但對梨的適應(yīng)性好，發(fā)酵產(chǎn)酒能力均較強(qiáng)，適于釀制梨酒。

表 2 不同酵母釀制梨酒的乙醇含量Table 2 Alcohol contents in pear wines fermented with different yeasts

2.3 不同酵母釀制梨酒的抗氧化特性

表 3 不同酵母釀制梨酒的抗氧化能力比較Table 3 Comparison of antioxidant capacity among pear wines fermented with different yeasts

如表3所示，不同酵母釀制梨酒的多酚和總黃酮質(zhì)量濃度不同，變異系數(shù)分別為10.3%和32.4%。其中LA-BA梨酒的多酚和總黃酮質(zhì)量濃度均最高，分別為211 μg/mL和208 μg/mL，LA-EC梨酒的多酚質(zhì)量濃度最低，為155 μg/mL；RC212梨酒的黃酮質(zhì)量濃度最低，為67 μg/mL。不同梨酒的羥自由基清除能力差異較大，變異系數(shù)為47.5 %。F33梨酒的羥自由基清除能力最強(qiáng)，為0.899 mg/mL，LA-MA梨酒的羥自由基清除能力最弱，為0.196 mg/mL。不同梨酒的DPPH自由基清除率和鐵還原力的變異系數(shù)分別為23.0%和17.4%，其中LA-BA梨酒表現(xiàn)突出，DPPH自由基清除率和鐵還原力均最強(qiáng)，而RC212梨酒則表現(xiàn)最差，兩者均最弱。說明LA-BA梨酒在抗氧化性能方面表現(xiàn)突出，而RC212梨酒則較差。

2.4 相關(guān)性分析結(jié)果

為了研究各變量間的關(guān)系，對梨酒的多酚質(zhì)量濃度、總黃酮質(zhì)量濃度、羥自由基清除能力、pH值、鐵還原力、還原糖質(zhì)量濃度、總酸質(zhì)量濃度、糖酸比和DPPH自由基清除率這9 個變量進(jìn)行相關(guān)性分析。

表 4 不同變量的相關(guān)性分析Table 4 Correlation analysis among different variables

如表4 所示，多酚質(zhì)量濃度與黃酮質(zhì)量濃度、鐵還原力、D P P H 自由基清除率呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01）；黃酮質(zhì)量濃度與鐵還原力、還原糖質(zhì)量濃度、總酸質(zhì)量濃度、DPPH自由基清除率呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），與羥自由基清除能力、pH值呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）；鐵還原力與還原糖質(zhì)量濃度、總酸質(zhì)量濃度、DPPH自由基清除率呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01）；還原糖質(zhì)量濃度與總酸質(zhì)量濃度呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），與糖酸比、DPPH自由基清除率呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）；總酸質(zhì)量濃度與DPPH自由基清除率呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01）；pH值與總酸質(zhì)量濃度呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01），與鐵還原力、還原糖質(zhì)量濃度、DPPH自由基清除率呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。

2.5 對不同酵母釀制梨酒的因子分析結(jié)果

由于不同梨酒的乙醇體積分?jǐn)?shù)變異系數(shù)小，提取系數(shù)較小，因此在做因子分析時剔除了乙醇體積分?jǐn)?shù)這個變量。經(jīng)因子分析，提取各個因子的公因子方差，可知提取系數(shù)均大于0.7，其中對多酚的提取系數(shù)最低，為0.749，對糖酸比的提取系數(shù)最高，為0.975（表5）。

表 5 公因子方差Table 5 Common factor variance

通過因子分析，共提取了3 個特征值大于1.0的公因子，累積方差貢獻(xiàn)率達(dá)到89.939%（表6），說明這3 個公因子能夠很好地解釋所有變量。

通過正交旋轉(zhuǎn)法得到旋轉(zhuǎn)成分矩陣（表6）。各因子選取載荷值絕對值大于0.700的指標(biāo)作為解釋變量。F1的方差貢獻(xiàn)率為38.970%，解釋變量包括pH值、還原糖質(zhì)量濃度、總酸質(zhì)量濃度，反映了梨酒的營養(yǎng)成分，命名為營養(yǎng)因子；F2的方差貢獻(xiàn)率為33.975%，解釋變量包括多酚質(zhì)量濃度、黃酮質(zhì)量濃度、羥自由基清除能力、DPPH自由基清除率，反映了梨酒的抗氧化能力，命名為功能因子；F3的方差貢獻(xiàn)率為16.993%，解釋變量為糖酸比，反映了梨酒的風(fēng)味，命名為風(fēng)味因子。公因子方差貢獻(xiàn)率是其權(quán)重，體現(xiàn)了各因子在評價(jià)中的作用大小，可見營養(yǎng)因子和功能因子的作用接近，風(fēng)味因子的作用較小。

表 6 3 個公因子的初始特征值、方差貢獻(xiàn)率、累計(jì)方差貢獻(xiàn)率、及各變量在不同因子中的載荷值Table 6 Initial eigenvalues, variance contribution rates, accumulative variance contribution rates and loading matrix of three common factors

2.6 不同梨酒的綜合因子得分及其品質(zhì)評價(jià)結(jié)果

以多酚質(zhì)量濃度、總黃酮質(zhì)量濃度、還原糖質(zhì)量濃度、總酸質(zhì)量濃度、糖酸比、DPPH自由基清除率、鐵還原力、羥自由基清除能力、pH值為變量，通過SPSS分析軟件的因子分析法可直接得出各因子的得分值FAC1、FAC2和FAC3，依據(jù)各個因子得分值與綜合因子得分的回歸模型公式，采用公式F＝38.970%×FAC1+33.975%×FAC2+16.993%×FAC3計(jì)算不同梨酒的綜合因子得分（F）。如表7所示，根據(jù)綜合因子得分，各酵母釀造梨酒排序依次為：LA-BA＞F33＞2323＞LA-PE＞LA-RA＞X16＞LA-MA＞EC1118＞KD＞F15、BO213＞LA-DE＞R-HST＞LA-EC＞RC212?？芍狶A-BA所釀梨酒的綜合品質(zhì)最好，RC212梨酒較差，其他梨酒的綜合品質(zhì)則介于兩者之間。

對梨酒的綜合因子得分和各變量之間做相關(guān)性分析表明，梨酒的綜合因子得分與多酚質(zhì)量濃度、總黃酮質(zhì)量濃度、鐵還原力、還原糖質(zhì)量濃度、總酸質(zhì)量濃度和DPPH自由基清除率均呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），與pH值呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01）（表8），說明營養(yǎng)成分含量越高，抗氧化能力越強(qiáng)，pH值越低，梨酒的綜合得分越高。

表 7 不同酵母釀制梨酒的綜合因子得分Table 7 Comprehensive scores of pear wine fermented with different yeasts

表 8 綜合因子得分與各變量的相關(guān)性Table 8 Correlation analysis between comprehensive scores and variables

2.7 梨酒綜合品質(zhì)評價(jià)預(yù)測模型的建立

表 9 逐步回歸法的結(jié)果Table 9 Results of stepwise regression method

以因子分析得到的不同梨酒綜合因子得分為因變量，剔除獨(dú)立性較差的變量糖酸比和pH值，以多酚質(zhì)量濃度、總黃酮質(zhì)量濃度、還原糖質(zhì)量濃度、總酸質(zhì)量濃度、羥自由基清除能力、DPPH自由基清除率和鐵還原力為自變量，進(jìn)行逐步回歸分析，建立梨酒綜合品質(zhì)評價(jià)理論模型（表9），得到的回歸模型為：F’＝-3.123+0.486×+0.980×+0.006×+0.034×，其中和F’4分別代表還原糖質(zhì)量濃度、鐵還原力能力、多酚質(zhì)量濃度和DPPH自由基清除率。模型的調(diào)整R2為0.996，接近1，說明估計(jì)的模型對觀測值的擬合程度很高。方差分析結(jié)果表明F對應(yīng)的P＜0.05，因此認(rèn)為回歸方程有效。將不同梨酒的對應(yīng)變量值代入模型，得到每種梨酒綜合品質(zhì)的理論評分（表10），并將該評分與利用因子分析得到的綜合因子得分進(jìn)行相關(guān)性分析，r＝0.946（P＜0.01），說明該模型與實(shí)際評估結(jié)果相一致，具有很高的可靠性。基于此模型，未來可以對梨酒的還原糖質(zhì)量濃度、鐵還原力、多酚質(zhì)量濃度和DPPH自由基清除率4 個指標(biāo)進(jìn)行測定，然后計(jì)算得分，對梨酒品質(zhì)進(jìn)行綜合評價(jià)?；诖嗽u價(jià)，可以對釀酒酵母的篩選提供指導(dǎo)。

表 10 通過回歸方程計(jì)算得出的梨酒理論評分Table 10 Theoretical scores for pear wine calculated from the regression equation

3 討 論

已有許多報(bào)道表明多酚和總黃酮具有抗氧化性能[9-11,20-24]。在本研究中通過對各變量做偏相關(guān)分析得知，多酚質(zhì)量濃度和總黃酮質(zhì)量濃度均與鐵還原力、DPPH自由基清除能力呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），說明兩者對梨酒的抗氧化能力貢獻(xiàn)較大。

還原糖、總酸質(zhì)量濃度均分別與D P P H 自由基清除率呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）和極顯著正相關(guān)（P＜0.01），說明糖酸等營養(yǎng)物質(zhì)參與了抗氧化的過程。阿依姑麗·艾合麥提等[25]報(bào)道野山杏的有機(jī)酸具有清除自由基的能力。程勇杰等[26]報(bào)道樹莓酵素和藍(lán)莓酵素均以酒石酸、乙酸和檸檬酸為主，并具有DPPH自由基清除率、羥自由基清除能力。葡萄酒的抗氧化活性不僅與酚類物質(zhì)有關(guān)，還與酒石酸、糖含量等指標(biāo)存在顯著或極顯著相關(guān)性[27]，這與本研究結(jié)果一致。梨酒的主要有機(jī)酸為蘋果酸、檸檬酸和酒石酸[12]，蘋果酸能夠捕獲自由基，具有抗氧化活性[28]。而檸檬酸和酒石酸則均對板藍(lán)根提取物的抗氧化效果有協(xié)同增效作用[29]。梨酒中的有機(jī)酸究竟是直接參與抗氧化過程，還是和其他物質(zhì)協(xié)同發(fā)揮作用有待于進(jìn)一步研究。

因子分析是多元變量統(tǒng)計(jì)分析中最常用的方法之一，毛園園[30]利用SPSS軟件中的主成分分析法對釀酒葡萄理化指標(biāo)進(jìn)行篩選，提取了8 個葡萄酒主要因子作為最終的主要理化指標(biāo)，達(dá)到簡化數(shù)據(jù)降低運(yùn)算量的目的。曹忠威等[31]采用多元線性回歸模型構(gòu)造了釀酒葡萄和葡萄酒理化指標(biāo)之間的關(guān)系，確定了白葡萄酒新的評價(jià)指標(biāo)。趙國群等[12]采用主成分分析對梨酒品質(zhì)進(jìn)行評價(jià)，認(rèn)為梨酒中的總酸、總酚、酒石酸、可溶性固形物、還原糖、干浸出物和單寧含量是評價(jià)梨酒品質(zhì)的主要指標(biāo)，與本研究結(jié)果有部分相似之處，但其沒有涉及梨酒的抗氧化功能研究。本研究通過因子分析法，把代表梨酒品質(zhì)和抗氧化功能的9 個變量簡化得到了3 個公因子：營養(yǎng)因子、功能因子和風(fēng)味因子，分別代表了梨酒的營養(yǎng)性、功能性和風(fēng)味，也符合人們對果酒的評價(jià)和消費(fèi)習(xí)慣。

梨酒的綜合因子得分與多酚質(zhì)量濃度、黃酮質(zhì)量濃度、還原糖質(zhì)量濃度、總酸質(zhì)量濃度、鐵還原力、DPPH自由基清除能力均呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01）（表8），說明營養(yǎng)成分豐富、具有強(qiáng)抗氧化能力的酒能夠獲得好的評價(jià)，這與實(shí)際中的評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)相符合。也說明本研究所選擇的評價(jià)指標(biāo)合理，建立的評價(jià)體系可行。但遺憾的是羥自由基清除能力未能在本評價(jià)體系中獲得很好的體現(xiàn)，推測可能有其他物質(zhì)參與羥自由基的清除，具體機(jī)理還有待后續(xù)研究予以揭示。

通過逐步回歸分析法建立的梨酒綜合品質(zhì)理論模型可以很好地和通過因子分析建立的評價(jià)體系相擬合，說明此模型具有較高的可靠性，期望能夠通過此模型的建立簡化梨酒的評價(jià)參數(shù)，同時為篩選釀制優(yōu)質(zhì)梨酒的酵母菌種提供指導(dǎo)。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)通過因子分析法，對不同酵母釀制梨酒的綜合品質(zhì)進(jìn)行評價(jià)，結(jié)果表明LA-BA酵母釀制的梨酒綜合品質(zhì)最好。通過逐步回歸法建立了梨酒綜合品質(zhì)評價(jià)的理論模型：F’＝-3.123+0.486×F’1+0.980×F’2+0.006×F’3+0.034×F’4，其中F’1、F’2、F’3和F’4分別代表還原糖含量、鐵還原力能力、多酚含量和DPPH自由基清除率。此理論模型可以很好地和通過因子分析建立的評價(jià)體系相擬合，說明其具有較高的可靠性，期望能夠通過此模型的建立簡化梨酒的評價(jià)參數(shù)，同時為篩選釀制優(yōu)質(zhì)梨酒的酵母菌種提供指導(dǎo)。