孫天穎，程紅，張明站，任健*

(1.齊齊哈爾大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2.黑龍江省玉米主食工業(yè)化工程技術(shù)研究中心，黑龍江 齊齊哈爾 161006；3.黑龍江省玉米深加工理論與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

近年來，食品工業(yè)對(duì)蛋白水解物的關(guān)注日益增加，蛋白質(zhì)被分解成小分子量的低聚肽，可被腸道黏膜直接吸收，并且其吸收速度略快于氨基酸[1]。蛋白水解物除具有營養(yǎng)作用外，還可發(fā)揮蛋白質(zhì)整體結(jié)構(gòu)所不具有或不明顯的特殊功能，如抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、美容護(hù)膚、血壓和血脂調(diào)節(jié)、護(hù)肝等[2]。此外，蛋白水解還能夠進(jìn)一步改善蛋白的溶解性、起泡性等功能性質(zhì)，功能蛋白水解物可作為食品添加劑、食品質(zhì)地改良劑和藥物添加劑，被廣泛應(yīng)用于食品或制藥行業(yè)。

玉米蛋白主要存在于玉米淀粉濕法加工的副產(chǎn)物玉米蛋白粉、玉米胚芽和玉米漿中，每加工萬噸的玉米就會(huì)產(chǎn)生300～350噸的玉米漿、350噸的胚芽餅以及600噸的玉米蛋白粉，蛋白資源豐富，并且開發(fā)利用前景廣闊。因?yàn)橛衩椎鞍椎乃苄暂^差，限制了其在食品工業(yè)中的應(yīng)用。但與其他谷物蛋白相比，由于玉米蛋白特殊的氨基酸組成和序列，是研究開發(fā)生物活性肽的良好原料[3]。目前研究和報(bào)道的有玉米蛋白水解物的抗氧化、解酒護(hù)肝、降血壓、增強(qiáng)免疫力等功能[4-8]，并有相關(guān)產(chǎn)品已實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。本文主要采用超濾、凝膠層析對(duì)玉米胚芽脫脂粕水解物中具有抗氧化活性的肽進(jìn)行初步分離，篩選抗氧化活性較強(qiáng)的組分，同時(shí)，檢測(cè)玉米胚芽脫脂粕水解物的體外抗氧化活性作用，為玉米胚芽脫脂粕的研究前景以及相關(guān)功能性產(chǎn)品的開發(fā)提供了理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

玉米胚芽脫脂粕：蛋白含量24.15%，自制；Alcalase堿性蛋白酶：無錫杰能生物工程公司；Flavourzyme風(fēng)味蛋白酶：丹麥Novo Nordisk公司；牛血清白蛋白：GE公司；Sephadex G-15：Pharmacia公司；焦性沒食子酸、鄰二氮菲等其他試劑：均為分析純。

1.2 主要設(shè)備儀器

DL-360E型智能超聲波清洗器 上海之信儀器有限公司；HH.S21-1型電熱恒溫水浴鍋 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；B324型凱氏定氮儀 日立公司；PB-10型pH計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；DU800型紫外可見分光光度計(jì) 貝克曼公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 玉米胚芽脫脂粕水解物的制備

玉米胚芽脫脂粕→過篩(過100目篩)→超聲波處理(超聲功率214 W，超聲時(shí)間30 min，超聲溫度55 ℃)→堿性蛋白酶水解(加酶量5%，W/W)，水解溫度45 ℃，pH值10.5，時(shí)間180 min)→調(diào)pH值→風(fēng)味蛋白酶水解(加酶量3%，W/W)，水解溫度50 ℃，pH值6.2，時(shí)間240 min)→離心取上清液→濃縮凍干。

1.3.2 玉米胚芽脫脂粕水解液的分離及抗氧化性質(zhì)研究

1.3.2.1 超濾

在10000 r/min條件下離心脫脂后的玉米胚芽酶解液20 min，采用10 kDa、6～10 kDa以及6 kDa截?cái)喾肿恿康某瑸V膜逐級(jí)超濾上清液，每超濾一級(jí)，檢測(cè)其溶液抗氧化活性，直至檢測(cè)至最后一次超濾后的上清液活性。

1.3.2.2 凝膠層析

采用Sephadex G-15凝膠層析對(duì)樣品進(jìn)行分子量分級(jí)，參考Amersham Pharmacia凝膠層析原理與手冊(cè)的方法(2002年)。選取規(guī)格為2.6 cm×80 cm的雙蒸水平衡柱作為層析柱，用雙蒸水溶解已被超濾的樣品，采取100000 r/min的條件離心上述溶液10 min，提取上清液。再將上述上清液加入凝膠柱中，用雙蒸水以0.5 mL/min的流速進(jìn)行洗脫，同時(shí)以4 mL/管的收集器自動(dòng)收集，檢測(cè)每管收集器里收集液的抗氧化活性(214 nm處測(cè)定吸光值)，選取活性最高的樣品組分進(jìn)行凍干。

1.3.2.3 清除超氧陰離子自由基活性的測(cè)定

測(cè)定采用改進(jìn)的鄰苯三酚自氧化法[9]。

1.3.2.4 清除羥自由基活性的測(cè)定

采用鄰二氮菲-Fe2+氧化法。

1.3.2.5 玉米胚芽粕水解物清除DPPH自由基的測(cè)定

配制成不同濃度的水解液，分別取1 mL與3 mL 0.2 mmol/L DPPH·溶液均勻混合，反應(yīng)30 min后在517 nm處測(cè)定其吸光度Ai，同法測(cè)定3 mL 0.2 mmol/L DPPH·溶液與1 mL蒸餾水混合后的吸光度Ac以及供試液本身的吸光度Aj，按下式計(jì)算清除率Y。

清除率Y=1-(Ai-Aj)/Ac。

式中：Y為DPPH·自由基清除率；Ac為不加供試液的吸光度；Ai為加入供試液后的吸光度；Aj為供試液本身的吸光度。

1.3.2.6 玉米胚芽粕水解物對(duì)油脂氧化的抑制作用

取一定量的大豆色拉油(0.5%，W/W)置于燒杯中，加入玉米胚芽粕水解物(已被逐級(jí)超濾和凝膠層析作用過的樣品)，每組做3次平行，然后放入(65±1)℃恒溫培養(yǎng)箱中反應(yīng)，每隔24 h攪拌一次樣品并測(cè)量樣品的過氧化值(POV值)。本實(shí)驗(yàn)按照GB/T 5009.37-2003標(biāo)準(zhǔn)操作，采用油脂的氧化速度(POV值)表示油脂抗氧化能力。

1.3.2.7 玉米胚芽粕水解物還原力的測(cè)定

在試管中依次加入pH值為6.6的0.2 mol/L磷酸鹽緩沖溶液、1%六氰合鐵酸鉀和各種不同濃度梯度的玉米胚芽粕水解液，每種試劑加入試管的體積均為0.75 mL。將混合溶液于50 ℃水浴20 min，然后加入0.75 mL的10%三氯乙酸，以4 ℃、3000 r/min的條件下離心上述溶液10 min，提取出1.5 mL上清液，再分別加入1.5 mL的蒸餾水和0.1%的FeC13，快速搖勻，室溫靜置反應(yīng)10 min后，以蒸餾水調(diào)零，在吸光度為700 nm處測(cè)定上述樣品的吸光值。

2 結(jié)果與討論

2.1 超濾分離結(jié)果分析

超濾是介于微濾和納濾之間的一種膜過濾。為從玉米胚芽粕酶解液中得到不同分子量的多肽，本方法采用截?cái)喾肿恿繛?0 kDa、6～10 kDa和6 kDa的超濾膜按照順序逐步分離玉米胚芽粕酶解液，結(jié)果見表1。

表1 樣品超濾的結(jié)果分析Table 1 The analysis result of hydrolysates by ultrafiltration

由表1可知，超濾分級(jí)后分子量小于6 kDa的組分抗氧化活性最高。外液(<6000 Da)的抗氧化活性高達(dá)481.76 U/mL，是內(nèi)液II(10000～6000 Da)的3倍以上，是內(nèi)液I(>10000 Da)的8倍以上，證明抗氧化活性肽多聚集在<6 kDa區(qū)段，并且小分子量的玉米胚芽粕多肽更易被吸收利用。

2.2 Sephadex G-15凝膠層析分離

對(duì)經(jīng)過超濾的抗氧化活性肽進(jìn)一步進(jìn)行凝膠層析分離，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1。

圖1 Sephadex G-15管數(shù)凝膠層析的洗脫曲線Fig.1 The elution curve of Sephadex G-15 gel chromatography

經(jīng)Sephadex G-15凝膠層析后得到G1、G2、G3、G4 4個(gè)組分，測(cè)定其抗氧化活性依次為57.19，287.43，149.28，27.37 U/mL。由圖1可知，G2組分的抗氧化活性最高。

2.3 玉米胚芽粕水解物對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用

將原玉米胚芽粕水解物溶液配制成濃度梯度為0.5，1，2，3，4，5 mg/mL的樣品，各濃度梯度的樣品對(duì)O2-·的清除效果見圖2。

圖2 玉米胚芽粕水解物對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用Fig.2 The scavenging effect of corn germ meal hydrolysates on superoxide anion free radical

由圖2可知，玉米胚芽粕水解物對(duì)O2-·的清除作用具有顯著影響，且隨樣品濃度的增大而增強(qiáng)。濃度在0.5～4 mg/mL之間的樣品的O2-·清除作用由181.80 U/mL大幅度增加到526.92 U/mL，但當(dāng)樣品濃度從4 mg/mL持續(xù)增大到5 mg/mL，樣品的O2-·的清除作用基本不發(fā)生變化，由此可得濃度為4 mg/mL的玉米胚芽粕水解物對(duì)O2-·的清除作用最強(qiáng)。

2.4 玉米胚芽粕水解物對(duì)羥自由基的清除作用

將原玉米胚芽粕水解物溶液配制成濃度梯度為0.5，1，2，3，4，5，6 mg/mL的溶液，各濃度梯度的樣品對(duì)·OH的清除作用見圖3。

圖3 玉米胚芽粕水解物對(duì)·OH的清除作用Fig.3 The scavenging effect of corn germ meal hydrolysate on · OH

由圖3可知，玉米胚芽粕水解物對(duì)·OH 的清除作用具有顯著影響，并且隨著水解物濃度的增大而增強(qiáng)。當(dāng)濃度為0.5 mg/mL時(shí)，·OH的清除率僅為14.70%；當(dāng)濃度為6 mg/mL時(shí)，·OH的清除率可達(dá)94.52%。玉米胚芽粕水解物和清除率之間的關(guān)系大致為：y=0.8475x2+8.9518x+11.725，R2=0.9905。

樣品濃度從0.5 mg/mL持續(xù)增長(zhǎng)到6 mg/mL時(shí)，樣品對(duì)·OH的清除率從14.70%極速增長(zhǎng)到94.52%，這期間的清除率均呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)。樣品和清除率之間的關(guān)系大致為：y=0.8475x2+8.9518x+11.725，R2=0.9905，清除能力(EC50)為3.27 mg/mL。由此可得，濃度為6 mg/mL的玉米胚芽粕水解物對(duì)·OH的清除作用最強(qiáng)。

2.5 玉米胚芽粕水解物對(duì)DPPH·的清除作用

將原玉米胚芽粕水解物溶液配制成濃度梯度為0.5，1，2，3，4，5 mg/mL的樣品，各濃度梯度的樣品對(duì)DPPH·的抑制作用見圖4。

圖4 玉米胚芽粕水解物對(duì)DPPH·的清除作用Fig.4 The scavenging effect of corn germ meal hydrolysate on DPPH·

由圖4可知，玉米胚芽粕水解物對(duì)DPPH·具有抑制作用，濃度越大抑制作用越強(qiáng)。當(dāng)樣品濃度從0.5 mg/mL升至5 mg/mL時(shí)，玉米胚芽粕水解物對(duì)DPPH·的抑制率呈現(xiàn)正比上升關(guān)系，從只有5.84%高速增長(zhǎng)至近90%，尤其濃度大于2 mg/mL后，上升趨勢(shì)更加明顯。樣品與DPPH·抑制率的關(guān)系大致為：y=-1.6094x2+29.048x-9.7791，R2=0.9913，50%清除能力(EC50)為 2.37 mg/mL。

2.6 玉米胚芽粕水解物對(duì)油脂氧化的抑制作用

本實(shí)驗(yàn)以加入的玉米胚芽粕水解物作為樣品對(duì)照組，以不加水解物做空白對(duì)照組，檢測(cè)樣品對(duì)油脂氧化的作用，結(jié)果見圖5。

圖5 玉米胚芽粕水解物對(duì)油脂氧化的抑制作用Fig.5 Inhibition of corn germ meal hydrolysates on oil oxidation

由圖5可知，隨著時(shí)間的增加，油脂的POV值均呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，而POV值越高，表明油脂被氧化的作用越強(qiáng)。雖然添加了玉米胚芽粕水解物的樣品組隨時(shí)間增加，POV值也不斷增加，但是與空白對(duì)照組的上升趨勢(shì)相比相對(duì)平緩一些。綜上所述，玉米胚芽粕水解物具有抗油脂氧化作用。

2.7 玉米胚芽粕水解物還原力大小

將原玉米胚芽粕水解物溶液配制成濃度梯度為0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1 mg/mL的樣品，并檢測(cè)不同濃度下的還原力大小，結(jié)果見圖6。

圖6 玉米胚芽粕水解物的還原作用 Fig.6 The reduction activity of corn germ meal hydrolysates

由圖6可知，當(dāng)樣品濃度從0.1 mg/mL增長(zhǎng)至0.6 mg/mL時(shí)，樣品的吸光度呈上升趨勢(shì)，表明濃度越大，玉米胚芽粕水解物的還原力越強(qiáng)；當(dāng)濃度從0.6 mg/mL提高到1 mg/mL時(shí)，樣品吸光度逐漸趨于平緩，但并沒有下降的趨勢(shì)，表明玉米胚芽粕水解物具有很強(qiáng)的Fe3+還原力。

3 結(jié)論

本文旨在以脫脂玉米胚芽粕水解物為主要研究對(duì)象，經(jīng)超濾膜分級(jí)，分別篩選出分子量>10 kDa、10～6 kDa及<6 kDa的組分，并探討其抗氧化能力。結(jié)果表明，分子量<6 kDa的脫脂玉米胚芽粕水解物的抗氧能力最強(qiáng)。并且該組分經(jīng)凝膠層析分離進(jìn)一步制備抗氧化活性肽，篩選得到4個(gè)活性組分G1、G2、G3、G4，其中G2組分的抗氧化活性最高。研究表明：玉米胚芽脫脂粕水解物具有較強(qiáng)的O2-·、·OH和DPPH·的清除能力以及抗油脂氧化能力和還原力。