熊亞，李敏杰*

(1.攀枝花學(xué)院 生物與化學(xué)工程學(xué)院，四川 攀枝花 617000；2.攀枝花市干熱河谷特色生物資源工程技術(shù)中心，四川 攀枝花 617000)

桑葚，為?？浦参锷涞墓搿，F(xiàn)代研究證實(shí)，桑葚果實(shí)中含有豐富的活性蛋白、維生素、氨基酸、胡蘿卜素、白藜蘆醇、花青素等成分，具有多種功效，被醫(yī)學(xué)界譽(yù)為“21世紀(jì)的最佳保健果品”[1-5]。草莓屬于多年生草本植物，富含維生素C、維生素A、維生素E、胡蘿卜素、鞣酸、天冬氨酸、銅、草莓胺、鞣花酸與花青素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值極高[6-10]。

現(xiàn)今，果醋的風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)保健功能越來(lái)越被人們所接受和認(rèn)可，人們也愈發(fā)希望能接觸到品種更加多樣化且具有獨(dú)特風(fēng)味的果醋，這種愿望緣于果醋在營(yíng)養(yǎng)成分、口味、功效方面均要優(yōu)于糧食醋[11,12]，因此復(fù)合型醋飲料及調(diào)味品具有很大的市場(chǎng)潛力。目前不斷有各種復(fù)合果醋研制工藝的報(bào)道[13-16]，但對(duì)于果醋發(fā)酵動(dòng)力學(xué)的研究還比較少[17]，草莓的香味濃顏色淺，而桑葚味淡、顏色深，兩種水果形成良好的互補(bǔ)，不但能夠彌補(bǔ)相互的缺陷，發(fā)揮自身的優(yōu)勢(shì)，滿足人們對(duì)營(yíng)養(yǎng)和保健的需求，也能夠在一定程度上開(kāi)拓新興復(fù)合果醋品種市場(chǎng)，解決草莓、桑葚不易保存和運(yùn)輸?shù)膯?wèn)題。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)桑葚-草莓復(fù)合果醋動(dòng)力學(xué)模型的研究，對(duì)探索和優(yōu)化復(fù)合果醋的優(yōu)良釀造工藝，對(duì)復(fù)合果醋的市場(chǎng)開(kāi)發(fā)及擴(kuò)大化生產(chǎn)有著積極的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桑葚、草莓：購(gòu)于攀枝花學(xué)院水果超市；高活性干酵母：湖北宜昌安琪酵母股份有限公司；果醋菌：煙臺(tái)帝伯仕酵母有限公司；果膠酶(30萬(wàn)U/g)：浙江博丹衡食品配料有限公司；亞硫酸(分析純，99.8%)、檸檬酸(分析純)、NaOH(分析純)：天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FA1204B電子天平 上海天平儀器廠；SZ6000B型顯微鏡 上海締倫光學(xué)儀器有限公司；LB20T型手持式糖度儀 廣州市銘睿電子科技有限公司；LHH-4數(shù)顯電熱恒溫水浴鍋 常州金壇良友儀器有限公司；0-40型酒精計(jì) 河間市宏利玻儀廠；PHS-3B精密pH計(jì) 上海圣科儀器設(shè)備有限公司；T2264MD榨汁機(jī) 上海九陽(yáng)股份有限公司；722S可見(jiàn)光分光光度計(jì) 山東濰坊盛翔實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程

1.3.2 操作要點(diǎn)

1.3.2.1 原料預(yù)處理

將草莓和桑葚洗干凈，按質(zhì)量比3∶2的比例混合后榨汁。

1.3.2.2 SO2的添加

為了防止果汁被雜菌污染，在果汁中加入60 mg/L的SO2。

1.3.2.3 加入果膠酶

果膠酶的加入是為了分解果膠，增加草莓和桑葚的出汁率，水果破碎后按50 mg/L的量加入果膠酶酶解1 h。

1.3.2.4 成分調(diào)整

加入白砂糖和檸檬酸分別調(diào)節(jié)初始糖度為220 g/L，初始pH為4.5，按0.5%的加入量加入活性干酵母進(jìn)行發(fā)酵。

1.3.2.5 發(fā)酵

放置于26 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵8 d。

1.3.2.6 醋酸發(fā)酵

按0.5 g/L的添加量在酒精發(fā)酵液中加入果醋菌，放置于36 ℃的恒溫?fù)u床中進(jìn)行醋酸發(fā)酵，發(fā)酵時(shí)間為10 d。

1.3.3 果醋菌菌體濃度(OD值)的測(cè)定

菌體生長(zhǎng)量與光密度值(OD值)具有線性關(guān)系，可通過(guò)光密度值來(lái)體現(xiàn)菌體生長(zhǎng)量。取一定量發(fā)酵液在570 nm波長(zhǎng)下測(cè)定其光密度(OD值)。

1.3.4 醋酸含量的測(cè)定

利用酸堿中和滴定原理進(jìn)行醋酸含量的測(cè)定。

1.3.5 酒精度的測(cè)定

酒精度采取蒸餾法測(cè)定[18]。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用Origin 8.6軟件進(jìn)行果醋菌菌體生長(zhǎng)量、醋酸生成量和酒精消耗量的非線性擬合。通過(guò)回歸求解動(dòng)力學(xué)模型參數(shù)，建立果醋菌菌體生長(zhǎng)、醋酸生成和酒精消耗的動(dòng)力學(xué)模型方程。

2 結(jié)果與分析

由圖1可知，果醋菌的生長(zhǎng)量在發(fā)酵前3 d增長(zhǎng)較為平緩，這是由于果醋菌代謝系統(tǒng)為適應(yīng)新環(huán)境的需要，處于生長(zhǎng)代謝適應(yīng)階段。從第3天開(kāi)始其數(shù)量快速增長(zhǎng)，這是因?yàn)楣拙堰m應(yīng)環(huán)境，能夠大量利用發(fā)酵液中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，從第8天開(kāi)始果醋菌生長(zhǎng)量變化逐漸趨于平緩，逐步進(jìn)入穩(wěn)定期。與果醋菌生長(zhǎng)量變化趨勢(shì)類似，發(fā)酵過(guò)程中醋酸含量在發(fā)酵前3 d變化很小，是由于果醋菌處于生長(zhǎng)適應(yīng)階段，還未完全進(jìn)行產(chǎn)醋酸作用。從發(fā)酵第3天開(kāi)始，醋酸含量快速上升，這是因?yàn)楣拙钚栽鰪?qiáng)，開(kāi)始大量繁殖，將底物轉(zhuǎn)化為醋酸，導(dǎo)致醋酸含量大幅度上升，在發(fā)酵第10天醋酸含量達(dá)到最大值，為6.89 g/dL。從第3天開(kāi)始，酒精濃度也開(kāi)始急劇減少，這可能是由于果醋菌的大量繁殖導(dǎo)致底物酒精被大量消耗。到了第8天，酒精濃度減少趨勢(shì)變緩，此時(shí)酒精濃度已經(jīng)低于2%，并逐漸趨于0，這種變化趨勢(shì)可能是由于酵母菌也在這一時(shí)期開(kāi)始進(jìn)入穩(wěn)定期，并開(kāi)始逐漸衰亡，底物消耗逐漸減弱，這也預(yù)示著果醋發(fā)酵基本完成。從果醋菌生長(zhǎng)量、醋酸生成量及酒精濃度隨發(fā)酵的變化上看，三者之間相互聯(lián)系、相互對(duì)應(yīng)。

圖1 桑葚-草莓復(fù)合果醋發(fā)酵過(guò)程主要指標(biāo)變化曲線Fig.1 Change curves of main indexes of mulberry and strawberry compound fruit vinegar during fermentation process

2.1 果醋菌生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型建立

由果醋菌生長(zhǎng)量OD值的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以看出，果醋菌的生長(zhǎng)曲線呈“S”形，因此可以用Logistic模型對(duì)發(fā)酵過(guò)程進(jìn)行模擬[19]，Logistic方程由比利時(shí)數(shù)學(xué)家Verhulst首先提出，是用來(lái)表現(xiàn)菌體生長(zhǎng)與營(yíng)養(yǎng)底物之間的非線性關(guān)系的經(jīng)驗(yàn)方程[20]，其形式為：

(1)

對(duì)式(1)積分，得到方程：

(2)

式中：y表示發(fā)酵過(guò)程中果醋菌的生長(zhǎng)量(OD值)；A1表示初始OD值；A2表示最大生長(zhǎng)量(OD值)；Cm表示最大比生長(zhǎng)速率，d-1。

通過(guò)Origin 8.6軟件對(duì)菌體生長(zhǎng)量和方程式(2)進(jìn)行擬合，得到A1=0.01257，A2=0.43479，Cm=0.71518，帶入式(2)得果醋菌生長(zhǎng)量隨發(fā)酵過(guò)程變化的動(dòng)力學(xué)模型為：

(3)

果醋菌生長(zhǎng)量實(shí)驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值模型擬合曲線見(jiàn)圖2。

圖2 果醋菌生長(zhǎng)量實(shí)驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值模型擬合曲線Fig.2 Fitting curve of experimental values and predicted values of fruit vinegar bacteria growth amount

由圖2可知，果醋菌生長(zhǎng)量在發(fā)酵期間的變化情況與Logistic模型擬合曲線很吻合，模型決定系數(shù)為0.9923，說(shuō)明果醋菌在發(fā)酵過(guò)程中的生長(zhǎng)變化情況能夠用Logistic模型進(jìn)行很好的反映。

2.2 產(chǎn)物醋酸生成動(dòng)力學(xué)模型。

產(chǎn)物生成動(dòng)力學(xué)模型目前用的比較多的是由Luedeking和Piret描述乳酸發(fā)酵時(shí)所提出的數(shù)學(xué)模型(Luedeking-Piret模型)，其形式為：

(4)

根據(jù)產(chǎn)物形成與菌體生長(zhǎng)的關(guān)系，當(dāng)a≠0，b=0時(shí)，產(chǎn)物形成與菌體生長(zhǎng)相關(guān)聯(lián)。

對(duì)式(4)積分，得：

P(t)=a[y(t)-A1]。

(5)

式中：P(t)為醋酸生成量，g/dL，a為生長(zhǎng)偶聯(lián)參數(shù)，A1為初始醋酸菌生長(zhǎng)量(OD值)。將式(3)帶入式(5)，利用Origin 8.6軟件進(jìn)行非線性擬合，得a=17.1589，醋酸生成量隨發(fā)酵時(shí)間的動(dòng)力學(xué)模型方程為：

(6)

醋酸生成量實(shí)驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值擬合曲線見(jiàn)圖3，實(shí)驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值具有較高的一致性，實(shí)驗(yàn)值與擬合曲線進(jìn)行了很好的擬合，Luedeking-Piret模型的決定系數(shù)R2=0.9933，表明該模型能夠很好地反映出在復(fù)合果醋發(fā)酵過(guò)程中醋酸的實(shí)際生成情況。

圖3 醋酸生成實(shí)驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值模型擬合曲線Fig.3 Fitting curve of experimental values and predicted values of acetic acid production

2.3 底物酒精消耗動(dòng)力學(xué)模型

在復(fù)合果醋的發(fā)酵過(guò)程中，酒精的消耗模型包括底物消耗以維持細(xì)胞呼吸新陳代謝作用、供給菌體生長(zhǎng)、形成產(chǎn)物三個(gè)部分。通過(guò)物料平衡，利用Boltzmann模型建立方程：

(7)

式中：Y為酒精濃度，%；A1為初始酒精濃度，%；A2為酒精終濃度，%；x為自變量;x0、dx為方程系數(shù)。

通過(guò)Origin 8.6軟件對(duì)酒精濃度和方程式(7)進(jìn)行擬合，得A1=13.674，A2=0.8202，x0=5.1272，dx=1.4877。帶入式(7)得酒精濃度隨發(fā)酵過(guò)程變化的動(dòng)力學(xué)模型為：

(8)

酒精消耗實(shí)驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值模型擬合曲線見(jiàn)圖4。隨著發(fā)酵時(shí)間的變化，酒精濃度的變化數(shù)據(jù)與動(dòng)力學(xué)模型擬合曲線的變化趨勢(shì)非常符合，此動(dòng)力學(xué)模型的R2=0.9951，說(shuō)明酒精濃度的實(shí)驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值能夠很好地?cái)M合，該模型能很好地反映發(fā)酵過(guò)程中底物酒精的消耗情況。

圖4 酒精濃度與預(yù)測(cè)值模型擬合曲線Fig.4 Fitting curve of experimental values and predicted values of alcohol content

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以桑葚、草莓為原料，混合榨汁后加入酵母進(jìn)行發(fā)酵，得到酒液透亮清澈，色澤呈深紅色，帶有菠蘿清香的復(fù)合果酒，然后加入果醋菌進(jìn)行醋酸發(fā)酵，最終獲得色澤深紅、具有果香和醋香的復(fù)合果醋。在桑葚-草莓復(fù)合果醋的發(fā)酵過(guò)程中對(duì)果醋菌生長(zhǎng)量、醋酸生成量、酒精濃度進(jìn)行了測(cè)定，在整個(gè)發(fā)酵階段，果醋菌生長(zhǎng)量、醋酸生成量及酒精濃度的變化趨勢(shì)相互關(guān)聯(lián)，發(fā)酵的第3～8天，果酸菌生長(zhǎng)量大幅度上升，進(jìn)入生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期，此時(shí)，醋酸的生成量也以類似的變化趨勢(shì)進(jìn)行增長(zhǎng)，而酒精濃度在這一時(shí)期大幅度下降。發(fā)酵結(jié)束后(第10天)復(fù)合果醋中酒精濃度為1.4%，醋酸含量為6.89 g/dL；利用Origin 8.6軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行非線性擬合，以Logistic方程建立了桑葚-草莓復(fù)合果醋的菌體生長(zhǎng)量動(dòng)力學(xué)模型，以Luedeking-Piret模型建立了醋酸生成的動(dòng)力學(xué)方程，以Boltzmann模型建立了酒精濃度的動(dòng)力學(xué)模型，其決定系數(shù)R2分別為0.9923，0.9932，0.9951。實(shí)驗(yàn)值與3種動(dòng)力學(xué)模型的擬合曲線擬合程度很高，說(shuō)明3種動(dòng)力學(xué)模型對(duì)桑葚-草莓復(fù)合果醋在發(fā)酵過(guò)程中菌體生長(zhǎng)量、醋酸生成量及底物酒精濃度消耗的實(shí)際變化情況能進(jìn)行很好的描述。

通過(guò)桑葚-草莓復(fù)合果醋發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型的建立，將進(jìn)一步掌握果醋菌、醋酸生成及酒精消耗在果醋發(fā)酵過(guò)程中的生理生化及動(dòng)力學(xué)特征，也能反映出這三者之間的相互關(guān)系，將為今后桑葚-草莓復(fù)合果醋的工業(yè)化生產(chǎn)提供一定的理論依據(jù)。