韓冉，張珊，余倩倩，侯麗華

(天津科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300457)

醬油是東亞國家的重要調(diào)味品之一，距今已有上千年的歷史，伴隨著人們對醬油風(fēng)味的高要求，市場中醬油品種也日趨多樣化，高鹽稀態(tài)發(fā)酵醬油因其獨(dú)特的風(fēng)味具有較大的市場前景。高鹽稀態(tài)發(fā)酵醬油與一般醬油制法不同之處在于成曲后加入原料總重2～2.5倍的18%～20%鹽水，并且通過添加耐鹽酵母菌增加醬油的風(fēng)味和提高醬油的品質(zhì)[1]，發(fā)酵時(shí)間較長，一般為4～6個(gè)月。

魯氏酵母(Saccharomycesrouxii，簡稱S酵母)，是一種耐高滲透壓酵母菌，其在含鹽量18%的生長條件下仍具有活力。將該種酵母應(yīng)用于高鹽稀態(tài)發(fā)酵醬油中可將糖類物質(zhì)繼續(xù)分解，從而生成醇類、酯類、酮類、酸類等香氣成分，賦予醬油醇香濃郁的新風(fēng)味。已有研究表明，微生物的添加方式與醬油的風(fēng)味息息相關(guān)[2]。目前對于不同時(shí)間添加魯氏酵母于高鹽稀態(tài)醬油發(fā)酵中的研究相對較少。本文通過測定相關(guān)理化指標(biāo)和對比風(fēng)味物質(zhì)研究魯氏酵母對高鹽稀態(tài)發(fā)酵醬油的影響，為醬油企業(yè)添加耐鹽酵母提供了理論支撐。

1 材料與方法

1.1 原料及菌株

原料：豆粕、炒小麥。

菌種：米曲霉滬釀3.042、酵母S1(魯氏酵母菌CBS732)和酵母S2(魯氏酵母菌JBCC-49)，為本實(shí)驗(yàn)室保藏菌種。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 制曲工藝

1.2.1.1 種曲制備

按麩皮∶水為1∶1.1的比例拌水，滅菌處理后接種3～4環(huán)孢子，32 ℃恒溫堆積培養(yǎng)。15 h后振蕩打散曲料，然后調(diào)溫至30 ℃平鋪培養(yǎng)，7 h后第二次振蕩打散，3 d后將成熟種曲烘干備用。

1.2.1.2 大曲制備

原料(豆粕與炒小麥比為6∶4)500 g，其中豆粕經(jīng)1.1倍溫開水浸泡30 min至充分吸水，隨后原料經(jīng)曲布包扎后進(jìn)行高壓滅菌處理。滅菌后將曲料及時(shí)打散，曲料溫度降到40 ℃時(shí)拌入種曲(原料質(zhì)量的0.4%)并充分混勻，30 ℃堆積培養(yǎng)。12～16 h后，第一次翻曲，繼續(xù)培養(yǎng)6～8 h，第二次翻曲。28 ℃進(jìn)一步培養(yǎng)，培養(yǎng)40 h至大曲原料呈均勻的黃綠色，即為成曲。

1.2.2 發(fā)酵工藝

將成曲收入發(fā)酵容器中，加入20%的鹽水(原料干重2.5倍)攪拌均勻，封口進(jìn)行發(fā)酵，初始發(fā)酵溫度15 ℃，每天升高1 ℃，30 ℃封頂，共發(fā)酵150 d，發(fā)酵過程中定期攪拌。在發(fā)酵第15，30，45天分別添加S1、S2酵母菌，添加量均為2×105CFU/g。

1.2.3 醬油發(fā)酵過程中指標(biāo)的測定

發(fā)酵過程中每15 d進(jìn)行一次取樣，直至第150 天。取樣醬醪在8000 r/min條件下離心6 min后得上清，對其各指標(biāo)進(jìn)行跟蹤測定。

1.2.3.1 總酸的測定

總酸含量按照國標(biāo)GB/T 5009.39-2003[3]規(guī)定的方法測定。

1.2.3.2 氨基酸態(tài)氮的測定

氨基酸態(tài)氮含量按照國標(biāo)GB/T 5009.39-2003規(guī)定的方法測定。

1.2.4 發(fā)酵結(jié)束后指標(biāo)的測定

1.2.4.1 液相色譜測定分析有機(jī)酸

色譜柱：Hydrosphere C18(250 mm×4.6 mm I.D.)流動(dòng)相：0.03 mol/L KH2PO4(磷酸調(diào)pH為3.0)；紫外檢測器波長：215 nm；流速：0.5 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL。

1.2.4.2 固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用(SPME-GC-MS)測定分析風(fēng)味物質(zhì)

GC-MS條件：GC條件：采取程序升溫，起始溫度40 ℃，保持10 min，以3 ℃/min升至100 ℃，再以4 ℃/min升至180 ℃，最后以6 ℃/min升至220 ℃；進(jìn)樣口溫度250 ℃，載氣為氦氣，流速為1 mL/min，不分流進(jìn)樣；MS條件：接口溫度為220 ℃，離子源溫度為230 ℃，電離方式為EI，電子能量為70 eV，質(zhì)量掃描范圍為33～450 amu[4,5]。

2 結(jié)果與分析

2.1 醬油發(fā)酵過程中總酸的測定

在高鹽稀態(tài)發(fā)酵過程中，醬油中酸類物質(zhì)增加，主要來自產(chǎn)酸菌產(chǎn)生乳酸、乙酸等酸類物質(zhì)[6]，還包括檸檬酸、琥珀酸、酒石酸、丙酸等有機(jī)酸。適量酸味可以中和醬油中的咸味，使醬油滋味變得柔和，但是總酸含量太高時(shí)也會使醬油的味道和氣味變差[7]。

(a)

(b)

由圖1中(a)可知，S1酵母最終發(fā)酵的總酸含量15 d+S1<45 d+S1<30 d+S1<空白，數(shù)值分別為1.18，1.19，1.28，1.42 g/dL；由圖1中(b)可知，S2酵母最終發(fā)酵的總酸含量30 d+S2<15 d+S2<45 d+S2<空白，數(shù)值分別為1.28，1.34，1.41，1.42 g/dL。發(fā)酵后期，添加酵母發(fā)酵組的酸類物質(zhì)被利用生成酯類、醛類等其他風(fēng)味物質(zhì)，因此其總酸含量均低于空白組的總酸含量。

2.2 醬油發(fā)酵過程中氨基酸態(tài)氮含量的測定

醬油原料中蛋白含量豐富，發(fā)酵過程中經(jīng)酶水解成小分子的肽和氨基酸，也就是醬油中主要的呈鮮物質(zhì)[8]，決定醬油的分級。

(a)

(b)

由圖2可知，發(fā)酵初期，氨基酸態(tài)氮含量快速增加，蛋白酶系活力旺盛，此外在高濃度鹽水的滲透壓作用下，原料中的可溶性氮和鈉離子發(fā)生快速交換，導(dǎo)致發(fā)酵液中氨基酸態(tài)氮持續(xù)增加。發(fā)酵后期，醬醪中微生物代謝消耗掉一部分氨基酸態(tài)氮，最終生成與消耗速率平衡，含量逐漸趨于穩(wěn)定。由圖2中(a)可知，S1酵母最終氨基酸態(tài)氮含量空白<45 d+S1<15 d+S1<30 d+S1，數(shù)值分別為0.91，0.92，0.98，1.00 g/dL，S1在第30 天添加時(shí)較優(yōu)；由圖2中(b)可知，S2酵母最終氨基酸態(tài)氮含量為空白<30 d+S2<15 d+S2<45 d+S2，數(shù)值分別為0.91，0.94，0.95，0.97 g/dL，S2在第45天添加時(shí)較優(yōu)。各組在發(fā)酵結(jié)束時(shí)氨基酸態(tài)氮含量均>0.80 g/dL，符合國標(biāo)GB/T 18186-2000中特級醬油的相關(guān)規(guī)定。

2.3 有機(jī)酸含量檢測

有機(jī)酸賦予醬油香氣，并且中和高鹽分帶來的咸味，對醬油的口感起調(diào)節(jié)作用[9]。醬油中的有機(jī)酸以乳酸為主。本實(shí)驗(yàn)通過高效液相色譜法進(jìn)行檢測與分析，各個(gè)發(fā)酵組的有機(jī)酸含量見表1，各發(fā)酵組的有機(jī)酸種類基本一致。琥珀酸入口呈爽口酸味；乙酸等在烹飪過程中可與醇類等反應(yīng)，生成具有特殊風(fēng)味的酯類；草酸含量過量會危害人體健康，各組草酸含量均在國標(biāo)范圍內(nèi)。30 d+S1組乙酸和琥珀酸含量均高于15 d+S1組和45 d+S1組；45 d+S2酵母組中乙酸和琥珀酸含量均高于15 d+S2組和30 d+S2組。

表1 添加單種酵母發(fā)酵組中有機(jī)酸含量Table 1 The content of organic acids in the fermentation group adding single yeast

2.4 風(fēng)味物質(zhì)檢測

表2 添加單種酵母發(fā)酵組風(fēng)味物質(zhì)種類的比較Table 2 The types of flavor substances in the fermentation group adding single yeast

在所有的風(fēng)味物質(zhì)中，酯類物質(zhì)作為醬油的主要香氣成分所占比重最大，見表2。對比各發(fā)酵組，30 d+S1發(fā)酵組中酯類物質(zhì)種類最多，為25種。其次占比大的是醇類物質(zhì)，經(jīng)檢測，乙醇、異戊醇和苯乙醇含量較高，總體占醇類物質(zhì)的90%以上，乙醇主要來自以酵母利用糖類進(jìn)行的酒精發(fā)酵過程[10,11]，異戊醇和苯乙醇均由氨基酸經(jīng)Ehrlich反應(yīng)生成，苯乙醇是具有薔薇花香氣的化合物[12]。此外，重要風(fēng)味組成成分3-甲硫基丙醇和1-辛烯-3-醇也在添加耐鹽酵母S1的發(fā)酵組中被檢測到[13,14]。由表2可知，30 d+S1發(fā)酵組中檢測到的醇類物質(zhì)種類較多，為20種。醛類物質(zhì)的簡單化合物具有強(qiáng)烈的刺激性香氣，而且醛類與醇類等反應(yīng)均可產(chǎn)生不同于本身的香氣，例如，異戊醛與硫化氫共存時(shí)可以形成強(qiáng)烈的焦香氣味。本實(shí)驗(yàn)中檢測到的主要醛類物質(zhì)有異丁醛、異戊醛、苯甲醛和苯乙醛。在各發(fā)酵組中，45 d+S2發(fā)酵組中檢測出的醛類和酮類物質(zhì)種類高于其他組。醬油的酸類物質(zhì)也關(guān)系到產(chǎn)品的香氣，45 d+S2酵母組的酸類物質(zhì)種類最高。此外，30 d+S1組與45 d+S2組的總風(fēng)味物質(zhì)種類較高，分別為71種和72種。

2.5 不同時(shí)間添加兩種酵母有機(jī)酸含量及風(fēng)味物質(zhì)種類

由上述結(jié)果可知，添加單種酵母時(shí)，30 d添加S1酵母較佳，45 d添加S2酵母較佳。為了達(dá)到更好的發(fā)酵效果，采用S1、S2酵母不同時(shí)間混合添加的方法進(jìn)行驗(yàn)證，即30 d+S1+45 d+S2組。發(fā)酵最終總酸含量為1.42 g/dL，總氨基酸態(tài)氮含量為1.01 g/dL。

表3 不同時(shí)間添加多種酵母發(fā)酵組有機(jī)酸含量及風(fēng)味物質(zhì)種類的比較Table 3 Comparison of content of organic acids and types of flavor substances in the fermentation group adding various yeasts at different time

由表3可知，30 d+S1+45 d+S2組中重要酸類物質(zhì)蘋果酸、乳酸、乙酸、富馬酸以及琥珀酸的含量均高于30 d+S1組和45 d+S2組；在風(fēng)味物質(zhì)種類的檢測中，30 d+S1+45 d+S2組也呈現(xiàn)出明顯優(yōu)勢，最終種類達(dá)到78種。經(jīng)驗(yàn)證，最佳發(fā)酵方法為第30 天添加S1酵母后在第45 天添加S2酵母。

3 結(jié)論

在單一酵母發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中得知同一種酵母不同株添加時(shí)間的不同對發(fā)酵效果影響不同，因此需要分別進(jìn)行條件優(yōu)化，從而得到最佳發(fā)酵方式。根據(jù)單一酵母實(shí)驗(yàn)推斷得到最優(yōu)的混合發(fā)酵方式，并進(jìn)行了相關(guān)驗(yàn)證，結(jié)果與預(yù)期一致，表明在不同時(shí)段添加不同種類的耐鹽酵母發(fā)酵結(jié)果更優(yōu)，為企業(yè)實(shí)際生產(chǎn)高鹽稀態(tài)發(fā)酵醬油提供了更多的理論依據(jù)。今后的研究中將進(jìn)行不同酵母之間的相互作用分析以及不同株酵母添加不同量時(shí)對發(fā)酵效果的影響。