田愷，張浩然，張亦菲，徐汀，華賢輝，商軍

(上海市獸藥飼料檢測所，上海 201103)

精制馬拉硫磷溶液屬于有機(jī)磷殺蟲藥，主要以觸殺、胃毒和熏蒸殺滅蟲害，具有廣譜、低毒、使用安全等特點(diǎn)，多用于牛羊皮毛去虱除蟲，其作為獸用殺蟲藥劑，廣泛應(yīng)用于牛羊產(chǎn)地多的地區(qū)。目前國內(nèi)外檢測馬拉硫磷的方法主要有電化學(xué)法[1-2]、酶聯(lián)免疫法[3]、分光光譜法[4]、氣相色譜法[5-10]、液相色譜法[11-13]、氣質(zhì)聯(lián)用法[14]和液質(zhì)聯(lián)用法[15]等，其中氣相色譜法是最通用的檢測方法。精制馬拉硫磷溶液作為獸用制劑收載于《獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》(2017年版，化學(xué)藥品卷)中[8]，其含量測定為填充柱氣相色譜法，采用該法測定精制馬拉硫磷溶液含量的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性均較差，給檢驗(yàn)工作帶來了諸多麻煩。為了更好地控制精制馬拉硫磷溶液質(zhì)量，本研究建立毛細(xì)管柱氣相色譜法測定精制馬拉硫磷溶液含量，為該制劑的質(zhì)量控制提供了一種新方法。

1 材料與方法

1.1 材料 氣相色譜儀(Agilent 6890N，火焰離子化檢測器FID，美國 Agilent公司，配B04.01C 化學(xué)工作站)；電子天平(AB135-S，瑞士METTLER TOLEDO 公司，精度為0.01 mg)；馬拉硫磷對照品(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，批號(hào)H0671311，含量為99.0%)；鄰苯二甲酸二丙酯內(nèi)標(biāo)物質(zhì)(北京曼哈格生物科技有限公司，批號(hào)B0002771，含量為99.5%)；精制馬拉硫磷溶液(來源：企業(yè)1，規(guī)格：70%，批號(hào)：2019042801、2019042802、2019042803；規(guī)格：45%，批號(hào)：2019042701、2019042702、2019042703；企業(yè)2，規(guī)格：20%，批號(hào)20171201、20171202、20171203)；精制馬拉硫磷原料(企業(yè)1提供，含量為96.5%)；空白輔料(乳化劑0202-C，乳化劑DZ-0248，乳化劑150，企業(yè)1和企業(yè)2提供)；丙酮(色譜級(jí)，德國默克公司，批號(hào)1404012802)。

1.2 方法

1.2.1 氣相色譜條件 色譜柱：Agilent HP-5毛細(xì)管柱(固定相：5%苯基-95%甲基聚硅氧烷，規(guī)格：30 m×0.320 mm×0.25 μm)；柱溫：230 ℃；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；檢測器溫度(FID)：265 ℃；載氣：氮?dú)?；流速? mL/min；進(jìn)樣體積：1 μL(分流比50 ∶1)。

1.2.2 溶液制備

1.2.2.1 內(nèi)標(biāo)溶液的制備 取鄰苯二甲酸二丙酯適量，加丙酮溶解并稀釋成每1 mL中含20 mg的溶液，搖勻，作為內(nèi)標(biāo)溶液。

1.2.2.2 對照品溶液的制備 取馬拉硫磷對照品約0.22 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入1.2.2.1項(xiàng)的內(nèi)標(biāo)溶液5 mL，密塞，振搖使溶解，作為對照品溶液。

1.2.2.3 供試品溶液的制備 分別取規(guī)格為20%供試品約1.10 g，規(guī)格為45%供試品約0.49 g，規(guī)格為70%供試品約0.31 g(約相當(dāng)于精制馬拉硫磷0.22 g)，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入1.2.2.1項(xiàng)的內(nèi)標(biāo)溶液5 mL，密塞并振搖使溶解，分別作為規(guī)格為20%、45%和70%的供試品溶液。

1.2.2.4 線性溶液的制備 取馬拉硫磷對照品適量，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入1.2.2.1項(xiàng)的內(nèi)標(biāo)溶液5 mL，分別配制濃度為35.2、39.6、44.0、48.4、52.8 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)線性系列溶液。

1.2.2.5 回收率供試品溶液的制備 取空白輔料乳化劑DZ-0248、乳化劑150和精制馬拉硫磷原料，按處方比例分別制備成規(guī)格為20%和45%精制馬拉硫磷溶液各6份；取空白輔料乳化劑0202-C和精制馬拉硫磷原料制備成規(guī)格為70%精制馬拉硫磷溶液6份；取上述制備的供試品適量，精密稱定，分別置于具塞錐形瓶中，精密加入1.2.2.1項(xiàng)的內(nèi)標(biāo)溶液5 mL，密塞并振搖使溶解，分別作為回收率供試品溶液。

1.2.3 供試品測定 分別取對照品溶液和供試品溶液，按1.2.1項(xiàng)的色譜條件操作，分別注入氣相色譜儀，得對照品和供試品溶液中馬拉硫磷和鄰苯二甲酸二丙酯的峰面積，按內(nèi)標(biāo)法計(jì)算供試品中馬拉硫磷含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜系統(tǒng)適用性考察 分別取對照品溶液及20%、45%和70%的供試品溶液，按1.2.1項(xiàng)的氣相色譜條件操作，分別對馬拉硫磷主峰的保留時(shí)間、馬拉硫磷主峰和鄰苯二甲酸二丙酯主峰的分離度、馬拉硫磷主峰的理論板數(shù)進(jìn)行考察，結(jié)果見表1和圖1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，對照品溶液和供試品溶液中馬拉硫磷主峰保留時(shí)間約為4.5 min，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在0.07%～0.18%之間；馬拉硫磷主峰和鄰苯二甲酸二丙酯主峰的分離度均大于10，RSD均在0.18%～0.27%之間；馬拉硫磷主峰的理論板數(shù)均大于20000，RSD在0.30%～0.46%之間，具有較好的色譜系統(tǒng)適用性。

表1 氣相色譜系統(tǒng)適用性試驗(yàn)考察結(jié)果(n=6)Tab 1 Results of the chromatographic system suitability(n=6)

圖1 對照品溶液和供試品溶液氣相色譜圖Fig 1 The chromatogram of the standard solution and the sample solution

2.2 線性關(guān)系考察 分別取1.2.2.4項(xiàng)中標(biāo)準(zhǔn)線性系列溶液1 μL，注入氣相色譜儀，按1.2.1項(xiàng)的氣相色譜條件操作，計(jì)算馬拉硫磷峰面積與鄰苯二甲酸二丙酯(內(nèi)標(biāo))峰面積的比值，以馬拉硫磷濃度(x)為橫坐標(biāo)，馬拉硫磷峰面積與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰面積比值(y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表2。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在馬拉硫磷濃度在35.2～52.8 mg/mL范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

2.3 回收率試驗(yàn) 分別取1.2.2.5項(xiàng)中回收率供試品溶液，按1.2.3項(xiàng)進(jìn)行測定，記錄色譜圖，按內(nèi)標(biāo)法計(jì)算測定結(jié)果，結(jié)果見表3。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，制備的20%精制馬拉硫磷溶液的平均回收率為99.5%，標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)為0.2%，RSD為0.2%；制備的45%精制馬拉硫磷溶液的平均回收率為99.6%，標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)為0.3%，RSD為0.3%；制備的70%精制馬拉硫磷溶液的平均回收率為98.6%，標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)為0.3%，RSD為0.3%，方法的準(zhǔn)確度較好。

表2 馬拉硫磷的線性關(guān)系Tab 2 Linear relationship of malathion

表3 回收率試驗(yàn)測定結(jié)果Tab 3 Method recovery test results

2.4 精密度試驗(yàn)

2.4.1 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取馬拉硫磷對照品溶液1份，重復(fù)進(jìn)樣6次，按內(nèi)標(biāo)法計(jì)算校正因子，檢驗(yàn)系統(tǒng)測定的重復(fù)性；取供試品一批，分別制備成供試品溶液6份進(jìn)行測定，計(jì)算馬拉硫磷和鄰苯二甲酸二丙酯峰面積比值，檢驗(yàn)供試品測定的重復(fù)性，結(jié)果見表4。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，校正因子的RSD為0.47%；6份供試品峰面積比值的RSD為1.07%，系統(tǒng)和供試品測定重復(fù)性均良好。

2.4.2 中間精密度實(shí)驗(yàn) 分別取規(guī)格為20%、45%和70%的供試品各一批，分別于不同日期和不同人員，對上述供試品的含量進(jìn)行測定，結(jié)果見表5。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同日期和不同人員對規(guī)格為20%馬拉硫磷含量測定結(jié)果的RSD為0.20%、規(guī)格為45%的RSD為0.10%、規(guī)格為70%的RSD為0.10%，精密度均較好。

表4 方法的重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Tab 4 Repeatability test results of the method

表5 方法的中間精密度試驗(yàn)結(jié)果Tab 5 Intermediate precision test results of the method

2.5 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn) 取規(guī)格為20%、45%和70%的供試品溶液各一批，室溫放置，分別于0、2、4、6、8、10、16、24 h后采集色譜圖，考察馬拉硫磷和鄰苯二甲酸二丙酯峰面積的變化情況，在0～10 h，規(guī)格為20%、45%和70%的供試品溶液測得馬拉硫磷和鄰苯二甲酸二丙酯峰面積的RSD均小于1.5%；在16 h后峰面積均存在一定程度的下降。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，供試品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 供試品含量測定 分別取企業(yè)1規(guī)格為45%和70%的供試品及企業(yè)2規(guī)格為20%的供試品各3批，進(jìn)行含量測定。結(jié)果見表6。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，3個(gè)規(guī)格9批次供試品含量的平均標(biāo)示量的RSD均小于0.5%。

表6 供試品測定結(jié)果(n=3)Tab 6 Results of sample determination(n=3)

3 討論與結(jié)論

3.1 方法的選擇 目前，從精制馬拉硫磷含量測定的文獻(xiàn)報(bào)道來看，精制馬拉硫磷原料可采用HPLC法測定[11-12]，結(jié)果相對可靠；精制馬拉硫磷溶液含量測定有HPLC法[13]和GC法[5,7-8]，其中GC法含量測定均為填充柱氣相色譜法，采用該法測定精制馬拉硫磷溶液含量的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性均較差；本實(shí)驗(yàn)也參考了文獻(xiàn)報(bào)道方法[11-13]對精制馬拉硫磷溶液(規(guī)格20%、45%和70%)含量測定進(jìn)行了優(yōu)化研究，結(jié)果表明，對規(guī)格為20%和45%的精制馬拉硫磷溶液，由于其輔料組成較規(guī)格為70%的要復(fù)雜，馬拉硫磷主峰與雜質(zhì)峰很難通過優(yōu)化方法來進(jìn)行分離，導(dǎo)致含量測定結(jié)果的不準(zhǔn)確，故HPLC法不適用于規(guī)格為20%和45%精制馬拉硫磷溶液含量的測定。采用建立的毛細(xì)管柱氣相色譜法就較好的解決了上述難題，大大縮短了分析時(shí)間，且結(jié)果可靠、準(zhǔn)確。

3.2 檢測器的選擇 目前氣相色譜用于馬拉硫磷含量測定的檢測器主要有火焰離子化檢測器(FID)[5,7-8]、火焰光度檢測器(FPD)[9]、氮磷檢測器(NPD)[10]，其中FPD和NPD適用于樣品中痕量或微量馬拉硫磷的測定，精制馬拉硫磷溶液的含量測定為常量分析，F(xiàn)ID作為高靈敏度通用性檢測器，適用于常量馬拉硫磷含量測定，響應(yīng)快，峰形好，色譜系統(tǒng)適用性試驗(yàn)結(jié)果滿意，故選擇FID是適宜的。

3.3 內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的選擇 在收載的標(biāo)準(zhǔn)中采用丙體六六六作為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)[8]，其不易獲得，且其毒性較大，長時(shí)間使用會(huì)對檢測人員及環(huán)境造成危害，在研究過程中選擇了毒性相對較弱的鄰苯二甲酸二丙酯作為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，其色譜峰的位置與馬拉硫磷主峰的位置相近，且與精制馬拉硫磷溶液中各組分的色譜峰均能完全分離。

3.4 柱溫的選擇 色譜柱溫在150～250 ℃范圍內(nèi)對樣品進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果表明，柱溫為230 ℃的恒溫條件下，馬拉硫磷主峰、內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰、溶劑峰、雜質(zhì)峰的分離效果均較好且保留時(shí)間的重復(fù)性也較好，縮短了分析時(shí)間。

采用毛細(xì)管柱氣相色譜法測定精制馬拉硫磷溶液含量，該方法操作簡便易行，專屬性強(qiáng)、準(zhǔn)確性高、重復(fù)性好等特點(diǎn)，適用于精制馬拉硫磷溶液含量測定的質(zhì)量控制。