王磊，楊承槐，王團結，劉瑩

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

原代細胞用于生物制品的生產(chǎn)已有50多年的歷史，但是其存在傳代次數(shù)有限、組織來源很難保證均一穩(wěn)定、生產(chǎn)成本較高等諸多制約因素。傳代細胞系作為理想的替代用生產(chǎn)基質可以很好地克服以上缺點。為確保生物制品的安全性，在進行生物制品研發(fā)生產(chǎn)前，應對作為生產(chǎn)用的傳代細胞系進行致瘤性檢驗[1-3]。用于研發(fā)和生產(chǎn)的傳代細胞系致瘤性與否會直接關系到相關生物制品的種類、生產(chǎn)用細胞最高代次的限定以及相關質量標準的制定等諸多方面[4-5]。目前WHO和我國藥典對于細胞致瘤性檢驗推薦的方法主要是動物體內(nèi)接種法[1-3]。體內(nèi)法具有檢驗敏感性好、判定結果直觀、結果重復性好等諸多優(yōu)點，是針對細胞致瘤性檢驗的“金標準”。

中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心(國家獸醫(yī)微生物資源平臺)保藏的羊睪丸細胞系(OA3.Ts)、牛腎細胞系(MDBK)、小鼠成纖維細胞系(McCoy)、豬睪丸細胞系(ST)、豬腎細胞系(PK-15)、猴腎細胞系(Marc-145)均是獸用生物制品研發(fā)生產(chǎn)中的常見傳代細胞系。其中OA3.Ts、MDBK對羊痘病毒、羊口瘡病毒、牛病毒性腹瀉病毒等牛羊病病毒易感，可作為草食動物疫病疫苗研發(fā)生產(chǎn)用細胞[6-7]； McCoy是針對導致豬回腸炎的勞森菌的最佳體外宿主，可用于豬回腸炎疫苗的研發(fā)生產(chǎn)； ST、PK-15和Marc-145均對多種病毒易感并已用于疫苗生產(chǎn)[8]。

鑒于目前對上述非禽源細胞系的致瘤性研究報道較少，本研究采用動物體內(nèi)接種法對上述6種常見生產(chǎn)用傳代細胞系的基礎代次進行致瘤性研究，為生產(chǎn)用傳代細胞系的安全性評價提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

1.1.1 細胞 BHK-21細胞第55代、Marc-145細胞第18代、McCoy細胞(原始代次不明)第18代、ST細胞第125代、OA3.Ts細胞第29代、MDBK 細胞第9代、PK-15 細胞第135代，上述使用的細胞均為基礎種子庫細胞，由中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心保藏。雞胚成纖維細胞(CEF)為中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心細胞實驗室使用SPF雞胚自行分離的原代細胞。

1.1.2 實驗動物 Nu-Nu品系裸鼠，雌性，6～8周齡，共80只，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，飼養(yǎng)于中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所大興生物實驗基地。飼養(yǎng)期間各組裸鼠飲用水均為高壓滅菌純凈水，飼料及墊料均為輻照滅菌產(chǎn)品，由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所基礎保障處提供。飼養(yǎng)環(huán)境：晝夜各半循環(huán)照明，濕度恒定，溫度控制在22～25 ℃。所有操作均符合中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所實驗倫理要求。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組 將80只裸鼠隨機分為8組，處理組分為MDBK細胞組、OA3.Ts細胞組、Marc-145細胞組、McCoy細胞組、PK-15細胞組、ST細胞組，每種細胞培養(yǎng)物注射10只裸鼠。BHK-21細胞陽性對照組和雞胚成纖維細胞陰性對照組各注射10只裸鼠。

1.2.2 細胞培養(yǎng)物收集與接種 每種細胞培養(yǎng)10個175 cm2培養(yǎng)瓶的細胞量。按《中國獸藥典》方法消化、收集每種細胞系的細胞培養(yǎng)物懸液進行細胞計數(shù)后，1000 r/min離心10 min收集細胞沉淀，用無血清DMEM重懸。每只裸鼠頸背部消毒后，于皮下注射約0.3 mL細胞培養(yǎng)物。處理組每只裸鼠注射107以上個細胞。BHK-21細胞陽性對照組和雞胚成纖維細胞陰性對照組注射106以上個細胞(表1)。

表1動物分組Tab 1 Experimental animal grouping

1.2.3 接種后觀察與剖檢 接種后的裸鼠連續(xù)觀察35日，檢查有無結節(jié)或腫瘤形成。如有結節(jié)或可疑病灶需進行剖檢。對未發(fā)生結節(jié)的動物，取一半數(shù)量進行剖檢。對另一半未發(fā)生結節(jié)的動物繼續(xù)觀察至12周，對接種部位進行剖檢，觀察有無結節(jié)形成。BHK-21細胞陽性對照組和雞胚成纖維細胞陰性對照組35日后全部進行剖檢。

1.2.4 組織切片取材、制備及病理學檢查 斷頸處死裸鼠，所有處理組和對照組裸鼠剖檢后均需進行組織病理學檢查。取注射部位附近皮膚組織、肝臟組織、腎臟組織、脾臟組織，如處理組和陽性對照組剖檢發(fā)現(xiàn)結節(jié)或可疑病灶，則取出裸鼠皮下結節(jié)及可疑病灶，均放入4%多聚甲醛固定24～48 h。將固定后的樣品制備石蠟包埋切片后，經(jīng)H-E染色后鏡檢。

2 結果與分析

2.1 陽性、陰性對照組結果 經(jīng)觀察35日后，BHK-21細胞陽性對照組的裸鼠頸背部接種部位均發(fā)現(xiàn)有明顯腫塊(表2)，且結節(jié)直徑4～10 mm左右，精神萎頓、采食量下降；經(jīng)剖檢發(fā)現(xiàn)，全部小鼠的肝臟、腎臟、脾臟、肺臟均無明顯結節(jié)(圖1A)。對小鼠腫塊、肝臟、腎臟、脾臟、肺臟進行組織切片檢測發(fā)現(xiàn)：結節(jié)組織腫瘤細胞體積偏大，細胞核與細胞質的比例增大，細胞核形態(tài)大小不一，染色質粗糙，出現(xiàn)病理性核分裂象，肝臟、腎臟、脾臟組織未發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞(圖2A)。此外，陽性對照組中一只裸鼠在肺臟部位發(fā)現(xiàn)有病理性核分裂象的存在，疑似發(fā)生了腫瘤細胞肺部轉移的現(xiàn)象(圖2B)。由圖1B可知，注射CEF細胞的陰性對照組小鼠未見結節(jié)或可疑腫瘤組織，精神、飲食未出現(xiàn)異常表現(xiàn)。取10只裸鼠進行剖檢并對注射部位皮膚、肝臟、腎臟、脾臟進行組織切片檢測，未發(fā)現(xiàn)有腫瘤細胞。

表2 各組裸鼠成瘤數(shù)量統(tǒng)計Tab 2 Experimental animal grouping

2.2 實驗處理組結果 實驗處理組，注射ST、MDBK、OA3.Ts細胞的3組裸鼠，觀察35日精神、飲食未出現(xiàn)異常表現(xiàn)，均未見結節(jié)或可疑腫瘤組織(圖1C、圖1G、圖1H)。各組取各5只裸鼠進行剖檢，并對注射部位皮膚、肝臟、腎臟、脾臟、肺臟進行組織切片檢測，未發(fā)現(xiàn)有腫瘤細胞。繼續(xù)飼養(yǎng)觀察

箭頭所指位置為結節(jié)或可疑病灶 A：BHK-21細胞陽性對照組；B：CEF細胞陰性對照組；C：ST細胞處理組 D：PK-15細胞處理組； E：McCoy細胞處理組；F：Marc-145細胞處理組；G：MDBK細胞處理組；H：OA3.Ts細胞處理組 A: Positive control (BHK-21 group)； B: Negative control (CEF cell group)； C: ST cell group; D: PK-15 cell group; E: McCoy cell group; F: Marc-145 cell group; G: MDBK cell group; H: OA3.Ts cell group圖1 裸鼠大體解剖學檢查Fig 1 The gross anatomy examination of the nude mice

至12周，對各組剩余裸鼠進行剖檢并對注射部位皮膚、肝臟、腎臟、脾臟、肺臟進行組織切片檢測，均未發(fā)現(xiàn)有腫瘤細胞。在35日觀察期內(nèi)，注射Marc-145、McCoy、PK15細胞的3組裸鼠均出現(xiàn)精神萎頓、采食量下降，接種部位有可疑腫塊組織。PK15、Marc-145接種組腫塊直徑2～8 mm(圖1D、圖1F)；McCoy細胞接種組腫塊直徑5～15 mm，有豐富的血管組織且部分表皮破潰(圖1E)。對3個處理組的取樣腫塊分別進行組織切片檢測，均發(fā)現(xiàn)廣泛病理性核分裂象，為鱗狀細胞癌細胞(圖2C、圖2D、圖2E)。此外，3個處理組裸鼠肝臟、腎臟、脾臟、肺臟均無明顯結節(jié)和病理變化。

A：BHK-21細胞陽性對照組注射部位腫塊；B：BHK-21細胞陽性對照組肺部轉移瘤；C：Marc-145細胞處理組 注射部位腫塊 D：McCoy細胞處理組注射部位腫塊；E: PK-15細胞處理組注射部位腫塊 A: Positive control (BHK-21 group)； B: BHK-21 cell positive control group lung metastasis; C: Mass at injection site in Marc-145 cell treatment group; D: Mass at injection site in McCoy cell treatment group; E: Mass at injection site in PK-15 cell treatment group圖2 陽性對照組、處理組可疑腫塊病理切片檢查 HE 400×Fig 2 Histopathological examination of suspicious mass in positive control group and treatment group

3 討論與結論

傳代細胞系一般是由人或動物腫瘤組織或正常組織的細胞轉化而來[2]，在轉化的過程中會獲得與原始細胞不同的生物學特性，如：細胞中染色體的數(shù)量或是結構發(fā)生改變；細胞錨定依賴性的消失以及細胞致瘤性的發(fā)生。根據(jù)以上特性，可將轉化可分為一般轉化和惡性轉化。一般轉化細胞培養(yǎng)時伸展良好、有方向性、接觸抑制且具有錨定依賴性，無致瘤性。惡性轉化細胞培養(yǎng)時細胞伸展性差、接觸抑制消失，并不具備錨定依賴性，可在軟瓊脂內(nèi)增殖，接種裸鼠皮下可致瘤[9-10]。隨著傳代細胞系在生物制品領域的廣泛應用，致瘤性陽性的傳代細胞系能否作為生產(chǎn)用細胞基質及其對生物制品安全性的影響逐漸成為疫苗研發(fā)、評審、監(jiān)管機構關心和討論的問題[11]。

2015版《中華人民共和國獸藥典》在使用動物體內(nèi)接種法評價生產(chǎn)用細胞基質的致瘤性時，主要檢查接種待檢細胞的活培養(yǎng)物在動物體內(nèi)是否成瘤，其目的是為了確定細胞基質接種動物后形成(腫)瘤的能力，檢查細胞系動物體內(nèi)成瘤的特性。本研究針對6種細胞的基礎代次進行了致瘤性檢查，結果表明：MDBK細胞、OA3.Ts細胞、ST細胞不會引起裸鼠發(fā)生腫瘤，具有良好的安全性。由于某些細胞傳代次數(shù)增加會增加致瘤風險[1]，因此以上三種細胞用于生物制品的研發(fā)或生產(chǎn)時，還應對其限定的生產(chǎn)最高代次細胞進行致瘤性檢查，以確保傳代的過程不會增強細胞致瘤性。McCoy細胞、PK-15細胞、Marc-145細胞基礎代次致瘤性檢查呈陽性，用于獸用滅活疫苗的生產(chǎn)時，應進行適當處理，如凍融或超聲波裂解細胞[12]，使用β-丙內(nèi)酯或二乙烯亞胺降解細胞核酸[13]，超濾去除細胞碎片等，以減低細胞致瘤風險。

為了保證疫苗的安全性，應盡可能使用低代次的細胞用于疫苗生產(chǎn)，參考WHO 相關指南、《歐洲藥典》、《中國藥典》三部，建議在細胞系生產(chǎn)的疫苗質量標準中增加細胞DNA 殘留量限定標準，降低細胞性致瘤性和致癌性的風險。從長遠來講，解決問題的最佳辦法是開發(fā)無致瘤性細胞系。