王 鵬， 左 斌， 唐家國， 何精選

(長江航運(yùn)總醫(yī)院骨科， 湖北 武漢 430014)

下腰痛是椎間盤退變(intervertebral disc degeneration，IVDD)的主要癥狀，每年在全球影響數(shù)以百萬人的正常生活，這導(dǎo)致了重大的經(jīng)濟(jì)和社會負(fù)擔(dān)[1,2]。因此闡明椎間盤退變的確切機(jī)制很重要，以便確定這種殘疾的新療法。miRNA在人類多種疾病中的重要調(diào)控作用得到很多研究的認(rèn)可，其中包括椎間盤退變[3]。但是仍有部分新發(fā)現(xiàn)的miRNA在疾病中的功能仍待開發(fā)，如miR-663b在椎間盤退變中的功能尚未十分清楚。本研究旨在探索miR-663b對椎間盤退變髓核細(xì)胞增殖、凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1材料:組織樣本來自本醫(yī)院2019年2月至2019年12月期間確診收治的人椎間盤退變患者22例及外傷致脊柱爆裂性骨折患者22例，所有患者和家屬均簽署知情同意書，并獲得本醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會的批準(zhǔn)。納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡在60歲以下、臨床表現(xiàn)腰痛及一側(cè)下肢疼痛麻木、Lasegue陽性、DR和CT檢查顯示L4/5或L5/S1椎間盤突出；排除標(biāo)準(zhǔn)：腰椎滑脫、腫瘤、感染者，外傷引起的椎間盤突出者，患者心、肺、肝、腎功能障礙者。細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶抑制因子1A(cyclin-dependent kinase inhibitor 1A，P21)蛋白抗體CDKN1A購自上海雅吉生物科技有限公司；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Cysteine aspartic protease，Caspase-3)兔多克隆抗體(ab44976)購自博士德生物工程有限公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗購自武漢艾美捷科技有限公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(cell counting kit，CCK-8)購自Dojindo公司；膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(membrane-linked protein V-fluorescein isothiocyanate/ propidine iodide，Annexin V-FITC/PI)雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自碧云天生物研究所。所涉及的重組質(zhì)粒、引物均送至上海吉瑪公司完成。

1.2方 法

1.2.1細(xì)胞的分離培養(yǎng):參考張世磊等[4]的方法分離、培養(yǎng)人椎間盤髓核細(xì)胞。將清洗過的椎間盤組織用無菌組織剪剪碎，將其用0.25%胰酶消化1h，離心，收集沉淀細(xì)胞。將收集的細(xì)胞用20%的DMEM完全培養(yǎng)基在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)、傳代。

1.2.2細(xì)胞分組:把正常培養(yǎng)的人椎間盤退變髓核細(xì)胞隨機(jī)分為對照組、低糖組、低糖組+miR-NC組、低糖組+miR-663b組、低糖組+anti-miR-NC組、低糖組+anti-miR-663b組。各個組的處理方式為：對照組，葡萄糖濃度為5mmoL/L的培養(yǎng)液培養(yǎng)人椎間盤退變髓核細(xì)胞48h；低糖組：葡萄糖濃度為1mmoL/L的培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞48h；低糖組+miR-NC組(轉(zhuǎn)染miR-NC)、低糖組+miR-663b組(轉(zhuǎn)染miR-663b mimics)、低糖組+anti-miR-NC組(轉(zhuǎn)染anti-miR-NC)、低糖組+anti-miR-663b組(轉(zhuǎn)染anti-miR-663b)為用3倍重組質(zhì)粒量的脂質(zhì)體與質(zhì)粒混合均勻，在與低糖組細(xì)胞共培養(yǎng)5 h，繼續(xù)添加新培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h，用qRT-PCR法檢測轉(zhuǎn)染的效率，確認(rèn)轉(zhuǎn)染成功后方可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3qRT-PCR實(shí)驗(yàn):將充分研磨的組織或需要檢測的細(xì)胞用總RNA抽提試劑盒提取總RNA，再用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，用作qRT-PCR實(shí)驗(yàn)的模板。按照qRT-PCR試劑盒要求操作，結(jié)果以U6為模板，2-△△Ct法計(jì)算miR-663b的表達(dá)。反應(yīng)條件為95℃，反應(yīng)5min，95℃變性15s，60℃退火，延伸30s，共40個循環(huán)。引物為：miR-663b，5'-TATTTTATTAAGGGGGAAGTGT-3'，5'-CCTCRATAAAAAAACCTTCTCT-3'；U6，5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。

1.2.4CCK-8實(shí)驗(yàn):將需要檢測的細(xì)胞用培養(yǎng)液調(diào)整至105個/mL，取其中100μL至于24孔板，再按照CCK-8試劑盒加入CCK-8反應(yīng)液，結(jié)果在450nm波長下檢測細(xì)胞的吸光值(OD值)。

1.2.5Western blot實(shí)驗(yàn):收集需要檢測的細(xì)胞，提取總蛋白并定量。將蛋白用于SDS-PAGE蛋白電泳，再將膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜。將帶有蛋白的膜用5%的脫脂奶粉封閉2h，再浸入一抗溶液(1∶1500)中4℃孵育過夜，次日再浸入二抗溶液(1∶1000)中37℃孵育2 h。最后，用電化學(xué)發(fā)光試劑盒對膜進(jìn)行顯影曝光。

1.2.6流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn):將需要檢測的細(xì)胞洗滌3次后重懸，再用結(jié)合緩沖液懸浮細(xì)胞。按照Annexin V-FITC/PI雙染試劑盒的要求操作，加入Annexin V-FITC、PI，避光反應(yīng)10min后，上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的凋亡情況。細(xì)胞凋亡率為早期細(xì)胞凋亡率與晚期細(xì)胞凋亡率之和。

1.2.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:實(shí)驗(yàn)中所有數(shù)據(jù)均使用SPSS22.0進(jìn)行分析，多組間數(shù)據(jù)的比較采用單因素方差分析聯(lián)合SNK-q檢驗(yàn)，兩組數(shù)據(jù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)意義。

2 結(jié) 果

2.1miR-663b在人正常椎間盤髓核組織和退變椎間盤髓核組織中的表達(dá):運(yùn)用qRT-PCR法檢測組織中miR-663b的表達(dá)水平，與人正常椎間盤髓核組織相比，人退變椎間盤髓核組織中miR-663b的表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，見表1。

表1 miR-663b在人正常椎間盤髓核組織和人退變椎間盤髓核組織中的表達(dá)

2.2過表達(dá)miR-663b對低糖誘導(dǎo)的人椎間盤退變髓核細(xì)胞的細(xì)胞活性的影響：通過CCK-8法檢測細(xì)胞的OD值，Western blot檢測細(xì)胞中P21的蛋白表達(dá)。結(jié)果如圖1和表2所示，與對照組相比，低糖組人椎間盤退變髓核細(xì)胞中miR-663b表達(dá)顯著降低，細(xì)胞的OD值顯著降低，P21蛋白表達(dá)量顯著升高(P<0.05)；與低糖組+miR-NC組相比，低糖組+miR-663b組細(xì)胞中miR-663b表達(dá)上升，細(xì)胞的OD值明顯下降，P21蛋白表達(dá)量明顯升高(P<0.05)。

圖1 P21蛋白的表達(dá)

表2 過表達(dá)miR-663b對低糖誘導(dǎo)的人椎間盤退變髓核細(xì)胞的細(xì)胞活性的影響

表3 過表達(dá)miR-663b對低糖誘導(dǎo)的人椎間盤退變髓核細(xì)胞凋亡的影響

2.3過表達(dá)miR-663b對低糖誘導(dǎo)的人椎間盤退變髓核細(xì)胞凋亡的影響：流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞的凋亡，Western blot檢測細(xì)胞中Caspase-3的蛋白表達(dá)。結(jié)果如圖2和表3所示，與對照組相比，低糖組細(xì)胞凋亡率顯著升高，Caspase-3蛋白表達(dá)量明顯升高(P<0.05)；與低糖組+miR-NC組相比，低糖組+miR-663b組細(xì)胞凋亡率發(fā)生下調(diào)，Caspase-3蛋白表達(dá)量也發(fā)生下調(diào)(P<0.05)。

2.4抑制miR-663b對低糖誘導(dǎo)的人椎間盤退變髓核細(xì)胞的細(xì)胞活性的影響：結(jié)果如圖3和表4所示，與對照組相比，低糖組細(xì)胞中miR-663b明顯降低，細(xì)胞的OD值也發(fā)生下降，P21蛋白表達(dá)量明顯上升(P<0.05)；與低糖組+anti-miR-NC組相比，低糖組+anti-miR-663b組細(xì)胞miR-663b表達(dá)、細(xì)胞的OD值和P21蛋白表達(dá)量則發(fā)生相反的調(diào)控作用(P<0.05)。

表4 抑制miR-663b對低糖誘導(dǎo)的人椎間盤退變髓核細(xì)胞的細(xì)胞活性的影響

圖2 過表達(dá)miR-663b對低糖誘導(dǎo)的人椎間盤退變髓核細(xì)胞凋亡及Caspase-3蛋白表達(dá)的影響

圖3 P21蛋白的表達(dá)

2.5抑制miR-663b對低糖誘導(dǎo)的人椎間盤退變髓核細(xì)胞凋亡的影響：結(jié)果如圖4和表5所示，與對照組相比，低糖組細(xì)胞中細(xì)胞凋亡率明顯升高，Caspase-3蛋白表達(dá)量發(fā)生升高(P<0.05)；與低糖組+anti-miR-NC組相比，低糖組+anti-miR-663b組細(xì)胞的凋亡率和Caspase-3蛋白表達(dá)量發(fā)生相反的調(diào)控作用(P<0.05)。

圖4 抑制miR-663b對低糖誘導(dǎo)的人椎間盤退變髓核細(xì)胞凋亡及Caspase-3蛋白表達(dá)的影響

表5 抑制miR-663b對低糖誘導(dǎo)的人椎間盤退變髓核細(xì)胞凋亡的影響

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)，miR-663b在人退變椎間盤髓核組織和低糖誘導(dǎo)的人椎間盤退變髓核細(xì)胞中的表達(dá)均發(fā)生明顯的下調(diào)。胡凱等[5]在研究中發(fā)現(xiàn)，miR-663b在退變椎間盤髓核組織中的表達(dá)發(fā)生明顯的下調(diào)，這與此實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)果相一致，但是，miR-663b在人椎間盤退縮中的功能尚未清楚。近期有很多研究報(bào)道，miRNA在椎間盤退縮中的調(diào)控功能，如miR-125b-1-3p、miR-200c等[6]。miRNA在人類機(jī)體的很疾病的發(fā)生發(fā)展中均具有重要的調(diào)控作用，由于miRNA發(fā)生作用的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)異常復(fù)雜，因此其發(fā)揮作用的調(diào)控機(jī)制仍需探索。椎間盤退變的進(jìn)展涉及多種復(fù)雜因素，例如炎癥、氧化應(yīng)激、機(jī)械損傷和細(xì)胞衰老等[7]。

本研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-663b能夠促進(jìn)低糖誘導(dǎo)的人椎間盤退變髓核細(xì)胞的增殖，抑制凋亡，并上調(diào)其中P21、Caspase-3的蛋白表達(dá)，抑制miR-663b則具有相反的作用。胡凱等[5]在研究中提示，MMP2能夠促進(jìn)退變椎間盤細(xì)胞外基質(zhì)的降解，促進(jìn)椎間盤退變的發(fā)生，并且MMP2為miR-663b的直接靶標(biāo)，也就是說，在椎間盤退變中由于miR-663b的下調(diào)，上調(diào)了MMP2的表達(dá)，間接促進(jìn)了椎間盤的退縮。這暗示，miR-663b的模擬物對椎間盤退變的治療具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。這與此研究的觀點(diǎn)相吻合，均支持miR-663b在椎間盤退變過程中發(fā)揮積極的作用。不足之處為該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果尚未在動物體內(nèi)得到更充分的驗(yàn)證。P21在許多轉(zhuǎn)化細(xì)胞中受到p53通路的調(diào)控，細(xì)胞周期蛋白和CDKs在二元復(fù)合物中相互結(jié)合，形成細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制的核心。P21具有抑制細(xì)胞周期蛋白/CDK激酶的能力，并且過表達(dá)P21可能導(dǎo)致細(xì)胞周期的阻滯[8]。Caspase家族是細(xì)胞凋亡的核心。Caspase合成后以酶原的形式存在于細(xì)胞質(zhì)中，在Caspase接收到相關(guān)的信號指令后發(fā)生連鎖反應(yīng)，使Caspase被裂解和激活，進(jìn)而導(dǎo)致信號級聯(lián)放大，激活多種下游蛋白酶，從而啟動多種凋亡通路。caspase的裂解是一個可逆的過程，caspase-3的激活是一個不可逆的過程，caspase-3是凋亡信號的最終執(zhí)行者[9]。

綜上所述，miR-663b在椎間盤退變中異常下調(diào)，其可促進(jìn)椎間盤退變髓核細(xì)胞的增殖，抑制凋亡，對椎間盤退縮的治療具有理論參考價(jià)值。