陳園園 李明霞 劉穎 張子路 楊秋波

[摘要] 目的 制備特異性識別牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonas gingivalis，P.g）的單克隆抗體（monoclonal antibody，mAb）。 方法 ①采用雜交瘤的方法制備mAb，用P.g重組血凝素2（recombinant Hemagglutinin 2，rHA2）免疫BALB/c小鼠，間接ELISA篩選特異性識別P.g的雜交瘤細(xì)胞株;②間接ELISA檢測mAb的效價及識別P.g的特異性、敏感性。 結(jié)果 篩選到5株特異性識別P.g的mAbs，C10、F3、F3-2、G3和G3-2。其中，C10、G3和G3-2免疫球蛋白亞類為IgG2a型;F3和F3-2免疫球蛋白亞類為IgG1型。mAb C10、G3、F3和F3-2識別P.g的效價均>1∶128 000;mAb G3-2識別P.g的效價>1∶16 000;5株mAb識別rHA2的效價均>1∶128 000。5株mAb均特異性識別>5×105 cfu/mL的P.g ATCC33277。 結(jié)論 制備了5株特異性識別P.g的mAb，可用于各種免疫學(xué)技術(shù)，為開發(fā)P.g檢測工具提供了條件，對牙周病的診斷和治療有一定的意義。

[關(guān)鍵詞] 單克隆抗體;牙齦卟啉單胞菌;血凝素;雜交瘤技術(shù)

[中圖分類號] R781.4? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] B? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2020）18-0042-05

Preparation of specific anti-Porphyromonas gingivalis monoclonal antibody

CHEN Yuanyuan? ?LI Mingxia? ?LIU Ying? ?ZHANG Zilu? ?YANG Qiubo

School of Stomatology， Capital Medical University， Beijing Institute of Dental Research， Beijing? 100050， China

[Abstract] Objective To prepare specific anti-Porphyromonas gingivalis（P.g） monoclonal antibody（mAb）. Methods （1）mAb was prepared through the hybridoma method， BALB/c mice were immunized with recombinant hemagglutinin 2（rHA2）， and hybridoma cell lines were screened by indirect ELISA. （2）Indirect ELISA was used to detect the titer of mAb and to recognize the specificity and sensitivity of P.g. Results The five mAbs of C10， F3， F3-2， G3 and G3-2 were screened for specific recognition of P.g. Among them， C10， G3 and G3-2 immunoglobulin subclasses were the IgG2a type; F3 and F3-2 immunoglobulin subclasses were the IgG1 type. The titer of mAb C10， G3， F3 and F3-2 recognizing P.g was>1：128 000; the titer of mAb G3-2 recognizing P.g was>1：16 000; the titer of 5 mAbs recognizing rHA2 was>1：128 000. All specific mAbs recognize P.g ATCC33277 no less than 5×105 cfu/mL. Conclusion 5 mAbs for P.g specific recognition have been prepared， which can be used in various immunological techniques， providing conditions for the development of P.g detection tools. It is of a certain significance for the diagnosis and treatment of periodontal diseases.

[Key words] Monoclonal antibody; Porphyromonas gingivalis; Hemagglutinin; Hybridoma technique

牙周炎是牙周支持組織的破壞性疾病，是全球廣泛流行的口腔疾病之一。牙周炎不僅降低患者的生活質(zhì)量，還會給患者造成沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1]。2015年全球有35億人罹患口腔疾病，其中5.38億為重度牙周炎，隨著人口的不斷增長和老齡化，該數(shù)字會繼續(xù)增長[2]。牙周炎不僅是成年人失牙的主要因素，還是心血管疾病[3]、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[4]、糖尿病[5]以及阿爾茨海默癥[6]等系統(tǒng)性疾病的危險因素。在牙周致病菌中，牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonas gingivalis，P.g）被認(rèn)為是最主要的致病菌之一[7，8]，其口內(nèi)水平可以預(yù)測疾病的進(jìn)展[9]，且與以上系統(tǒng)性疾病均相關(guān)[10]，因此對P.g的檢測至關(guān)重要。目前P.g的檢測主要依靠實時定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time polymerase chain reaction，RT-PCR），但RT-PCR存在昂貴，需要提取、分離DNA，需要大型設(shè)備及熟練操作人員的問題而難以在臨床應(yīng)用[11]。隨著個性化醫(yī)療的發(fā)展，基于抗原抗體相互作用的椅旁檢測占據(jù)主導(dǎo)地位[12]，亟需制備P.g特異性的單克隆抗體（monoclonal antibody，mAb）來開發(fā)椅旁檢測裝置。

P.g依靠血凝素2（Hemagglutinin 2，HA2）與血紅素結(jié)合以獲取維持生存和感染能力所需要的鐵和卟啉[13]。Yang等[14]重組表達(dá)了HA2，測序結(jié)果與ATCC 33277 HA2序列100%相似，并通過結(jié)合實驗明確重組血凝素2（recombinant Hemagglutinin 2，rHA2）可以結(jié)合氯化血紅素。DeCarlo等[15]用rHA2免疫大鼠，可抑制 P.g感染引起的牙槽骨吸收，亦表明HA2在P.g感染中起重要作用。本研究用rHA2免疫小鼠制備P.g特異性的mAb，為P.g特異性檢測奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞

小鼠骨髓瘤細(xì)胞系Sp2/0-Ag14購于中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞中心。

1.2 菌株

P.g ATCC33277、381和臨床菌株;中間普氏菌（Prevotella intermedia，P.i）ATCC25611、具核梭桿菌（Fusobacterium necrophorum，F(xiàn).n）ATCC10953、黏性放線菌（Aggregatibacter viscosus，A.v）ATCC19246、伴放線放線桿菌（Aggregatibacter actinomycetemcomitans，A.a）ATCC24523、變形鏈球菌（Streptococcus mutans，S.m）血清c型均由北京口腔醫(yī)學(xué)研究所提供。

1.3 實驗動物

BALB/c小鼠（體重18～22 g、雌性、6周齡，用于免疫;體重>20 g、雌性、>10周齡，用于腹水制備），購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。

1.4主要試劑

rHA2由北京口腔醫(yī)學(xué)研究所制備保存并提供;mAb D1（抗孔雀石綠單抗，P.g無關(guān)單抗）購自北京點石科創(chuàng)生物技術(shù)有限公司;辣根過氧化物酶（Horseradish Peroxidase，HRP）標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;二喹啉甲酸（Bicin-choninic Acid，BCA）蛋白定量試劑盒購自康為世紀(jì)生物科技有限公司;Mouse單克隆抗體亞型鑒定試劑盒購自Proteintech Group;脫脂奶粉購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司;磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）購自HyClone;包被液、四甲基聯(lián)苯胺（3，3′，5，5′-Tetramethylbenzidine，TMB）顯色液、含0.05% Tween-20的PBS、終止液和氯化血紅素購自北京索萊寶科技有限公司;維生素K1購自國藥集團(tuán)容生制藥有限公司;腦心浸液（Brain Heart Infusion，BHI）購自O(shè)XOID，混合氣體（80% N2、10% H2和10% CO2）購自北京普萊克斯實用氣體有限公司。

1.5 細(xì)菌培養(yǎng)及計數(shù)

細(xì)菌培養(yǎng)：P.g、P.i、F.n和A.v在CDC固體培養(yǎng)基上37℃厭氧培養(yǎng)（80% N2、10% H2和10% CO2）5～7 d;A.a在TSBV固體培養(yǎng)基上37℃厭氧培養(yǎng)5 d;S.m在MSA固體培養(yǎng)基上37℃培養(yǎng)2 d后，革蘭染色鏡檢證實為純培養(yǎng)物后，挑取P.g、P.i、F.n、A.v和A.a菌落接種BHI液體培養(yǎng)基（BHI 37 g/L+5 mg氯化血紅素+10 mg維生素K1），37℃厭氧培養(yǎng)24 h;S.m菌落接種于MSA液體培養(yǎng)基中24 h。將菌液4℃、6500 g、離心10 min，棄上清，PBS洗兩次（4℃、7000 g、離心20 min）。細(xì)菌計數(shù)：菌液4℃、6500 g、離心10 min，棄上清，十倍比稀釋成10-1～10-7，用10-5、10-6和10-7稀釋的菌液涂布CDC固體培養(yǎng)基平板，100 μL/板，每個濃度涂布3個平板，厭氧培養(yǎng)7 d后計數(shù)，計算3個平板的平均菌落值;菌液2倍比從2～32倍稀釋，測定A600 nm，根據(jù)A600 nm對應(yīng)平板平均菌落數(shù)繪制散點圖，回歸分析生成標(biāo)準(zhǔn)曲線，每次測定P.g的A600nm，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算細(xì)菌濃度，將菌液稀釋至適當(dāng)濃度。

1.6 小鼠免疫、細(xì)胞融合、腹水制備、純化

小鼠免疫（6只用于rHA2免疫，2只制備陰性血清）、細(xì)胞融合、腹水制備和純化的具體方法參見文獻(xiàn)[16]。

1.7 陽性克隆篩選和克隆化培養(yǎng)

間接ELISA篩選陽性孔，用P.i、A.a、A.v、F.n和S.m作陰性對照篩選，得到特異性識別P.g的孔。將篩選的細(xì)胞株克隆培養(yǎng)，再次進(jìn)行特異性檢測，選擇分泌特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞株。

1.8 亞型測定

試劑盒室溫平衡30 min，用PBST將mAb 1∶2000稀釋，50 μL/孔，加山羊抗小鼠IgG+IgM-HRP 50 μL/孔，混勻，蓋上封板膜，室溫孵育1 h;PBST洗板3次，吸水紙拍干，加現(xiàn)配的顯色液（A∶B=1∶100）100 μL/孔，室溫避光顯色15 min;加終止液100 μL/孔;酶標(biāo)儀讀取A450nm結(jié)果，值最高孔對應(yīng)的HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG類型為相應(yīng)亞型。

1.9 單克隆抗體濃度測定

用PBS將BSA標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625和0 mg/mL，稀釋好的BSA標(biāo)準(zhǔn)品和待測蛋白（C10、G3稀釋5倍，G3-2稀釋3倍，F(xiàn)3、F3-2未稀釋）各25 μL/孔，每個濃度設(shè)置3個復(fù)孔;加200 μL/孔BCA工作液（BCA-A∶BCA-B= 50∶1），充分混勻，蓋上96孔板蓋，37℃孵育30 min;冷卻至室溫，測定A562nm結(jié)果;濃度對應(yīng)A562nm結(jié)果繪制散點圖得標(biāo)準(zhǔn)曲線，將待測蛋白A562nm代入曲線所得x值乘以稀釋倍數(shù)即待測蛋白的濃度。

1.10 單克隆抗體效價的測定

包被：酶標(biāo)板上加入100 μL/孔濃度為5×108 cfu/mL的P.g菌液或4 μg/mL rHA2，貼上封板膜，4℃過夜;封閉：倒掉孔內(nèi)液體，300 μL/孔PBST洗滌，甩干，在不脫纖維的紙上拍干，重復(fù)3次，300 μL/孔5%的脫脂奶粉37℃封閉1 h;加樣：洗滌3次，分別加入2倍比稀釋的單抗100 μL/孔，單抗均稀釋成0.5 mg/mL后，用樣?。?%脫脂奶粉：PBST=1∶15配制）二倍比從1∶1 000到1∶128 000稀釋，以不相關(guān)單抗D1作陰性對照，每個濃度設(shè)置3個復(fù)孔，37℃孵育30 min;加二抗：洗滌3次，加入1∶5000稀釋的HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG 100 μL/孔，37℃孵育30 min;顯色：洗滌4次，加入TMB顯色液100 μL/孔，室溫避光30 min;終止：加入50 μL/孔的終止液;讀數(shù)：立即用酶標(biāo)儀讀取A450 nm結(jié)果。結(jié)果判定：按三復(fù)孔的平均值計算，mAb的A450 nm值為（P），D1的A450 nm為陰性對照（N），P/N>2為陽性，表明當(dāng)前稀釋倍數(shù)時mAb識別P.g或rHA2。

1.11 單克隆抗體特異性檢測

包被5×107 cfu/mL的P.g、P.i、F.n、A.a、A.v和S.m;mAb均1∶1000稀釋;其余操作步驟同效價測定。結(jié)果判定：P/N>2為陽性，表明mAb識別該細(xì)菌。

1.12單克隆抗體敏感性檢測

分別包被十倍比稀釋從5×108到50 cfu/mL的ATCC33277、381和臨床菌株;mAb均1∶1000稀釋;其余操作步驟同效價測定。結(jié)果判定：P/N>2為陽性，表明mAb識別該濃度的P.g。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌計數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線

10-6稀釋的菌液涂布的平板上平均有124個菌落，根據(jù)平板計數(shù)得P.g的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.2745x-0.0007，R2=0.9997，見圖1。

2.2 小鼠免疫

免疫的6只小鼠中僅小鼠5特異性識別P.g，選擇小鼠5進(jìn)行細(xì)胞融合。

2.3 陽性克隆篩選和克隆化培養(yǎng)

經(jīng)融合、篩選及亞克隆得到特異性識別P.g的雜交瘤細(xì)胞5株，命名為C10、F3、F3-2、G3和G3-2。

2.4 單克隆抗體亞型鑒定

mAb C10、G3、G3-2亞型為IgG2a型，輕鏈為λ鏈;mAb F3、F3-2亞型為IgG1型，輕鏈為k鏈，見表1。

注：標(biāo)*數(shù)值對應(yīng)mAb亞型為相應(yīng)mAb的亞型

2.5 單克隆抗體的濃度

標(biāo)準(zhǔn)曲線y=1.0494x-0.0425，R2=0.9961，見圖2。mAb C10、F3、F3-2、G3和G3-2的A562nm值分別為1.053、1.056、0.481、1.591和1.134，濃度分別為5、1、0.5、7.8和3.4 mg/mL。

2.6 單克隆抗體的效價

見封三圖3，mAb C10、F3、F3-2和G3識別P.g的效價>1∶128 000，mAb G3-2識別P.g的效價>1∶16 000，見封三圖3a;mAb C10、F3、F3-2、G3和G3-2識別rHA2的效價均>1∶128 000，見封三圖3b。

2.7 單克隆抗體識別P.g菌株的特異性

mAb C10、F3、F3-2、G3和G3-2僅在檢測P.g時P/N>2，與P.i、F.n、A.a、A.v和S.m均無交叉反應(yīng)，特異性良好，見封三圖4。

2.8 單克隆抗體識別P.g菌株的敏感性

mAb C10、F3、F3-2、G3和G3-2均識別>5×105 cfu/mL的ATCC33277;mAb C10、F3、F3-2和G3均識別>5×106 cfu/mL的381，mAb G3-2識別>5×107 cfu/mL的381;mAb C10、F3、F3-2和G3均識別>5×105 cfu/mL的P.g臨床菌株，mAb G3-2識別>5×106 cfu/mL的P.g臨床菌株，見封三圖5。

3 討論

本研究利用P.g ATCC33277的rHA2免疫BALB/c小鼠，得到了5株效價較高的mAb。5株mAb不僅識別實驗室菌株ATCC33277、381，還識別P.g臨床菌株。5株mAb與口腔內(nèi)常見細(xì)菌P.i、F.n、A.a、A.v和S.m無交叉反應(yīng)，可以特異性識別P.g。

在口腔菌群中，鏈球菌屬、放線菌屬、普氏菌屬、梭桿菌屬是豐度很高的菌屬[17]。其中A.v和S.m是常見的致齲菌，S.m血清c型的檢出率可達(dá)80%;A.a是局限性侵襲性牙周炎的主要致病菌;P.i形態(tài)及一些致病性與P.g相似;F.n有很強(qiáng)的粘附性，常與P.g聚集，因此選擇P.i、F.n、A.a、A.v和S.m作為對照進(jìn)行了mAb的特異性檢測。本研究mAb的敏感性檢測中，應(yīng)用的菌株數(shù)量較少，后續(xù)實驗將增加檢測的菌株類型。

相比于多克隆抗體，mAb因其效價高、特異性好而被廣泛應(yīng)用于ELISA、側(cè)流免疫層析等以抗體-抗原結(jié)合為基本原理的免疫分析技術(shù)中[18]，尤其微生物檢測和疾病診斷領(lǐng)域[19-20]。Booth等[21]以P.gW83為抗原制備的Mab 61BG1.3，可以識別22個P.g實驗室菌株和105個臨床分離菌株。但是全菌成分較復(fù)雜，易引起交叉反應(yīng)，所以研究P.g的主要毒力因子，利用其具有誘導(dǎo)免疫保護(hù)作用的抗原有望成功制備P.g特異性抗體。P.g細(xì)胞表面和外膜囊泡中40 KDa的外膜蛋白（outer membrane protein，OMP）是P.g共聚集和血紅素凝集的毒力因子之一，且具有免疫保護(hù)作用;Imamura等[22]用P.gW83的OMP40免疫小鼠制備了mAb，用口腔和呼吸道常見的細(xì)菌作對照驗證了mAb的特異性，但未提供mAb的敏感性數(shù)據(jù)。牙齦素（包括精氨酸和賴氨酸特異性蛋白酶復(fù)合物）是P.g獨特的蛋白酶，該蛋白酶在細(xì)菌粘附、定植，組織破壞，血紅蛋白的結(jié)合和降解，宿主防御失活和宿主免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用。研究表明，精氨酸和賴氨酸特異性蛋白酶的粘附區(qū)（haemagglutinin/adhesin，HA）在牙齦素的致病中起主要作用。HA1在菌株間高度保守，HA1免疫小鼠可以對P.g引起的牙周炎起到保護(hù)作用，抗HA1抗體可以抑制蛋白水解;OBrien-Simpson等[9]用P.gW50的HA1免疫小鼠制備了mAb，mAb可以特異性識別>2×102的P.g。HA2是P.g與血紅蛋白和血紅素結(jié)合的主要參與者[13]，Yang等[14]重組表達(dá)的HA2在菌株間相似性>98%，rHA2的氯化血紅素結(jié)合位點多肽免疫大鼠可以產(chǎn)生保護(hù)作用[23];本研究用ATCC 33277的rHA2免疫小鼠制備mAb，制備的mAb能特異性識別>5×105 cfu/mL的P.g。造成OBrien-Simpson等制備的mAb和本研究中mAb識別閾值差異的原因可能為：①檢測的實驗室菌株不同，前者用P.gW50，本研究應(yīng)用P.gATCC 33277;②實驗方法不同，前者ELISA實驗應(yīng)用兩種二抗（山羊抗小鼠IgG和HRP標(biāo)記的兔抗山羊IgG），有信號放大作用;本研究中應(yīng)用HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG。

RT-PCR檢測牙周炎患者齦下菌斑中P.g均>106 cfu/mL[24-26]，本研究制備的mAb能識別>5×105 cfu/mL的P.g，可以用于齦下菌斑中P.g的檢測。P.g是牙周炎病變區(qū)或活動部位最主要的優(yōu)勢菌，牙周炎治療后復(fù)發(fā)或病情繼續(xù)加重與P.g存在有關(guān)[24]。牙周炎患者治療效果不佳時，用P.g特異性的抗體進(jìn)行微生物評估，可以幫助尋找病因，指導(dǎo)臨床治療方案的制訂。

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（收稿日期：2020-03-30）