郭曉琴　張谞霄　馬誠太　歐杰　李柏林　李鑫

摘要： 旨在利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建1株對高致病性H7N9亞型禽流感病毒（A/Chicken/Huizhou/HZ-3/2016）攻擊后的家禽提供保護(hù)的候選疫苗株。用同源重組的方法構(gòu)建1株表達(dá)H7N9亞型禽流感病毒（A/chicken/Shaoxing/5201/2013株）血凝素（Hemagglutinin， HA）蛋白的重組桿狀病毒。用PCR技術(shù)鑒定重組桿狀病毒rBac-SX5201HA的遺傳穩(wěn)定性，用間接免疫熒光方法和Western Blotting方法鑒定HA蛋白的表達(dá)情況，用血凝試驗檢測HA蛋白的體外活性，繼而對重組疫苗在無特定病原體（Specific pathogen free， SPF）雞上進(jìn)行免疫效力試驗，并對免疫后21 d的SPF雞血清進(jìn)行抗體檢測，對攻毒5 d后的雞咽喉和泄殖腔棉拭子進(jìn)行病毒分離。結(jié)果顯示，重組桿狀病毒rBac-SX5201HA在昆蟲細(xì)胞中生長良好，且可穩(wěn)定高效表達(dá)H7 HA蛋白，血凝效價可達(dá)26;重組疫苗免疫SPF雞21 d后可誘導(dǎo)28.4血凝抑制（Hemagglutinin inhibition， HI）抗體效價并能抵抗高致病性H7N9亞型禽流感病毒的攻擊，免疫組SPF雞群均未發(fā)病或死亡，僅有17%的SPF雞在攻毒后第5 d出現(xiàn)排毒?？梢钥闯觯亟M疫苗對高致病性H7N9亞型禽流感病毒攻擊后的SPF雞提供了100%的保護(hù)，且可有效抑制病毒在SPF雞體內(nèi)的復(fù)制。

關(guān)鍵詞： H7N9亞型禽流感病毒;重組桿狀病毒;血凝素;免疫原性

中圖分類號： S852.65+7 文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A 文章編號： 1000-4440（2022）01-0143-08

Abstract： The aim of this study is to construct a candidate vaccine strain for protection against highly pathogenic H7N9 subtype avian influenza virus （A/Chicken/Huizhou/HZ-3/2016） in poultry using baculovirus expression system. A recombinant baculovirus （rBac-SX5201HA） expressing H7N9 （A/chicken/Shaoxing/5201/2013） hemagglutinin （HA） protein was constructed. Genetic stability of rBac-SX5201HA was confirmed by PCR. Expression of HA protein was identified by indirect immunofluorescence assay （IFA） and Western blotting. The activity of HA protein in vitro was detected by HA assay. Immunogenicity and efficacy of recombinant vaccine were studied by animal trial on specific pathogen free （SPF） chickens. Antibody titer of chicken serum collected at 21 days after immunization was tested， and virus isolation was performed for chicken oropharyngeal and cloacal cotton swabs at five days post-challenge. The results showed that recombinant baculovirus （rBac-SX5201HA） stably and efficiently expressed H7 HA protein in insect cells， and HA titer could reach 26. The recombinant vaccine induced 28.4 hemagglutinin inhibition （HI） antibody titer in SPF chickens， and could resist the attack of highly pathogenic H7N9 subtype avian influenza virus. The SPF chickens in the immunized group did not get sick or die， and shedding was found from 17% SPF chickens at five days post-challenge. Recombinant vaccine provides protection against highly pathogenic H7N9 subtype avian influenza virus and effectively inhibits virus replication in SPF chickens.

Key words： H7N9 subtype avian influenza virus;recombinant baculovirus;hemagglutinin;immunogenicity

禽流感（Avian influenza， AI）是一種禽類烈性傳染病，會嚴(yán)重危害家禽養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展和人類的健康，從而引起社會的廣泛關(guān)注。2013年春季，重組H7N9亞型禽流感在中國暴發(fā)，造成不同程度的人群感染和死亡[1]。之后，每年冬春季節(jié)均有H7N9流感疫情出現(xiàn)[2]。截至2020年，中國已陸續(xù)暴發(fā)6波人感染H7N9亞型禽流感的疫情。對2017年出現(xiàn)的H7N9變異毒株進(jìn)行基因序列分析發(fā)現(xiàn)，其血凝素蛋白裂解位點處存在4個連續(xù)的堿性氨基酸插入，屬于高致病性流感病毒[3]。2013年2月到2020年5月，聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織已報道出現(xiàn)1 568例人感染H7N9亞型禽流感病毒病例，其中616例死亡。為了人類的健康和家禽養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，疫苗免疫是防御H7N9亞型禽流感病毒的有效措施。因此，研制針對H7N9亞型禽流感病毒的疫苗具有重要意義。

傳統(tǒng)的雞胚苗存在雞胚供應(yīng)不穩(wěn)定、外源病毒污染風(fēng)險大、浪費(fèi)量大等缺點[4]。禽流感DNA疫苗則存在免疫原性弱、表達(dá)效率低等缺點[5]。昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)擺脫了雞胚的限制，具有生產(chǎn)成本低、安全性高、表達(dá)的蛋白質(zhì)生物活性高、免疫原性好及可快速生產(chǎn)等優(yōu)點[6-9]。昆蟲細(xì)胞的培養(yǎng)無需血清，不易受外源病毒和支原體污染，且無需純化。有報道顯示，桿狀病毒自身有一定的免疫佐劑效應(yīng)，可以增強(qiáng)疫苗的免疫反應(yīng)[10]。

本研究通過桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建了1株rBac-SX5201HA疫苗候選株，并對其在昆蟲細(xì)胞中的復(fù)制能力、血凝素（HA）蛋白的體外活性，HA蛋白的表達(dá)水平及其在無特定病原體（Specific pathogen free， SPF）雞上的免疫效力等進(jìn)行了一系列評估，以期為H7N9重組桿狀病毒疫苗的進(jìn)一步研究和生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、細(xì)胞

PVL1393質(zhì)粒、昆蟲Sf9細(xì)胞、昆蟲SF+細(xì)胞均由勃林格殷格翰公司提供。

1.2 主要試劑

高保真限制性內(nèi)切酶Bam H I和Eco R I、T4 DNA連接酶、PCR擴(kuò)增的相關(guān)試劑均購自New England Biolabs （NEB）公司;TOP10感受態(tài)細(xì)胞購自天根生化科技（北京）有限公司;質(zhì)粒抽提試劑盒、DNA抽提試劑盒、膠回收試劑盒均購自QIAGEN公司;用于Sf9細(xì)胞培養(yǎng)的EXcell 420培養(yǎng)基購自Sigma公司;轉(zhuǎn)染試劑盒、Alexa FluorTM 488羊抗雞抗體購自Invitrogen公司;桿狀病毒DNA購自Expression Systems公司;禽流感H7亞型（H7-Re1）標(biāo)準(zhǔn)抗原和標(biāo)準(zhǔn)血清購自哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司;山羊抗雞IgY H&L（HRP）購自Abcam公司;4%雞紅細(xì)胞購自南京森貝伽生物科技有限公司。

1.3 質(zhì)粒PVL1393-SX5201HA的構(gòu)建

選取GenBank中公布的A/chicken/Shaoxing/5201/2013株的血凝素（HA）基因序列（登錄號：AJJ91725.1）作為供體基因，并根據(jù)昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)密碼子偏好性進(jìn)行堿基優(yōu)化，由金斯瑞生物科技有限公司合成HA基因。合成的HA基因用Eco R I和Bam H I雙酶切后連接到經(jīng)相同酶切后的PVL1393載體上，在TOP10感受態(tài)細(xì)胞上轉(zhuǎn)化并進(jìn)行氨芐抗性篩選。然后挑取單克隆培養(yǎng)，抽提質(zhì)粒后經(jīng)雙酶切鑒定條帶正確后送到生工生物工程（上海）股份有限公司對HA基因進(jìn)行測序驗證，陽性重組質(zhì)粒命名為PVL1393-SX5201HA。

1.4 重組桿狀病毒的遺傳穩(wěn)定性鑒定

基于同源重組的原理，將PVL1393-SX5201HA質(zhì)粒和線性化的苜蓿銀紋夜蛾多角體病毒（AcMNPV）基因組DNA利用Lipofectamine 3000脂質(zhì)體在Sf9細(xì)胞上進(jìn)行共轉(zhuǎn)染，4 d后收集上清液，得到rBac-SX5201HA-P1，保存于-80 ℃冰箱中。同時在室溫下對上述轉(zhuǎn)染后的Sf9細(xì)胞用等體積甲醇、丙酮混合溶液進(jìn)行固定，進(jìn)行間接免疫熒光（IFA）鑒定。經(jīng)過3輪空斑純化后，純凈的rBac-SX5201HA-P4在SF+細(xì)胞上得到了傳代擴(kuò)繁，擴(kuò)繁條件如下：細(xì)胞密度為1 ml 1×106個細(xì)胞，感染復(fù)數(shù)（MOI）=0.01， 4 d后收獲上清液并保存在-80 ℃冰箱中。將病毒連續(xù)擴(kuò)繁至P9代，測定每代病毒的半數(shù)組織培養(yǎng)物感染劑量（TCID50）。與此同時，提取P1、P8、P9代重組病毒DNA，對重組HA基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將其HA序列與原始HA序列進(jìn)行比對。PVL1393-F引物序列：5′-AAATGATAACCATCTCGC-3′;PVL1393-R引物序列：5′-GTCCAAGTTTCCCTG -3′。

1.5 間接免疫熒光試驗（IFA）

將重組桿狀病毒rBac-SX5201HA-P1、rBac-SX5201HA-P8、rBac-SX5201HA-P9接種Sf9細(xì)胞培養(yǎng)5 d后，棄去上清，在室溫下用等體積甲醇、丙酮混合溶液固定細(xì)胞20 min后，去掉固定液，于通風(fēng)櫥內(nèi)晾干，以H7-Re1亞型陽性血清為一抗（1∶500），以Alexa FluorTM 488羊抗雞抗體為二抗（1∶500），在熒光顯微鏡下觀察。

1.6 Western Blotting試驗

將P7～P9代重組桿狀病毒按感染復(fù)數(shù)為0.1接種SF+細(xì)胞，5 d后收獲細(xì)胞懸液。經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）后，以H7-Re1亞型陽性血清為一抗（1∶1 000），以山羊抗雞IgY H & L（HRP）作為二抗（1∶2 000），進(jìn)行Western Blotting試驗。

1.7 重組病毒HA基因編碼蛋白質(zhì)的表達(dá)條件優(yōu)化

將重組桿狀病毒按MOI=0.1、0.5、1.0分別接種于密度為1 ml 1×106個細(xì)胞的懸浮SF+細(xì)胞中，在感染后1～6 d對細(xì)胞的活率、活細(xì)胞數(shù)、細(xì)胞直徑和細(xì)胞懸液的HA效價進(jìn)行檢測。按照《中華人民共和國獸藥典》（2015年版）[11]附錄中的HA試驗方法進(jìn)行HA效價檢測。

1.8 抗原的準(zhǔn)備

準(zhǔn)備密度為1 ml 1×106個的SF+細(xì)胞，將重組桿狀病毒rBac-SX5201HA-P8按MOI=0.1接種至懸浮SF+細(xì)胞中，5 d后收獲細(xì)胞懸液。

1.9 疫苗的制備

將礦物油與抗原（方法1.8中的細(xì)胞懸液）按2∶1的體積比使用小型乳化機(jī)進(jìn)行乳化，于16 000 r/min乳化3 min，對乳化后的抗原進(jìn)行無菌和物理性狀檢驗。

1.10 SPF雞免疫效力試驗

本試驗在華南農(nóng)業(yè)大學(xué)ABSL-3動物實驗室中進(jìn)行且經(jīng)過實驗動物使用與管理委員會批準(zhǔn)（編號：AUP-18-53），不同組別的雞配置不同的隔離器。選取高致病性的H7N9亞型禽流感病毒的HZ-3（A/Chicken/Huizhou/HZ-3/2016）毒株作為本試驗的攻毒株。選取29羽健康的10日齡SPF雞并隨機(jī)將其分成3組，其中12羽雞經(jīng)頸部皮下免疫rBac-SX5201HA-P8（免疫劑量為0.5 ml），12羽雞作為攻毒對照組，另外5羽雞作為空白對照組，免疫效力試驗的具體安排見表1。免疫后21 d采集血液樣本，離心后取血清，用商品化H7-Re1作為標(biāo)準(zhǔn)抗原，并按照《中華人民共和國獸藥典》（2015年版）附錄方法中的HI試驗方法檢測雞群的HI抗體效價。

免疫后第21 d，對第1組、第2組所有雞經(jīng)滴鼻進(jìn)行H7N9病毒A/Chicken/Huizhou/HZ-3/2016（HZ-3）株攻毒，攻毒劑量為5×106.0 EID50/ml。攻毒后，每天觀察、記錄雞的臨床癥狀，持續(xù)14 d。攻毒后，若雞出現(xiàn)精神沉郁、羽毛粗亂、呼吸和神經(jīng)癥狀等任何異常癥狀或特異性死亡，即可判定該雞為高致病性禽流感發(fā)病。

攻毒后第5 d[12-13]，采集試驗雞的咽喉、泄殖腔棉拭子，每個樣本接種3枚9～11日齡SPF雞胚，于37 ℃孵育72 h，收集雞胚尿囊液后進(jìn)行HA效價測定。攻毒后第14 d，將所有存活雞進(jìn)行安樂死。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組質(zhì)粒PVL1393-SX5201HA的雙酶切鑒定

重組質(zhì)粒PVL1393-SX5201HA經(jīng)Eco R I、Bam H I雙酶切后，經(jīng)電泳鑒定，發(fā)現(xiàn)在1 700 bp左右有1個特異性條帶（圖1），與目的條帶大小一致。測序后經(jīng)序列比對分析發(fā)現(xiàn)，插入基因的序列與原始合成序列完全一致，無任何基因突變，表明重組質(zhì)粒PVL1393-SX5201HA構(gòu)建成功。

2.2 重組桿狀病毒rBac-SX5201HA的遺傳穩(wěn)定性鑒定

PCR結(jié)果表明，P1、P8、P9代重組桿狀病毒rBac-SX5201HA DNA均可擴(kuò)增出大小為1 900 bp左右、含目的HA基因的條帶（圖2）。測序后進(jìn)行序列比對發(fā)現(xiàn)，P1、P8、P9代重組桿狀病毒rBac-SX5201HA的HA基因序列與合成的HA基因序列完全一致。同時對P5～P9代病毒的滴度進(jìn)行測定發(fā)現(xiàn)，隨著重組桿狀病毒rBac-SX5201HA在SF+細(xì)胞上的傳代，重組桿狀病毒rBac-SX5201HA的滴度不斷提高，P8代病毒的滴度達(dá)到最高值，為1 ml 108.47 TCID50（表2）。因此，選擇P8代病毒用于蛋白質(zhì)表達(dá)優(yōu)化試驗和抗原制備。

2.3 rBac-SX5201HA的間接免疫熒光鑒定

被重組桿狀病毒rBac-SX5201HA-P1、rBac-SX5201HA-P8、rBac-SX5201HA-P9感染的Sf9細(xì)胞可見特異性綠色熒光，對照組均未見熒光，表明本試驗成功拯救了重組桿狀病毒rBac-SX5201HA，并且其在Sf9細(xì)胞中可有效表達(dá)H7 HA蛋白。rBac-SX5201HA的間接免疫熒光鑒定結(jié)果見圖3。

2.4 HA蛋白的表達(dá)及鑒定

Western Blotting鑒定結(jié)果（圖4）顯示，在重組桿狀病毒rBac-SX5201HA感染的SF+細(xì)胞懸液中可以檢測到1條相對分子質(zhì)量為70 000左右的條帶，表明重組rBac-SX5201HA的HA蛋白在SF+細(xì)胞中獲得成功表達(dá)。

2.5 HA蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化

由圖5可以看出，感染后的活細(xì)胞數(shù)先增加，當(dāng)MOI=0.1時，在感染后第3 d活細(xì)胞數(shù)達(dá)到峰值;當(dāng)MOI=0.5、1.0時，在感染后第2 d活細(xì)胞數(shù)達(dá)到峰值，隨后活細(xì)胞數(shù)急速下降，在感染后第6 d細(xì)胞幾乎全部死亡。從感染后第1 d開始，SF+細(xì)胞的平均直徑先不斷變大，當(dāng)MOI=1.0時，在感染后第2 d細(xì)胞平均直徑達(dá)到峰值;當(dāng)MOI=0.1、0.5時，在感染后第3 d細(xì)胞平均直徑達(dá)到峰值，然后細(xì)胞平均直徑不斷變小。感染后的細(xì)胞活率不斷下降，并在感染后第5 d降到15%以下。血凝活性檢測結(jié)果表明，在感染后第3～6 d，不同MOI感染組的HA效價均可保持在26（25 μl細(xì)胞懸液）的水平。為了便于后期大規(guī)模生產(chǎn)，最終選取MOI=0.1、感染后第5 d收獲細(xì)胞懸液進(jìn)行動物試驗用抗原的制備。

2.6 疫苗的準(zhǔn)備及檢驗

將rBac-SX5201HA-P8按MOI=0.1的感染復(fù)數(shù)接種至SF+細(xì)胞中，感染后5 d收獲細(xì)胞懸液，25 μl細(xì)胞懸液的HA效價為26（圖6）。對乳化后的rBac-SX5201HA抗原進(jìn)行質(zhì)量檢驗，從疫苗檢驗結(jié)果可以看出，本研究制備的抗原為均一的乳白色乳劑，無明顯分層或破乳，瓶底無水相析出;劑型為油包水（W/O）;滴水檢驗結(jié)果顯示，除第1滴外，其余5滴在10 s內(nèi)無明顯擴(kuò)散;3 000 r/min離心結(jié)果顯示，管底無水相析出;黏度為44.2 cP;粒徑為0.7 μm;無菌檢測結(jié)果顯示無細(xì)菌和霉菌生長。由此可見，疫苗質(zhì)量合格。

2.7 免疫效力評估

HI檢測結(jié)果表明，免疫組雞血清HI抗體平均效價可達(dá)28.4，而未免疫組雞群中均未檢測到HI抗體，表明疫苗免疫可誘導(dǎo)較高的HI抗體水平（表3）。以高致病性H7N9亞型禽流感病毒HZ-3株作為攻毒株，攻毒后4 d內(nèi)攻毒對照組雞群全部發(fā)病死亡，其他雞群在臨床觀察期間均未有發(fā)病死亡的情況（圖7）。攻毒后5 d，病毒分離結(jié)果表明，免疫組1羽雞發(fā)現(xiàn)咽喉排毒，另1羽雞發(fā)現(xiàn)泄殖腔排毒，總體排毒率為17%;免疫組其他雞和健康對照組雞的咽喉、泄殖腔均未檢測到排毒。由此可見，重組桿狀病毒rBac-SX5201HA可對H7N9亞型禽流感病毒HZ-3株攻擊后的SPF雞提供保護(hù)，且可有效抑制病毒在雞體內(nèi)的復(fù)制。

3 討論

目前一般多用桿狀病毒表達(dá)禽流感的HA、NA、M1和M2等蛋白質(zhì)和病毒樣粒子。2013年，由Protein Sciences Corporation利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)（BEVS）研制的第1支禽流感重組三價疫苗FluBolk成功上市[14]，F(xiàn)luBolk四價流感疫苗于2016年獲批上市，該疫苗與雞胚源四價流感疫苗相比，具有免疫效果好、成本低等優(yōu)點[15]。除此之外，Novavax公司利用桿狀病毒表達(dá)的病毒樣顆粒流感疫苗正處在臨床階段[16-17]。HA蛋白是決定禽流感病毒免疫原性的主要蛋白質(zhì)。孫一等[18]成功構(gòu)建的重組桿狀病毒rBac-GD15HA、張雪花等[19]成功構(gòu)建的表達(dá)H5亞型禽流感病毒 HA 蛋白共有序列的桿狀病毒、Lin等[20]成功構(gòu)建的BV-Dual-HA都可對禽流感病毒攻擊后的動物提供很好的保護(hù)作用，這為利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)研制理想的禽流感疫苗提供了重要的試驗依據(jù)。

禽流感病毒隨著HA基因突變而不斷變異。為了獲得1株具有廣譜保護(hù)效果的禽流感疫苗，筆者對H7 HA基因序列進(jìn)行了比對，選取了與保守基因序列相似性較高的H7N9亞型禽流感病毒（A/chicken/Shaoxing/5201/2013株）HA基因作為供體基因。本研究對供體HA基因在昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中的密碼子偏好性進(jìn)行了堿基優(yōu)化，成功構(gòu)建了重組桿狀病毒rBac-SX5201HA，發(fā)現(xiàn)其可在培養(yǎng)（無血清）的昆蟲懸浮細(xì)胞系SF+中穩(wěn)定表達(dá)具有良好免疫原性的HA蛋白，且對高致病性H7N9亞型禽流感病毒攻擊后的SPF雞提供了100%的保護(hù)，可有效預(yù)防H7N9亞型禽流感病毒感染家禽。病毒分離結(jié)果顯示，攻毒5 d后，免疫組SPF雞僅出現(xiàn)17%的排毒，顯著抑制了禽流感病毒在SPF雞體內(nèi)的復(fù)制。HI效價被廣泛用于評估禽流感疫苗的免疫原性和保護(hù)效力。本研究構(gòu)建的重組桿狀病毒rBac-SX5201HA免疫組雞血清HI抗體平均效價可達(dá)28.4，與Hu等[21]構(gòu)建的重組桿狀病毒rBac-JX148HA相比，免疫劑量低且可以誘導(dǎo)更高的HI抗體水平。本研究為利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)在懸浮培養(yǎng)（無血清）的昆蟲細(xì)胞系中表達(dá)無需純化的HA蛋白的禽流感亞單位疫苗研發(fā)提供了實踐依據(jù)。

在重組桿狀病毒rBac-SX5201HA表達(dá)的HA蛋白產(chǎn)量方面，后續(xù)本研究團(tuán)隊將嘗試用其他昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基及不同的SF+細(xì)胞密度進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)水平的優(yōu)化。對于該疫苗的交叉保護(hù)性、該疫苗株在不同品種雞中的免疫應(yīng)答反應(yīng)、不同免疫途徑的保護(hù)效果、最小免疫劑量及免疫程序的確定等仍需要進(jìn)一步探究。

致謝： 誠摯感謝勃林格殷格翰動物保?。ㄖ袊┯邢薰旧虾７止緦Ρ驹囼灥馁Y助和華南農(nóng)業(yè)大學(xué)對本試驗提供的大力幫助！

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（責(zé)任編輯：徐 艷）

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