劉大維

[摘要]目的 探討我國(guó)H7N9禽流感病毒血凝素和神經(jīng)氨酸酶基因的分子進(jìn)化情況。方法 通過(guò)2013年1月～2015年11月不同途徑公布的人感染H7N9禽流感病例資料，分析我國(guó)H7N9禽流感病毒流行病學(xué)特點(diǎn)，篩選H7N9禽流感病毒株的核酸序列和氨基酸序列，分析核苷酸及所編碼關(guān)鍵位點(diǎn)情況。結(jié)果 國(guó)內(nèi)病毒株同源性得分>0.99，從神經(jīng)氨酸酶基因同源性分析中，廣東第1例H7N9禽流感的神經(jīng)氨酸酶基因KF662949和山東的H7N9禽流感的神經(jīng)氨酸酶基因CY147110、浙江的H7N9禽流感的神經(jīng)氨酸酶基因KF500926具有較高的同源性，其中KF662949和CY147110同源性得分達(dá)到0.999。血凝素氨基酸序列裂解位點(diǎn)和潛在糖基化位點(diǎn)分別為30、46、249、421、493，神經(jīng)氨酸酶氨基酸序列耐藥位點(diǎn)和潛在的糖基化位點(diǎn)主要包括神經(jīng)氨酸酶119R、120E、152D、153R、200N、226R、229E、245D、276H、278E、279E、294R、332D、351K、427E。結(jié)論 H7N9禽流感毒株在時(shí)間和空間方面有一定的聚集性，時(shí)間越近、空間距離越短，可能出現(xiàn)進(jìn)化關(guān)系越發(fā)接近。

[關(guān)鍵詞]H7N9；禽流感病毒；流行病學(xué)；血凝素；神經(jīng)氨酸酶

[中圖分類號(hào)] R181.2+4 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2016）10（c）-0179-04

[Abstract]Objective To explore molecular evolution analyzing of hemagglutinin and neuraminidase gene for H7N9 avian influenza virus in our country.Methods The medical records of human infection H7N9 avian influenza virus for different ways publishing，the epidemiology feature for H7N9 avian influenza virus in our country from January 2013 to November 2015 were analyzed，the nucleotide sequence and amino acid sequence of H7N9 avian influenza virus viral strain were selected，nucleotide and coding key sites were analyzed.Results Homologous points of viral strain inland were greater than 0.99，from neuraminidase gene were homology analyzed，neuraminidase gene KF662949 of the first H7N9 avian influenza virus in Guangdong and neuraminidase gene CY147110 of avian influenza virus in Shandong，neuraminidase gene KF500926 of avian influenza virus in Zhejiang were higher homology，KF662949 and CY147110 homology score was 0.999.Amino acid sequence cracking site and potential glycosylation sites of hemagglutinin was 30，46，249，421，493，Amino acid sequence resistance loci and potential glycosylation sites of neuraminidase was 119R，120E，152D，153R，200N，226R，229E，245D，276H，278E，279E，294R，332D，351K，427E.Conclusion H7N9 avian influenza virus has a certain aggregation in time and space，with closer time，shorter distance，which has appeared more close evolutionary relationship.

[Key words]H7N9；Avian influenza virus；Epidemiology；Hemagglutinin；Neuraminidase

2013年2月我國(guó)發(fā)現(xiàn)首例的人感染H7N9禽流感病例，3月中國(guó)疾病預(yù)防控制中心證實(shí)公布3例新型人感染H7N9型禽流感確診病例，從此H7N9禽流感快速蔓延，患者多數(shù)以高熱、咳嗽、咳痰等流感癥狀作為臨床表現(xiàn)，快速發(fā)展成為重癥肺炎、急性呼吸窘迫綜合征，死亡率>30%[1-2]。目前為止世界范圍內(nèi)禽類感染甲型流感H7亞型中，H7N7、H7N2、H7N3流感病毒均出現(xiàn)過(guò)感染人類的現(xiàn)象，但是H7N9流感病毒只是在禽類中被檢測(cè)到[3-4]。H7N9禽流感病毒屬于甲型流感病毒，其宿主的范圍比較廣泛，主要有哺乳動(dòng)物、禽類和爬行動(dòng)物，不同的甲型流感病毒可以通過(guò)抗原漂移和抗原轉(zhuǎn)換重配，形成新的流感病毒并且逐步地傳播給其他動(dòng)物，另外動(dòng)物宿主也有一定的比例導(dǎo)致病毒在人群以外持續(xù)性地循環(huán)傳播，并且不排除H7N9發(fā)生分子變異，逐步適應(yīng)人體宿主從而引起大規(guī)模暴發(fā)流行的可能性[5-6]。因而把握好H7N9禽流感流行病學(xué)特點(diǎn)，認(rèn)識(shí)H7N9分子進(jìn)化規(guī)律，對(duì)于防控H7N9禽流感具有重要的價(jià)值[7-8]。本研究通過(guò)對(duì)我國(guó)各個(gè)地區(qū)H7N9流行病學(xué)特點(diǎn)、血凝素和神經(jīng)氨酸酶變化情況進(jìn)行分析，以探討H7N9禽流感有效的防控措施，現(xiàn)報(bào)道如下。

1資料與方法

1.1一般資料

收集我國(guó)2013年1月～2015年11月國(guó)家衛(wèi)生計(jì)生委、世界衛(wèi)生組織和Flutrackers論壇發(fā)布的病例資料，對(duì)H7N9流行病學(xué)特點(diǎn)進(jìn)行分析。目前資料顯示，到2014年7月為止，我國(guó)有人感染H7N9禽流感病例451例，其中有90例死亡，死亡率達(dá)19.96%，男性310例，女性病例數(shù)138例，另外有3例性別調(diào)查不詳，男女性別比例為2.25∶1；年齡0～90歲，其中>60歲病例數(shù)占全部病例的45.7%，>60歲死亡病例數(shù)占全部死亡病例數(shù)的60.2%。

1.2方法

利用Clusta X2.1進(jìn)行核酸序列對(duì)比，將序列長(zhǎng)度進(jìn)行修剪，通過(guò)MEGA5.0構(gòu)建分子進(jìn)化樹(shù)，采用neighbor-joining法。通過(guò)軟件Bioedit，在Alignment下進(jìn)行Sequence Indentity Matrix對(duì)矩陣進(jìn)行構(gòu)建，分析序列之間的同源性情況。通過(guò)軟件Bioedit，在Clusta W程序下，對(duì)不同區(qū)域和來(lái)源的新型甲型H7N9毒株氨基酸序列進(jìn)行對(duì)比，分析毒力的位點(diǎn)和耐藥性的位點(diǎn)變異規(guī)律。通過(guò)Net NGlyc 1.0 server糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)器，對(duì)可能存在的糖基化位點(diǎn)氨基酸序列進(jìn)行分析。

2結(jié)果

2.1血凝素和神經(jīng)氨酸酶基因進(jìn)化和同源性分析

國(guó)內(nèi)病毒株彼此之間同源性得分>0.990，但是美洲的4個(gè)病毒株和國(guó)內(nèi)病毒株的同源性得分最高僅為0.762。從神經(jīng)氨酸酶基因同源性分析中，廣東第1例H7N9禽流感的NA基因KF662949和山東發(fā)現(xiàn)的H7N9禽流感的NA基因CY147110、浙江發(fā)現(xiàn)的H7N9禽流感的NA基因KF500926具有較高的同源性，其中KF662949和和同源性得分達(dá)到0.999。

2.2血凝素和神經(jīng)氨酸酶氨基酸序列分析

血凝素氨基酸序列裂解位點(diǎn)和潛在糖基化位點(diǎn)分別為30、46、249、421、493，此位點(diǎn)和2009年發(fā)現(xiàn)的H7N9病毒株比較，無(wú)明顯變化（圖1）。

神經(jīng)氨酸酶氨基酸序列耐藥位點(diǎn)和潛在的糖基化位點(diǎn)主要包括神經(jīng)氨酸酶119R、120E、152D、153R、200N、226R、229E、245D、276H、278E、279E、294R、332D、351K、427E，對(duì)上述位點(diǎn)進(jìn)行多個(gè)序列比對(duì)，未發(fā)現(xiàn)存在耐藥性突變。神經(jīng)氨酸酶氨基酸糖基化位點(diǎn)包括42、52、63、66、87、147、202，除KF034913和神經(jīng)氨酸酶缺失52位的糖基化位點(diǎn)以外，其他的位點(diǎn)都沒(méi)有發(fā)生變化（圖2）。

3討論

2013年2月我國(guó)出現(xiàn)流行的人感染H7N9禽流感，目前已經(jīng)造成數(shù)百人感染，男女性別比例較H5N1亞型流感有明顯升高，感染患者的年齡呈現(xiàn)負(fù)偏態(tài)型分布，>60歲患者和男性比例較高，而H5N1亞型流感則集中在10～30歲年齡段的人群[9]。目前H7N9禽流感病毒已經(jīng)造成近百人死亡，死亡率接近20%，但是仍然低于H5N1型禽流感病毒[10]。感染患者呈現(xiàn)快速增長(zhǎng)，目前對(duì)于H7N9禽流感流行病學(xué)研究相對(duì)較少，可能是由于H7N9禽流感臨床癥狀不明顯造成的[11]。人感染H7N9禽流感病例發(fā)病地區(qū)主要集中在沿海地區(qū)，其中浙江省發(fā)生例數(shù)最多為139例，廣東省次之為113例，江蘇省59例，上海市39例，東北地區(qū)、西南地區(qū)比較少見(jiàn)，2014、2015年迎來(lái)兩次高峰，發(fā)病月份多集中在1月，2月份開(kāi)始呈現(xiàn)逐步降低的趨勢(shì)。H7N9禽流感多發(fā)生于冬春季，目前H7N9禽流感沒(méi)有人人傳播，但是動(dòng)物模型上發(fā)現(xiàn)A/Anhui/1/2013毒株有接觸性傳播，因而不能排除H7N9禽流感病例僅發(fā)生在我國(guó)沿海地區(qū)的可能性，長(zhǎng)江三角洲和珠江三角洲疫情比較嚴(yán)重。同時(shí)H7N9禽流感城鎮(zhèn)人口的比例明顯大于H5N1，說(shuō)明H7N9禽流感的流行可能和人口密度高、禽類消費(fèi)程度大有著密切的關(guān)系。

血凝素和神經(jīng)氨酸酶屬于流感病毒膜表面蛋白，血凝素會(huì)促使病毒顆粒在敏感細(xì)胞表面的唾液酸受體吸附，造成感染；神經(jīng)氨酸酶有一定的水解唾液酸活性，在禽流感病毒脫離宿主細(xì)胞后，通過(guò)神經(jīng)氨酸酶水解和血凝素結(jié)合低聚糖側(cè)鏈末端唾液酸，促進(jìn)病毒從感染細(xì)胞釋放、擴(kuò)散[12]。另外，血凝素和神經(jīng)氨酸酶屬于流感病毒抗原性主要部位，點(diǎn)突變引起抗原漂移、8個(gè)節(jié)段基因 ，從而誘發(fā)抗原發(fā)生轉(zhuǎn)移，形成了流感大流行的遺傳學(xué)基礎(chǔ)。神經(jīng)氨酸酶還是抗流感藥物作用的靶點(diǎn)之一，其發(fā)生改變會(huì)造成耐藥性發(fā)生[13]。目前我國(guó)H7N9禽流感病毒株位于同一個(gè)分支，其和其他國(guó)家毒株比較，進(jìn)化距離較近，發(fā)現(xiàn)一些和分離時(shí)間越近的毒株，其同源的可能性越大，H7N9禽流感病毒株在同地區(qū)、同一時(shí)間段表現(xiàn)出更加高的同源性。

通過(guò)National Center of Biotechnology Information上下載的24條血凝素序列和22條神經(jīng)氨酸酶序列分別進(jìn)行進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建，目前世界范圍內(nèi)的H7N9禽流感病毒主要分為兩支，其中一支來(lái)源于美洲，主要包括危地馬拉和美國(guó)，另外一支來(lái)源于歐亞，主要包括西班牙、瑞典、蒙古、中國(guó)、韓國(guó)和日本，我國(guó)的17條H7N9病毒株位于同一個(gè)分支，但是2013～2014年分離的KF922737、KJ023067、KF662943和KJ023074有很近的進(jìn)化關(guān)系[14]。

神經(jīng)氨酸酶同源性分析結(jié)果表明，我國(guó)廣東省第1例H7N9禽流感病毒神經(jīng)氨酸酶基因KF662949和山東省H7N9禽流感病毒神經(jīng)氨酸酶基因CY147110、浙江省H7N9禽流感病毒神經(jīng)氨酸酶基因KF5009226的同源性得分比較高，其中KF662949和CY147110同源性得分為0.999，和上海麻雀分離的KF609529同源性得分為1.000，提示可能是由于候鳥(niǎo)遷徙的過(guò)程中，將禽流感病毒傳播到廣東地區(qū)，廣東地區(qū)的禽流感病毒在秋季感染人，造成感染病例數(shù)明顯升高。

宿主蛋白酶可以促使甲型流感病毒血凝素裂解為血凝素1和血凝素2，血凝素1可以和宿主細(xì)胞受體結(jié)合，血凝素2屬于參與和細(xì)胞膜融合的重要亞單位，如果血凝素容易被切割，則提示病毒株具有較高的致病力。相關(guān)資料顯示，高致病力毒株的血凝素在裂解位點(diǎn)附近有多個(gè)堿性氨基酸，然而低致病力毒株的血凝素在裂解位點(diǎn)只有一個(gè)精氨酸，最多≤2個(gè)堿性氨基酸，這些都說(shuō)明血凝素酶切位點(diǎn)如果發(fā)生變異則會(huì)影響禽流感病毒毒力[15]。H7N9禽流感裂解位點(diǎn)都是PEIPKGR↓GLF，其含有兩個(gè)堿性氨基酸，因而其具有較低致病性。血凝素和神經(jīng)氨酸酶均屬于禽流感病毒表面重要的糖基化蛋白，血凝素和神經(jīng)氨酸酶在各種亞型甲型流感病毒內(nèi)均有保守的糖基化位點(diǎn)，神經(jīng)氨酸酶是因不同亞型伴有不同的缺失，在糖基化位點(diǎn)上的數(shù)目表現(xiàn)出不同，一般情況下保守的糖基化位點(diǎn)是2～4個(gè)。有資料顯示，KF034913的神經(jīng)氨酸酶缺少了52位糖基化位點(diǎn)，感染此毒株的是一個(gè)重癥患者，在2013年4月24日死亡，這個(gè)位點(diǎn)突變可能會(huì)造成H7N9致病性增強(qiáng)，進(jìn)而影響臨床治愈效果[16]。

綜上所述，H7N9禽流感毒株在時(shí)間和空間方面有一定的聚集性，時(shí)間越近、空間距離越短，可能出現(xiàn)的進(jìn)化關(guān)系越發(fā)接近。

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