帥旗 余軍 楊文彬 吳富強(qiáng) 吳建華 蔣正東 楊憲普 趙越 趙靜 付建林225300泰州,江蘇金迪克生物技術(shù)有限公司

四價(jià)流感病毒裂解疫苗包括兩種A型病毒株(H1N1和H3N2)和兩個(gè)譜系的B型(B/Victoria和B/Yamagata)株。根據(jù) 2001—2002年到 2010—2011年11個(gè)流感季節(jié)中原使用三價(jià)流感疫苗中根據(jù)流行預(yù)估選擇一個(gè)譜系的B型病毒株制備該流行季疫苗,僅6次預(yù)估正確[1-4],世界衛(wèi)生組織在2012年2月提出了一項(xiàng)關(guān)于四價(jià)流感疫苗應(yīng)包括兩種B型譜系毒株的建議。江蘇金迪克生物技術(shù)有限公司于同年完成四價(jià)流感病毒裂解疫苗的實(shí)驗(yàn)室研究,通過優(yōu)化生產(chǎn)工藝,建立了成熟、穩(wěn)定、可靠的生產(chǎn)程序,制備四價(jià)流感病毒裂解疫苗[3],并完成了Ⅲ期臨床試驗(yàn)。該公司制備的四價(jià)流感病毒裂解疫苗由生產(chǎn)的H1N1、H3N2、B1和B2四種病毒型別單價(jià)原液,其效力指標(biāo)是準(zhǔn)確測(cè)定各種血凝素抗原含量,每株血凝素含量約為33μg/ml,合格產(chǎn)品每1 ml中各型流感病毒株血凝素含量應(yīng)為配制量的80%～120%。

本研究旨在探究使用傳統(tǒng)的單價(jià)參考品抗原,SRID是否能準(zhǔn)確反映四價(jià)疫苗中兩種譜系的B型血凝素抗原含量；兩種譜系血凝素抗原是否有交叉；在原三價(jià)疫苗中的血凝素成分對(duì)新增加的B型病毒血凝素抗原濃度檢測(cè)是否有影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 流感病毒株：本試驗(yàn)中所使用的流感病毒株是：A1(A/California/7/2009,NYMCX-179A)、A3(A/Hong Kong/4801/2014,NYMCX-263B)、B1(B/Brisbane/60/2008,NYMC BX-35)、B2(B/Phuket/3073/2013,B/Phuket),均從英國國家生物標(biāo)準(zhǔn)與控制研究所(NIBSC)引進(jìn)。

1.1.2 標(biāo)準(zhǔn)品：標(biāo)準(zhǔn)抗原：A1(A/California/7/2009,H1N1pdm,NYMCX-179 A)批號(hào)為 13/164、A3(A/Hong Kong/4801/2014,NYMCX-263B)批號(hào)為15/230、B1(B/Brisbane/60/2008)批號(hào)為 13/234、B2(B/Phuket/3073/2013)批號(hào)為14/252；標(biāo)準(zhǔn)抗血清：A1(A/California/7/2009)批號(hào)為14/310、A3(A/Hong Kong/4801/2014)批號(hào)為 16/100、B1(B/Brisbane/60/2008)批號(hào)為15/312和13/254、B2(B/Phuket/3073/2013)批號(hào)為14/248。以上標(biāo)準(zhǔn)品均購于英國NIBSC。

1.1.3 主要試劑：瓊脂糖購自Invitrogen公司,裂解劑3-磺甲基十四烷基二甲銨(N-tetradecyl-N,N-dinethyl-3 ammonio-1-propanesulfonate)(商品名為zwittergent)購自美國Sigma公司,考馬斯亮藍(lán)購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 單向免疫擴(kuò)散法：采用SRID測(cè)定血凝素含量,將B型病毒特異性抗血清,如B1 875μl或250 μl、B2 350μl,分別添加于融化并冷卻至56℃的25 ml 1.5%瓊脂糖中,混勻后平鋪于10 cm×10 cm規(guī)格的玻璃板,凝固后垂直打孔,孔徑為3 mm。待檢樣品/抗原參考品與10%裂解劑按9∶1體積比充分混合后,于室溫20～25℃放置30～90 min使其裂解。裂解后的血凝素抗原按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)加樣,每孔為10μl；每種血凝素抗原,包括參考品或待測(cè)樣品,每個(gè)稀釋度至少重復(fù)兩孔,加樣后的凝膠板水平置于20～25℃濕盒內(nèi)18～24 h,經(jīng)浸泡,干燥,考馬斯亮藍(lán)染色并脫色后,抗原與特異性抗血清反應(yīng)會(huì)在膠膜上形成清晰的、藍(lán)色的免疫沉淀環(huán)。測(cè)量沉淀環(huán)的直徑,對(duì)應(yīng)于標(biāo)準(zhǔn)抗原制作的線性回歸方程,算出樣品的血凝素抗原含量。

1.2.2 常規(guī)濃度干擾試驗(yàn)：在每個(gè)B1血清瓊脂糖板(簡(jiǎn)稱為血清板),每次加入B1標(biāo)準(zhǔn)品抗原對(duì)照、B1單價(jià)樣品、B1+B2混合單價(jià)樣品。標(biāo)準(zhǔn)品和樣品分別稀釋至血凝素終濃度為 10、20、30、40μg/ml。在每個(gè)B2血清板,每次設(shè)B2標(biāo)準(zhǔn)品抗原對(duì)照、B2單價(jià)樣品、B1+B2單價(jià)樣品。兩者稀釋方法同上。根據(jù)B1或B2標(biāo)準(zhǔn)抗原濃度作直線回歸,分別求出直線回歸方程,帶入相應(yīng)的樣品沉淀環(huán)直徑,得出其血凝素含量,試驗(yàn)重復(fù)3次,求平均值、標(biāo)準(zhǔn)差(SD)和變異系數(shù)(CV)。

1.2.3 高濃度干擾試驗(yàn)：配制三價(jià)流感疫苗(含A1A3B1或A1A3B2)為基質(zhì),其各種血凝素含量是商品苗的二倍66μg/ml,以體積比1∶1加入另一B型病毒連續(xù)稀釋的血凝素中,混合后其三價(jià)疫苗各種血凝素終濃度為33μg/ml,使用高濃度的B型血凝素進(jìn)行觀察。待觀察的B1血凝素終濃度分別為115、100、75、50、40、30、20、10 μg/ml,B2 血凝素樣品終濃度分別為 140、120、100、75、50、40、30、20、10 μg/ml。

固定一個(gè)譜系B型病毒血凝素終濃度為30 μg/ml,分別加入另一個(gè)譜系不同稀釋度的B型血凝素,B1 血凝素含量分別為 115、100、75、50、40、30、20、10 μg/ml,B2 血凝素含量分別為 140、120、100、75、50、40、30、20、10 μg/ml。

在B1血清板上,加入的B2血凝素含量由高到低濃度依次為 280、240、200、250、200、80、60、40、20 μg/ml,在B2血清板上加入的B1血凝素濃度分別為 230、200、150、100、80、60、40、20 μg/ml。

同時(shí)標(biāo)準(zhǔn)B1或B2血凝素抗原分別稀釋至160、100、80、60、40、30、20、10 μg/ml,以其沉淀環(huán)的直徑對(duì)其相應(yīng)濃度作散點(diǎn)圖,并根據(jù)其分布趨勢(shì),利用指數(shù)函數(shù)、冪函數(shù)以及多項(xiàng)式函數(shù)模型作線性擬合。

2 結(jié)果

本研究運(yùn)用SRID,分別在10～40μg/ml和10～160μg/ml兩個(gè)血凝素檢測(cè)范圍內(nèi)作沉淀環(huán)直徑-血凝素含量線性回歸,以評(píng)價(jià)高濃度血凝素時(shí)線性擬合有無偏差。

2.1 常規(guī)檢測(cè)濃度干擾試驗(yàn)在流感疫苗血凝素檢測(cè)范圍10～40μg/ml之內(nèi)時(shí),根據(jù)以往結(jié)果,所計(jì)算的直線回歸方程其R2均近似于1,B1 HA、B2 HA含量與沉淀環(huán)直徑的直線回歸方程分別為：y=16.572x-69.634,R2=0.998；y=18.978x-79.44,R2=0.998,說明檢測(cè)的血凝素含量與沉淀環(huán)直徑呈正比關(guān)系,結(jié)果見表1。

表1 常規(guī)檢測(cè)濃度干擾試驗(yàn)中B1、B2流感血凝素含量與沉淀環(huán)直徑的關(guān)系Tab.1 The relations between B HA content and the diameters of the sedimentation rings under standard concentrations

在每個(gè)B型血清瓊脂糖板(簡(jiǎn)稱為血清板),每次加入該B型標(biāo)準(zhǔn)品抗原對(duì)照、單價(jià)樣品、B1+B2混合單價(jià)樣品。兩種標(biāo)準(zhǔn)品和樣品分別稀釋至血凝素終濃度為10、20、30、40 μg/ml。 根據(jù) B1 或 B2 標(biāo)準(zhǔn)抗原濃度作直線回歸,分別求出直線回歸方程,帶入相應(yīng)的樣品沉淀環(huán)直徑,得出其血凝素含量,求平均值、標(biāo)準(zhǔn)差(SD)和變異系數(shù)(CV)。該試驗(yàn)重復(fù)3次,結(jié)果見表2。

從表2可見,以B1標(biāo)準(zhǔn)抗原的直線回歸方程計(jì)算B1單價(jià)樣品與B1+B2混合單價(jià)樣品中的B1的血凝素含量,比較40、30、20、10 μg/ml各項(xiàng)中 B1 單價(jià)樣品與B1+B2混合單價(jià)樣品中的B1的血凝素含量,P＞0.05,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

從表2可見,計(jì)算同上,以B2標(biāo)準(zhǔn)抗原為標(biāo)準(zhǔn)方程。 40、30、20、10 μg/ml各項(xiàng)中 B2單價(jià)樣品與B1+B2混合單價(jià)樣品中的B2的血凝素含量比較,P＞0.05,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2中血凝素濃度10μg/ml孔的結(jié)果,其變異系數(shù)CV＞15%,數(shù)據(jù)不正常可能是因?yàn)闇y(cè)量沉淀環(huán)直徑太小太接近加樣孔直徑造成的誤差。

血凝素濃度20～40μg/ml,是常規(guī)檢查疫苗中各種血凝素的最佳范圍,準(zhǔn)確性高,變異系數(shù)也小。

2.2 高濃度干擾試驗(yàn)第1組以配制三價(jià)流感疫苗(含A1A3B1或A1A3B2)為基質(zhì)加入連續(xù)稀釋另一B型病毒血凝素抗原,第2組以固定1種B型血凝素終濃度為30μg/ml為基質(zhì),加另1種B型病毒不同稀釋度的血凝素,與第3組單一B型不同稀釋度的血凝素進(jìn)行比較,以確定含有基質(zhì)中測(cè)定兩種B型流感血凝素有無互相干擾,結(jié)果見表3。

將標(biāo)準(zhǔn)B1或B2血凝素抗原分別稀釋至160、100、80、60、40、30、20、10 μg/ml,以其沉淀環(huán)的直徑對(duì)其相應(yīng)濃度作散點(diǎn)圖,并根據(jù)其分布趨勢(shì),利用指數(shù)函數(shù),冪函數(shù)以及多項(xiàng)式函數(shù)模型作曲線回歸。結(jié)果顯示,三元線性回歸方程與所有數(shù)據(jù)擬合度最高,決定系數(shù)R2可達(dá)到0.999以上(圖1)。

表2 單一B型血凝素樣品與兩型混合血凝素樣品檢測(cè)結(jié)果比較Tab.2 The results of determination of B HA content in single influenza B virus samples or mixture of two influenza B viruses samples

表3 B型流感高濃度血凝素含量與沉淀環(huán)直徑曲線關(guān)系Tab.3 The relations between B HA contents and the diameters of the sedimentation rings in high HA content condition

圖1 B型流感高濃度血凝素含量-沉淀環(huán)直徑曲線回歸圖Fig.1 Curve regression diagram of high B HA content-the diameters of the sedimentation rings

以標(biāo)準(zhǔn)B1或B2血凝素抗原的濃度與相應(yīng)抗體的沉淀環(huán)區(qū)直徑繪制直線回歸圖時(shí),決定系數(shù)R2低,發(fā)現(xiàn)抗體濃度越高,其產(chǎn)生的抗原抗體沉淀環(huán)區(qū)直徑越不成正比,抗原濃度高者與理論值相比,偏離更多。其最接近線性關(guān)系僅表現(xiàn)于抗原濃度在10～40μg/ml之間,這也是原方法測(cè)定流感疫苗血凝素濃度時(shí)的配置范圍。

以下實(shí)驗(yàn)中,所有全部高濃度血凝素濃度觀察時(shí)均改作曲線回歸,此方法比直線回歸法高濃度偏移較少,其血凝素更接近于理論值。結(jié)果見表4。

表4中,在B1血清板上,三價(jià)苗中對(duì)不同濃度的B1血凝素的含量測(cè)定,高濃度≥50μg/ml時(shí)偏低。在B2血清板上,三價(jià)苗中存有不同濃度B2的血凝素的含量測(cè)定,濃度≥40μg/ml時(shí),其值輕度偏低。

表4中,在B1血清板上以三價(jià)苗為基質(zhì)和固定B2血凝素30μg/ml為基質(zhì),測(cè)定不同濃度B1血凝素,3組趨勢(shì)相同,結(jié)果相似。與單一的B2不同血凝素濃度測(cè)定也無明顯差別,3組互相比較P＞0.05。

表4：在 B2血清板上,能夠檢測(cè)到三價(jià)苗(A1A3B2)基質(zhì)組中和B2血凝素基質(zhì)組中的B2血凝素含量,隨B1血凝素濃度增加略有增加。兩組B2血凝素值無明顯差異,P＞0.05。單一的B1血凝素組中,從高濃度到低濃度沒有見任何免疫沉淀環(huán),說明B2抗血清是高度型特異性的沒有檢出B1血凝素中與它反應(yīng)的共同抗原。從表4中,每次試驗(yàn)時(shí)均設(shè)有四價(jià)流感疫苗為陽性對(duì)照,結(jié)果測(cè)定B1或B2血凝素值范圍30.05～36.65μg/ml,多數(shù)在33μg/ml左右,這說明本試驗(yàn)方法穩(wěn)定,重復(fù)性高。

表4 在B1或B2血清瓊脂糖凝膠板上不同混合樣品中B1血凝素含量測(cè)定結(jié)果Tab.4 B1 HA contents in different mixture samples on B1 or B2 serum agarose gel plates

表5 在B1或B2血清瓊脂糖凝膠板上不同混合樣品中B2血凝素含量測(cè)定結(jié)果Tab.5 B2 HA contents in different mixture samples on B1 or B2 serum agarose gel plates

在表5中,除在B2血清板上,B2+B1組在B2血凝素濃度為140μg/ml時(shí),其測(cè)定值為174.58μg/ml。B2血凝素為單一抗原在10μg/ml一行的值為3.34,其變異系數(shù)太高(43.01%),不正常,其產(chǎn)生原因是人工卡尺測(cè)定近孔徑的沉淀環(huán)誤差太大所致。其余結(jié)果互相比較,3組無明顯差異,P＞0.05。

表5中,在比較 B1血清板測(cè)定三價(jià)苗(A1A3B1)、B1血凝素(30μg/ml)為基質(zhì)和單一B2組中B2血凝素結(jié)果。在三價(jià)苗組和B1血凝素組中測(cè)定所顯示B1的血凝素含量,在高濃度的B2血凝素存在時(shí),略有增加。兩組無明顯差異,P＞0.05。單一B2血凝素從高濃度到低濃度沒有見任何免疫沉淀環(huán),說明B1抗血清是高度型特異性抗血清,沒能檢出B2血凝素與它反應(yīng)的共同抗原。

3 討論

本研究所用四價(jià)流感病毒裂解疫苗是江蘇金迪克生物技術(shù)有限公司已研制的預(yù)防用生物制品,屬1類新藥。除國外已批準(zhǔn)上市,國內(nèi)沒有這類產(chǎn)品。該公司為第一家申報(bào)公司,目前已完成Ⅲ期臨床試驗(yàn),正在報(bào)批中。SRID測(cè)定單價(jià)原液血凝素含量是配制四價(jià)流感病毒裂解疫苗的主要依據(jù)。根據(jù)Kinnunen等[7]的研究,兩種譜系的B型流感病毒演化自同一起源,那么,兩種譜系B型血凝素抗原測(cè)定時(shí)是否有干擾；SRID是否能準(zhǔn)確反映四價(jià)疫苗中兩種譜系的B型血凝素抗原含量；在原三價(jià)疫苗中的血凝素成分對(duì)新增加的B型病毒血凝素抗原濃度檢測(cè)是否有影響。事關(guān)產(chǎn)品質(zhì)量和免疫效果,國內(nèi)外并未發(fā)現(xiàn)資料能回答這些問題。為了準(zhǔn)確檢測(cè)新疫苗的兩種B型病毒血凝素,保證新疫苗的質(zhì)量,本研究設(shè)計(jì)相對(duì)復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)予以驗(yàn)證。

本研究先從正常測(cè)定血凝素濃度范圍著手,確定常規(guī)測(cè)定方法的準(zhǔn)確性,明確檢測(cè)的血凝素含量與沉淀環(huán)直徑呈正比關(guān)系。在此濃度范圍內(nèi)測(cè)定單一血凝素和兩型混合血凝素樣品中的B1或B2血凝素含量存在另一B型血凝素時(shí)對(duì)測(cè)定結(jié)果無明顯影響。隨后以配制三價(jià)流感疫苗(含A1A3B1或A1A3B2)為基質(zhì)和以固定一種B型血凝素終濃度為30μg/ml為基質(zhì),加另一種B型病毒不同稀釋度的血凝素,并與單一B型不同稀釋度的血凝素進(jìn)行比較,高濃度B型血凝素抗原濃度與其沉淀環(huán)直徑呈三元線性回歸。無論在B1血清板上,三價(jià)苗中對(duì)不同濃度的B1血凝素的含量測(cè)定,還是在B2血清板上,三價(jià)苗中存有不同濃度B2的血凝素的含量測(cè)定,各組間均無顯著差異。并且在B2血清板上,加入單一的B1血凝素,從高濃度到低濃度沒有見任何免疫沉淀環(huán)；反之亦然。B1和B2血清是高度型特異性抗體,在存在高濃度另一B型血凝素時(shí)仍未出現(xiàn)交叉反應(yīng),保證了SRID的準(zhǔn)確性。以上結(jié)果均表明,使用 B/Brisbane/60/2008和 B/Phuket/3073/2 013兩種特異性血清在SRID測(cè)定流感疫苗中B/Brisbane和B/Phuket病毒的兩種B型血凝素抗原時(shí)未發(fā)現(xiàn)交叉干擾。

利益沖突無