邱方洲 申辛欣 馮志山 馬學軍

050011石家莊,河北醫(yī)科大學研究生院(邱方洲)；050030石家莊,河北省兒童醫(yī)院(馮志山)；102206北京,中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所衛(wèi)生部醫(yī)學病毒和病毒病重點實驗室(申辛欣、馬學軍)

自20世紀80年代至今的30多年里,PCR經(jīng)歷了3代技術(shù)的發(fā)展。第一代PCR分析技術(shù)采用凝膠電泳的方法對PCR產(chǎn)物進行分析,由于其操作繁瑣易于污染不能對靶基因進行定量檢測等缺點,第二代 PCR技術(shù)—實時熒光定量 PCR(real time fluorescence quantitative PCR,qPCR)應運而生。在核酸絕對定量、低豐度檢測、稀有堿基突變檢測和耐藥突變檢測等需求日益增大的應用背景下,第三代PCR技術(shù)—數(shù)字dPCR得到了突飛猛進的發(fā)展。

病毒感染性疾病是我國公共衛(wèi)生事業(yè)的沉重負擔,精確量化標本中的病毒載量能夠有效的監(jiān)測抗病毒治療效果,提供精準的抗病毒治療方案。盡管近幾年 qPCR在核酸定量中已經(jīng)成為了“金標準”[1],但是它在臨床診斷上還是存在局限性。dPCR具有比qPCR更加出色的靈敏性、特異性、穩(wěn)定性和精確性[2-3],它在檢測極微量核酸樣品中表現(xiàn)出的優(yōu)勢普遍被認可[4]。近幾年來,dPCR的發(fā)展引起眾多學者的關(guān)注,但很少人從病毒學領(lǐng)域?qū)PCR進行綜述,因此本文將對dPCR發(fā)展史、dPCR的原理、dPCR和qPCR的比較進行簡單的闡述,以及dPCR在病毒檢測中近幾年的應用及發(fā)展趨勢做出詳細綜述。

1 d PCR發(fā)展史

1990年Ruano等[5]應用單分子稀釋和泊松定律統(tǒng)計方法研究單倍體DNA。1992年Sykes等[6]描述了基于有限稀釋量化初始樣本、PCR和泊松統(tǒng)計,雖然當時這種方法沒有被命名為數(shù)字PCR,但卻建立了數(shù)字 PCR的基本流程。到1999年Vogelstin等[7]通過描述稀釋分離單分子并通過PCR單獨擴增,然后用熒光探針分析每個產(chǎn)物是否存在突變,并且通過檢測大腸癌癥患者糞便中的ras癌基因,證明了該方法的可行性,第一次提出了數(shù)字PCR的概念。2003年Dressman等[8]提出了一種基于微乳液和磁珠的固相數(shù)字PCR方法—BEAMing技術(shù),該技術(shù)將模板與連接引物的磁珠以極低的濃度包裹在油水兩相的液滴中,然后進行擴增,擴增產(chǎn)物吸附在磁珠表面,破乳收集進行檢測。隨著納米技術(shù)和微流體技術(shù)的發(fā)展,數(shù)字PCR技術(shù)突破瓶頸,商業(yè)化數(shù)字PCR系統(tǒng)迅速發(fā)展(表1)。2006年Fluidigm公司推出了第一臺基于芯片的商業(yè)化數(shù)字PCR系統(tǒng)。2011年Bio-Rad公司微滴式數(shù)字PCR儀QX100TM在市場上銷售,2013年該公司又推出了升級型號QX200TM開始熱賣。2012年,RainDance公司將二代測序文庫制備平臺技術(shù)平移到數(shù)字PCR技術(shù)平臺推出RaindropTM數(shù)字PCR技術(shù)平臺,該系統(tǒng)能將反應體系分成100萬到1 000萬個pl級別微滴的反應乳液,適用于更大濃度差別樣品之間的定量。2013年Life technologies推出QuantStudio 3D數(shù)字PCR系統(tǒng),在整個操作過程中樣品之間保持完全隔離,有效的防止了交叉污染。迄今為止,數(shù)字PCR在眾多領(lǐng)域蓬勃發(fā)展起來。

2 d PCR的原理

數(shù)字PCR實驗過程中應用的引物和探針均可直接套用于qPCR,但是數(shù)字PCR的“單分子模板PCR擴增”技術(shù)使其靈敏性和準確性明顯高于qPCR。數(shù)字PCR的過程至少要包括3個環(huán)節(jié),即標本的離散、PCR擴增、熒光信號的收集以及數(shù)據(jù)分析。標本離散即將含有模板的PCR體系分散成數(shù)百個或是數(shù)百萬個獨立的反應體系,使每個反應體系中包含1個或是不包含或是包含多個核酸模板,進而對單獨的反應體系進行PCR擴增,擴增結(jié)束后依次讀取每個反應體系的熒光信號確定陰性還是陽性進而進行統(tǒng)計學分析,直接計算出原始標本中的模板拷貝數(shù),如果單個反應體系包括2個或是更多的核酸模板,能夠通過泊松分布進行校正?？偠灾?數(shù)字PCR的原理非常簡單,它無需依靠標準曲線就實現(xiàn)了標本的絕對定量檢測,此外對數(shù)字PCR結(jié)果判讀時不需要任何閾值僅判讀為有或無兩種狀態(tài)。

3 d PCR和qPCR的比較

不依賴標準曲線能夠?qū)崿F(xiàn)對標本核酸的絕對定量是dPCR的最大優(yōu)勢[9],相對qPCR而言,必須依賴梯度稀釋標準品建立標準曲線對核酸標本進行相對定量,構(gòu)建標準曲線的標準品本身又缺乏統(tǒng)一的計量標準,所以同一份標本對不同操作者或是不同時間所得出的相對定量結(jié)果可能會有很大偏差[10]。dPCR可將反應體系分散成無數(shù)個獨立的反應單元,不但實現(xiàn)了單分子模板擴增,而且有效的稀釋了抑制反應擴增的物質(zhì),使其很少會影響PCR擴增效率,有研究表明或許可通過免提核酸的方法直接運用dPCR進行核酸的原始定量[11],而qPCR在一個反應體系內(nèi),由于受抑制物的影響反應效率往往會比實際值偏低。相對靈敏度而言,dPCR和qPCR似乎相差不大[12],然而dPCR在核酸精準定量和監(jiān)測低病毒載量時似乎更加準確,此外dPCR在低豐度檢測方面占有優(yōu)勢[10],見表2。

表1 商業(yè)化數(shù)字PCR平臺概述Tab.1 An overview of the commercialized digital PCR platform

然而,dPCR和qPCR相比也有不足。許多研究證明了dPCR絕對定量DNA的準確性,但是很少報道其定量RNA,因為反轉(zhuǎn)錄步驟對于某些RNA靶標可能是不完整的,而樣品中的所有模板不一定都會被測量[13]。在qPCR技術(shù)檢測平臺中大部分儀器可檢測4個熒光通道,而dPCR一般只有兩個熒光通道限制了在同一樣本中對不同目標進行多重檢測的能力。一般情況下,dPCR由于離散標本能力有限最多只能獨立千萬個反應體系,所以在檢測高濃度標本時能力受限。此外,dPCR的耗材和試劑相對qPCR昂貴,在制備微滴時由于系統(tǒng)的開放性增加了污染的可能性[14],見表2。

表2 dPCR和qPCR兩種方法的比較Tab.2 The comparation of dPCR and qPCR

4 d PCR在病毒檢測中的應用

自dPCR商業(yè)化以來,它在病毒檢測方面的應用備受歡迎,并且已經(jīng)用于量化許多病毒載量,已有文獻報道的包括HIV病毒[15]、巨細胞病毒[12,24]、乙型肝炎病毒[16]、人乳頭瘤病毒[17]、人鼻病毒[18]、皰疹病毒[19]、戊型肝炎病毒[20]、雙?？刹《?型[21]、甲型肝炎病毒和諾如病毒[22]以及日本腦炎病毒[23]。其中對于巨細胞病毒的研究表明,病毒載量的微小變化在臨床上也具有明顯的意義,Waggoner等[24]對22位巨細胞感染的患者進行病毒載量的監(jiān)測,結(jié)果顯示病毒載量從200拷貝/ml以下增長到200拷貝/ml以上時患者會出現(xiàn)明顯的癥狀。Strain等[15]論證并分析了dPCR能夠有效地監(jiān)測HIV患者在接受抗逆轉(zhuǎn)錄治療過程中病毒載量在患者體內(nèi)的變化,并提出dPCR的高靈敏性和準確性有助于測量潛伏中的HIV病毒進而能夠及時干預進而達到早期消除的目的。關(guān)于dPCR檢測早期HPV相關(guān)浸潤性癌患者血清中人乳頭瘤病毒DNA的研究表明在HPV相關(guān)癌癥患者中,可以使用這種高靈敏性的技術(shù)進行亞臨床腫瘤腫塊的生物學檢測,例如對微小殘留疾病或早期復發(fā)的腫瘤[17]的監(jiān)測。同樣有研究對107份HBV表面抗原陽性和24份HBV表面抗原陰性肝癌患者石蠟包埋組織用dPCR檢測技術(shù)進行了病毒載量的評估,結(jié)果顯示131分組織標本中均檢測到HBV且病毒載量范圍在1.1～175.5拷貝/μl之間,通過統(tǒng)計學計算進一步論證了HBV載量與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期以及血清膽堿酯酶呈正相關(guān)關(guān)系。此項研究不僅論證了dPCR方法在檢測低濃度HBV標本的超高靈敏度,同樣為HBV表面抗原陰性患者需及時接受治療進一步提供理論基礎[16],并且進一步充分說明了精確量化病毒載量在臨床工作中的重要性。關(guān)于dPCR高靈敏性的研究,Sedlak等[18]通過RT-qPCR方法和RT-dPCR方法對人鼻病毒不同基因型進行檢測比較,并提出RT-dPCR可能是未來人鼻病毒定量研究和定量具有高序列多樣性的其他病毒的最佳分子檢測方法。人類皰疹病毒6型(HHV-6)能夠潛伏感染大多數(shù)成人。在大約1%的人群中,HHV-6能夠整合在人類染色體上(CIHHV-6),并且存在于每一個體細胞和生殖細胞中,可以通過生殖系傳播,在檢測HHV-6病毒載量時 CIHHV-6經(jīng)常被忽視,Sedlak等[19]運用dPCR建立了快速準確的實驗室檢測CIHHV-6方法。Nicot等[20]提出,實時熒光定量PCR技術(shù)對戊型肝炎病毒RNA的定量在技術(shù)上有很大差異,因此需要一個標準化工具對戊型肝炎進行病毒定量,同時他們應用qPCR技術(shù)與自己建立的dPCR檢測方法同時檢測戊型肝炎臨床標本,并提出dPCR技術(shù)可作為各種類型標本中戊型肝炎RNA定量標準化的有效工具。甲型肝炎病毒、諾如病毒[22]以及日本腦炎病毒[23]的dPCR檢測技術(shù)方法與qPCR檢測技術(shù)方法的檢測結(jié)果同樣論證了dPCR檢測技術(shù)在病毒學領(lǐng)域的優(yōu)勢,尤其是對低濃度樣本的檢測。綜合以上研究表明,精確量化病毒載量對于臨床治療尤為重要,檢測技術(shù)水平的精確度越高指導臨床診治的指標才會越可靠。dPCR檢測技術(shù)在病毒檢測領(lǐng)域應用前景非常廣泛。

對于dPCR高靈敏性的特點,同樣可應用于病毒耐藥突變的檢測,Whale等[25]通過dPCR對H1N1耐奧司他韋的研究表明在臨床檢測點突變dPCR要比qPCR法提高50倍,其次,提出了一種確定假陽性率(背景)信號的方法。最后,對比 dPCR和qPCR在檢測臨床標本的結(jié)果中顯示dPCR可以通過早期(微量)檢測罕見的耐藥序列變異來進行臨床研究和患者管理。同樣有研究表明,dPCR的超高靈敏性可用于HCV的突變檢測,Motokazu等[26]的研究結(jié)果顯示在野生型是突變型20 000倍時檢測上線為0.005%,證明dPCR在低豐度檢測過程中獨特的優(yōu)勢。因此dPCR技術(shù)不但可用于病毒耐藥突變的相對和絕對定量還可應用于其他病毒基因組多態(tài)性的突變檢測。

qPCR病毒定量結(jié)果在各實驗室之間可比性較差,導致標準品沒有統(tǒng)一的標準,目前制定標準品的標準是采用對不同實驗室的結(jié)果取平均得到。最近美國國家標準與技術(shù)研究院采用dPCR對巨細胞病毒進行了絕對拷貝數(shù)的測量,這也是第一次采用dPCR進行病毒定標,所以dPCR同樣在定量標準品中具有巨大潛在優(yōu)勢[27]。

5 發(fā)展趨勢

在過去的幾年中,dPCR的應用、儀器設備及其性能受到越來越多的關(guān)注,這導致對該技術(shù)優(yōu)缺點的認識大幅增加。關(guān)于這些缺點的進一步研究是必要的,以允許廣泛和常規(guī)使用dPCR作為診斷工具,其中包括消除假陽性結(jié)果(對于低分子水平量化標本尤其重要),設計實驗時的缺陷,分析數(shù)據(jù)和增加數(shù)據(jù)分析程序的可用性。隨著這些問題的解決,dPCR對比qPCR的優(yōu)勢會更加明顯,以及該技術(shù)的推廣會越來越廣泛,才有可能實現(xiàn)dPCR最為常規(guī)診斷工具。雖然qPCR方法中的反應條件和反應體系可直接轉(zhuǎn)移到dPCR平臺。但是,在診斷測試推廣前,應該進行大量前期臨床驗證。與qPCR相比,檢測特異性、檢測限和PCR抑制物質(zhì)的不同影響可能導致dPCR的性能更好或更差。另外,在某些情況下,精確性和準確性的提高可能并不具有臨床意義,因此目前的dPCR平臺可能不具有成本效益。未來的平臺能夠以低成本實現(xiàn)高吞吐量,并且具有足夠高的動態(tài)范圍,可能會替代未來的許多qPCR應用。

dPCR作為一種新的核酸檢測技術(shù)平臺為病毒學研究領(lǐng)域提供了一種全新的技術(shù)思路和手段。由于成熟化商品可選擇性不高,技術(shù)普及不完全和耗材成本遠高于qPCR,所以dPCR很難在短時間內(nèi)取代qPCR。但dPCR以其獨特的優(yōu)勢以及與多種檢測方法進行融合勢必在病毒載量檢測、病毒耐藥點突變、稀有堿基突變等應用中發(fā)展越來越廣泛,相信在不久的將來dPCR定能夠在臨床病毒檢驗診斷中占據(jù)一席之地。

從目前發(fā)展趨勢來看,下一代測序方法已經(jīng)成為生命科學領(lǐng)域研究工作中增長最快的一部分,將下一代測序方法與dPCR聯(lián)合使用可被視為未來病毒學領(lǐng)域應用的發(fā)展趨勢,前者的優(yōu)勢在于發(fā)現(xiàn)未知病原的核酸序列,dPCR主要負責對這些未知病原進行定量。所以不管是dPCR本身還是與其他技術(shù)聯(lián)合,都必將成為病毒學領(lǐng)域的一場偉大革命,這一革命性技術(shù)的發(fā)展不僅能在科研領(lǐng)域得以應用,也定會在臨床工作中發(fā)揮重要作用,更直接的服務醫(yī)療衛(wèi)生系統(tǒng)。

利益沖突無