張 波，孫愛青，李培培，時偉杰

(1 山東省寧陽縣第一中學(xué)，山東 寧陽 271400；2 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，山東 泰安 271018)

硒是人體和動物體內(nèi)必需的一種微量元素，與機體的免疫能力、抗氧化能力、抗癌抗病毒能力有著非常重要的聯(lián)系[1]。納米硒在養(yǎng)殖業(yè)中有著重要應(yīng)用，家畜被喂食含納米硒的飼料后，免疫力和抗應(yīng)激能力都顯著增強，同時提高了其生產(chǎn)性能。實踐證明納米硒比常用的氨基酸硒與亞硒酸鈉在提升肉食雞生長性能方面有著絕對優(yōu)勢。納米硒在醫(yī)療領(lǐng)域也有著重要作用，人體內(nèi)所含硒的總量大約為14～21 mg，大部分通過消化道和呼吸道吸收，主要通過尿液排出體外，正常尿硒的濃度范圍為0～0.15 mg/L，過量的硒具有毒性，作為藥物硒的用量范圍大約每天為50～200 μg。納米硒相對于硒化合物發(fā)生了理化性質(zhì)的變化，能夠直接并高效的消除自由基，因此納米硒具有低毒性的特點，在醫(yī)藥領(lǐng)域?qū)⒂兄鴱V闊的應(yīng)用前景，對人類的健康具有深遠意義[2]。

木質(zhì)素是一種廣泛存在于植物體中的無定形的、含有氧代苯丙醇或其衍生物結(jié)構(gòu)單元的芳香性高聚物[3]。木質(zhì)素大分子結(jié)構(gòu)含有大量功能基團，包括甲氧基、羰基、羥基等，所含有的官能團決定了木質(zhì)素的理化性質(zhì)。羥基是木質(zhì)素生物大分子中的一種重要官能團，按存在形式分為兩種類型，分別為苯環(huán)上的酚羥基和側(cè)鏈上的脂肪族羥基，因此木質(zhì)素具有很強的還原性[4]。

本文采用水熱合成法，以木質(zhì)素為還原劑、穩(wěn)定劑和保護劑，成功的制備了納米硒，并研究了其抑菌活性。該研究為納米硒的制備提供了一種廉價、方便的方法，有利于納米硒的實際應(yīng)用。

1 實 驗

1.1 實驗原料與儀器

堿木素，山東泉林紙業(yè)有限責(zé)任公司提供；大腸桿菌和金黃色葡萄球菌，山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院提供；營養(yǎng)肉湯(BR)，購自杭州天和微生物試劑有限公司；營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(BR)，購自杭州天和微生物試劑有限公司;二氧化硒(AR)，購自天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；實驗所用的化學(xué)藥品均為分析純。

Nicolet 380傅立葉變換紅外分光度計，熱電公司；ESCALAB 250XI型X射線光電子能譜儀，Thermo Fisher Scientific公司；D8 Advance X 射線粉末衍射儀，Bruck公司；JEM-200CX透射電子顯微鏡，JEOL 公司。

1.2 木質(zhì)素的提純

準(zhǔn)確稱取粗堿木素50.0 g，溶于250.0 mL去離子水中，攪拌均勻，用高速離心機12000 r/min室溫離心5 min，去除沉淀后得堿木素液，加入濃鹽酸調(diào)pH至2～3，使堿木素以沉淀形式析出。再次用高速離心機12000 r/min室溫離心8 min，去除上清液，得沉淀形式的堿木素。用去離子水將所得沉淀重溶，12000 r/min離心8 min，使堿木素沉淀得以洗滌，如此再重復(fù)洗滌步驟兩次。將洗滌后的沉淀溶于100.0 mL去離子水中，用氫氧化鈉溶液調(diào)pH至10，干燥后制得純凈的木質(zhì)素，密封置于冰箱中備用。

1.3 納米硒的制備及表征

以二氧化硒、葡萄糖和精制木質(zhì)素為原料，分別配制2 mol/L亞硒酸溶液、100 g/L葡萄糖溶液和30 g/L木質(zhì)素溶液。在25 mL圓底燒瓶中加入5 mL配制的30 g/L pH為10的木質(zhì)素溶液，恒溫水浴(磁力攪拌)90 ℃情況下慢慢滴加5 mL 0.2 mol/L亞硒酸溶液，再慢慢滴加5 mL 100 g/L葡萄糖溶液，體系反應(yīng)2 h。反應(yīng)完成后，產(chǎn)物自然冷卻至室溫。取反應(yīng)后的溶液用離心機12000 r/min離心5 min，倒掉上清液，將所得沉淀洗滌置于真空干燥箱中干燥。所制備的材料通過TEM、XRD、XPS等方法進行表征。

1.4 細菌的培養(yǎng)

在無菌的15 mL離心管中加入5 mL無菌營養(yǎng)肉湯，取冷凍保存的菌種100 μL加入離心管。將離心管置于水浴恒溫振蕩器中，37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)12 h，使細菌復(fù)蘇。

在無菌的15 mL離心管中加入5 mL無菌營養(yǎng)肉湯，取已復(fù)蘇好的菌液50 μL加入離心管中，置于水浴恒溫振蕩器中，37 ℃恒溫震蕩培養(yǎng)4 h，將細菌培養(yǎng)至對數(shù)生長期。

采用平板計數(shù)法估算實驗菌液的濃度，將上述所得的實驗菌液用營養(yǎng)肉湯分別稀釋1000倍、1萬倍、5萬倍、10萬倍、50萬倍、100萬倍、150萬倍、500萬倍。稀釋后的實驗菌液均為1 mL。分別取50 μL稀釋后的實驗菌液涂板，每組涂板兩個。將涂板后的培養(yǎng)皿密封標(biāo)記后放入生化培養(yǎng)箱，15小時后取出觀察菌落生長情況。實驗表明，稀釋50萬倍的實驗菌液菌落生長情況符合實驗要求。

1.5 不同濃度的納米硒的抑菌性能

配制濃度分別為1 g/L、2 g/L、3 g/L、4 g/L、5 g/L的納米硒溶液，分別取190 μL于0.5 mL離心管中，加入10 μL稀釋50萬倍的上述實驗菌液，用漩渦混合器混合均勻，抑菌1 h后，分別取50 μL混合液涂板，每組平行涂板2個。將10 μL稀釋50萬倍的菌液加入190 μL營養(yǎng)肉湯混合均勻，分別取50 μL涂板作為對照試驗。用平板計數(shù)法計算活體的細菌數(shù)目，對抑菌效果進行測試。

1.6 不同抑菌時間納米硒的抑菌性能

取190 μL 5 g/L 納米硒溶液于0.5 mL離心管中，加入10 μL稀釋50萬倍的實驗菌液，用漩渦混合器混合均勻，抑菌一定時間后，分別取50 μL混合液涂板。每組平行涂板2個。按此方法分別將抑菌時間為30 min、35 min、40 min、45 min、50 min、55 min、60 min溶液涂板。將10 μL稀釋50萬倍的菌液加入190 μL營養(yǎng)肉湯混合均勻，分別取50 μL涂板作為對照試驗。用平板計數(shù)法計算活體的細菌數(shù)目，對抑菌效果進行測試。

2 結(jié)果與討論

2.1 納米硒的表征

圖1 納米硒的透射電鏡圖譜(a～c)和X射線衍射圖譜(d)

圖1為納米硒的高倍透射電鏡(TEM)圖和X射線衍射(XRD)圖譜。圖1(a)可顯示出納米硒粒子分布均勻，沒有聚集和粘連現(xiàn)象。圖1(b)中可以清晰的看出納米硒粒子形貌為非常規(guī)則的球形，粒徑在200 nm左右。圖1(c)通過進一步放大倍數(shù)，可看到納米硒粒子表面包裹著一層木質(zhì)素，因此木質(zhì)素在實驗過程中不僅起到了還原作用還起到了保護和穩(wěn)定作用。圖1(d)為納米硒的XRD圖譜，圖譜中的主要衍射峰與標(biāo)準(zhǔn)卡片(JCPDS，No. 06-0362)衍射峰(100)、(101)晶面相吻合，并且圖中兩個峰的峰形尖銳。以上結(jié)果說明實驗已成功合成納米硒[5-6]。

圖2為納米硒的XPS光譜圖。從圖2(a)可以看出，所制備的材料主要含有Se、O和C三種元素。對C 1s進行分峰處理，結(jié)果如圖2(b)所示，其中最強的峰位于284.8 eV，對應(yīng)C-H和C-C的結(jié)合能[7]。圖2(c)為對O 1s的分峰處理，531 eV、531.9 eV、532.6 eV和533.2 eV分別對應(yīng)O-C, OH, O-C-O和-C=O的結(jié)合能[8]。對Se 3d進行分峰處理，結(jié)果如圖2(d)所示，位于55.1 eV的峰對應(yīng)的是Se，位于55.5 eV和56.2 eV的峰對應(yīng)的是氧化物[9]。以上結(jié)果表明，在納米硒的合成過程中，木質(zhì)素不僅起到了還原作用還起到了穩(wěn)定劑和保護劑的作用。

圖2 納米硒的XPS譜圖

2.2 納米硒抑菌活性的測試

圖3 不同抑菌時間的抑菌效果(a)；不同納米硒濃度的抑菌效果(b)

圖3為不同時間、不同濃度納米硒抑菌活性的實驗結(jié)果。圖3(a)顯示，納米硒的抑菌效果隨抑菌時間的增加而提高，在60 min時，5 g/L的納米硒溶液對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果均達到了100%。納米硒溶液濃度對抑菌效果的影響如圖3(b)所示，納米硒的抑菌效果隨著納米硒濃度的增加而提高，在抑菌時間為60 min，納米硒濃度為5 g/L時，納米硒溶液對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果均達到了100%。以上結(jié)果表明，納米硒具有有效的抑菌活性，在農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥等領(lǐng)域應(yīng)用前景非常廣闊。

3 結(jié) 論

采用木質(zhì)素為還原劑和保護劑，利用水熱合成法制備了納米硒粒子，并研究了納米硒的抑菌活性。結(jié)果表明，實驗所制備的納米硒粒子為非常規(guī)則的球形，粒徑為200 nm左右，并且納米粒子分布均勻。通過采用菌落計數(shù)法對納米硒的抑菌活性進行了研究，研究結(jié)果證明納米硒具有良好的抑菌效果，抑菌效率隨納米硒濃度的升高和抑菌時間的增加而提高。在60 min時，5 g/L的納米硒溶液對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果均達到了100%。本文利用木質(zhì)素成功的還原制備了高度分散的納米硒粒子，表現(xiàn)出了良好的抑菌活性，在農(nóng)業(yè)、醫(yī)療等領(lǐng)域應(yīng)用前景廣闊。