吳 勇，施 鋼，謝又興，陳志光，潘傳豪*

(1.廣東海洋大學(xué)，廣東 湛江 524088；2.湛江市合興水產(chǎn)科技有限公司，廣東 湛江 524000)

1 材料方法

1.1 材料

本實(shí)驗(yàn)在廣東海洋大學(xué)東海島海洋生物教學(xué)基地室內(nèi)進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)用細(xì)鱗幼魚捕自湛江市海區(qū)，平均體長(zhǎng)為(2.48±0.23)cm，平均體質(zhì)量(0.92±0.31)g。

高鹽度調(diào)節(jié)用鹽(徐聞縣海龍海洋生物制劑廠制作的“海龍牌”海水晶)，東海島海區(qū)自然砂濾海水及曝氣24 h以上的自來水，ATAGO-S20折射式鹽度計(jì)。

以1 m3玻璃鋼圓桶為自然砂濾海水儲(chǔ)水桶，250 L的白色聚丙烯方形桶(長(zhǎng)×寬×高=70 cm×50 cm×70 cm，以下簡(jiǎn)稱方形桶)為實(shí)驗(yàn)用桶，實(shí)驗(yàn)前1 d以300 mg·L-1KMnO4消毒后用淡水洗凈。

1.2 方法

1.2.1 各梯度海水的配制

分別設(shè)置0、5、10、20、30、40、50、55、60和65共10個(gè)鹽度梯度，以鹽度30的自然海水為對(duì)照組，高鹽度海水通過砂濾海水+經(jīng)過濾的海水晶配制成一份母液后，曝氣2 h后再等分成3份，最后再分別分裝入另外2個(gè)方形桶中而獲得，以此確保3個(gè)重復(fù)鹽度相一致；低鹽度海水由自然砂濾海水+曝氣24 h以上的自來水調(diào)配成一份母液后，曝氣2 h后再等分成3份，最后再分別分裝入另外2個(gè)方形桶中而獲得；鹽度為0的為曝氣24 h以上的自來水。調(diào)配好后貼上標(biāo)簽注明鹽度，每個(gè)方形桶盛水50 L。

1.2.2 鹽度驟變實(shí)驗(yàn)

為初步確定最高濃度，預(yù)實(shí)驗(yàn)設(shè)置了鹽度為65、75、80的高鹽度海水梯度，每個(gè)處理組放10尾魚，結(jié)果表明鹽度75和80的細(xì)鱗幼魚1 h內(nèi)存活率為0%，鹽度65的細(xì)鱗幼魚2 h內(nèi)存活率40%，初步確定鹽度65為本次鹽度脅迫實(shí)驗(yàn)最高鹽度。

1.2.3 鹽度恢復(fù)實(shí)驗(yàn)

1.2.4 吸水率和脫水率的計(jì)算

脫水率(The dehydration rate，%)：DHR=(We-WO) ×100/ WO；

吸水率(The water absorption rate，%)：WAR=(We-WO) ×100/ WO；

其中，We為實(shí)驗(yàn)終末體質(zhì)量(g)；WO為相應(yīng)的初始體質(zhì)量(g)。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理采用Microsoft Excel 2003和SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的單因素方差分析(One-way ANOVA)進(jìn)行分析(成活率數(shù)據(jù)經(jīng)反正弦變換后進(jìn)行ANOVA處理)，當(dāng)其達(dá)到顯著差異(P<0.05)，進(jìn)行Duncan多重比較檢驗(yàn)組間差異，找出存活時(shí)間和成活率有統(tǒng)計(jì)差異的組別[12]。

2 結(jié)果

2.1 存活時(shí)間和存活率

表1 細(xì)鱗幼魚鹽度驟變實(shí)驗(yàn)中存活時(shí)間統(tǒng)計(jì)表

Tab.1 Surviving time span and surviving rates of Terapon jarbua in acute salinity stress experiment

鹽度Salinity24h存活率/%Survivingratesin24h48h存活率/%Survivingratesin48h72h存活率/%Survivingratesin72h恢復(fù)實(shí)驗(yàn)存活率/%Survivingratesinrecoveryexperiment總存活率/%Totalsurvivingrates最短存活時(shí)間/hMinimalsurvivingtimespan最長(zhǎng)存活時(shí)間/hMaximalsurvivingtimespan平均存活時(shí)間/hMeansurvivingtimespan650.0a0.0a0.0a-00.973.751.88A6030.0b23.3b23.3b23.323.31.18>72>72B5556.7c53.3c53.3c53.353.31.78>72>72B5093.3d93.3d93.3d93.393.33.83>72>72B40100.0d100.0d100.0d100.0100.0>72>72>72B30100.0d100.0d100.0d100.0100.0>72>72>72B20100.0d100.0d100.0d100.0100.0>72>72>72B10100.0d100.0d100.0d100.0100.0>72>72>72B5100.0d100.0d100.0d100.0100.0>72>72>72B090.0d90.0d90.0d90.081.09.8>72>72B

注：同一列數(shù)據(jù)相同字母者表示差異不顯著(P>0.05)，反之差異顯著；“-”表示數(shù)據(jù)未測(cè)定或無。下同。

Notes：Labeling identical letters on data in the same column showed no significant differences(P>0.05)，otherwise significant difference(P<0.05);“-”indicated the data was not measured or no.Similarly hereinafter.

方差齊性檢驗(yàn)表明，各處理組存活時(shí)間方差不齊，使用Tamhane多重比較，結(jié)果表明鹽度為65處理組的平均存活時(shí)間與其他處理組的平均存活時(shí)間有極顯著差異，此處理組的平均存活時(shí)間ASTS65(1.88 h)<其他處理組的ASTS(>72 h)，說明細(xì)鱗幼魚在鹽度為65、60、55的海水中的存活時(shí)間顯著低于其他鹽度組的存活時(shí)間。

對(duì)存活率作反正弦變換后進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果表明，鹽度65、60、55處理組存活率分別與其他處理組之間(The survival rate，以下簡(jiǎn)稱TSR)存在顯著差異，P<0.05(表1、圖1)。

LSD多重比較表明，TSR65、TSR60、TSR50、TSR0的存活率顯著低于其他處理組的存活率，其中TSR65與TSR60之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異而與其他兩組有顯著差異，TSR50與TSR0之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異而與其他兩組有顯著差異。

2.2 鹽度脅迫下的細(xì)鱗行為表現(xiàn)

2.3 攝食情況

實(shí)驗(yàn)進(jìn)行24 h后，全部梯度存活下來的魚投喂沉性配合飼料后攝食強(qiáng)烈、快速搶食，與實(shí)驗(yàn)前暫養(yǎng)時(shí)的攝食情況基本相同，本實(shí)驗(yàn)的鹽度脅迫對(duì)存活下來的細(xì)鱗幼魚攝食情況無明顯的差異。

2.4 吸水率和脫水率

方差分析結(jié)果表明，鹽度為65和60的極高鹽度處理組與鹽度為5和0的極低鹽度處理組對(duì)全魚脫水率的影響具有顯著差異(P<0.05)，鹽度5組與鹽度0組具有顯著性差異(P<0.05)，鹽度65組與鹽度60組無顯著性差異(P>0.05)(表2)。

表2 細(xì)鱗幼魚鹽度驟變實(shí)驗(yàn)中吸水率與脫水率變化統(tǒng)計(jì)表

Tab.2 The water absorption rate and the dehydration rate of Terapon jarbua in acute salinity stress experiment %

表2 細(xì)鱗幼魚鹽度驟變實(shí)驗(yàn)中吸水率與脫水率變化統(tǒng)計(jì)表

鹽度Salinity1h后脫水率Dehydrationratein1h2h后吸/脫水率Waterabsorptionrateordehydrationratein2h8h后吸/脫水率Waterabsorptionrateordehydrationratein8h24h后吸/脫水率Waterabsorptionrateordehydrationratein24h最大吸/脫水率Maximalwaterabsorptionrateordehydrationratein2h最小吸/脫水率Minimalwaterabsorptionrateordehydrationrate65-10.4-12.7a//-16.6-8.860/-12.6a//-16.6-7.45/+2.4b+1.0a+0.1a+3.800/+6.5c+13.3b+10.4b+19.40

注： 數(shù)據(jù)前標(biāo)“-”的表示脫水，數(shù)據(jù)前標(biāo)“+”表示吸水，“/”表示數(shù)據(jù)未測(cè)定或無。

Notes：“-10.4”indicated dehydration rate 10.4%，“+2.4”indicated water absorption 2.4%，“/”indicated the data was not measured or no.

鹽度實(shí)驗(yàn)2 h后高鹽度組出現(xiàn)明顯脫水，低鹽度組出現(xiàn)明顯吸水，24 h后鹽度5組比仍然存活的0、60組更能自主調(diào)節(jié)吸水率或者脫水率使體質(zhì)量回歸正常值，可見在鹽度5的低鹽組，細(xì)鱗幼魚滲透壓調(diào)節(jié)適應(yīng)能力高于60的高鹽組，也強(qiáng)于鹽度為0的低鹽組。

3 討論

3.1 細(xì)鱗的鹽度急性鹽度脅迫下的可能機(jī)制及其調(diào)節(jié)極限

魚類生存環(huán)境中的鹽度與魚體內(nèi)滲透壓有密切關(guān)系，溶解于水中的各種鹽類，通過滲透壓對(duì)魚體產(chǎn)生影響，魚類對(duì)鹽度變化的耐受性取決于其滲透壓調(diào)節(jié)能力以及與提供能量支持有關(guān)的代謝重組[13]。魚類生活水域的鹽度差異甚大，各種魚類能夠在不同鹽度的水域中正常生活，與其具有完善的生理調(diào)節(jié)機(jī)制有關(guān)，但這種調(diào)節(jié)作用只能局限于一定的鹽度范圍內(nèi)，在不適宜的鹽度范圍內(nèi)，魚類即使能夠生存，也不能正常生長(zhǎng)。海水硬骨魚類體液鹽分濃度即滲透壓一般比海水低，屬于低滲性溶液，對(duì)滲透壓的調(diào)節(jié)主要通過“飲海水，排鹽分”的方式進(jìn)行。海水硬骨魚類主要依靠鰓對(duì)鹽分進(jìn)行滲透壓調(diào)節(jié)[14]，且主要是依靠鰓上皮細(xì)胞中為數(shù)不多的氯細(xì)胞[15]。首先，可從食物中獲得少量水分，更多的是吞入大量海水，大量的NaCl由腮絲上的泌氯細(xì)胞排出；其次，退化的腎小球可阻止因排泄廢物失水過多，而只排出Mg2+、SO42-、Ca2+及少量的水分[16]。細(xì)鱗屬于廣鹽性硬骨魚類，對(duì)外界滲透壓的變化有一定的調(diào)節(jié)能力，但當(dāng)鹽度變化超過一定的范圍時(shí)，在細(xì)鱗急性鹽度脅迫中表現(xiàn)為低鹽度為5以下、高鹽度為50以上產(chǎn)生明顯的吸水和脫水現(xiàn)象，此時(shí)已經(jīng)超過此魚類的內(nèi)部調(diào)節(jié)能力，會(huì)有吸水、脫水甚至死亡等巨大的生理影響。

侯俊利等[17]的研究表明，魚類通過改變鰓表皮細(xì)胞中的扁平細(xì)胞和泌氯細(xì)胞的數(shù)量和形態(tài)來適應(yīng)生存環(huán)境中鹽度的變化，在鹽度為10的海水中馴養(yǎng)的施氏鱘(Acipenserschrenckii)幼魚鰓小片上的泌氯細(xì)胞較在淡水中馴養(yǎng)的大。據(jù)王艷等[18]對(duì)不同鹽度下鱸魚(Lateolabraxjaponicus)稚魚鰓顯微結(jié)構(gòu)的研究表明，鹽度為15的稚魚鰓絲和鰓小片較窄且短，其上的泌氯細(xì)胞數(shù)量較多，體積顯著膨大；鹽度為7.5稚魚腮絲和鰓小片上的泌氯細(xì)胞數(shù)量、結(jié)構(gòu)變化不明顯；而鹽度為0稚魚鰓絲和鰓小片寬，間距小，其上的泌氯細(xì)胞數(shù)量較少，胞體較小，核較大，以此通過泌氯細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和數(shù)量變化來調(diào)節(jié)體內(nèi)滲透壓以適應(yīng)生存環(huán)境的改變。馬慧等[19]的研究表明多種內(nèi)分泌激素如催乳素、生長(zhǎng)激素、胰島素樣因子及皮質(zhì)醇等通過刺激新的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白合成，影響氯細(xì)胞增值與分化，改變離子與水的運(yùn)輸能力。稍低或稍高的鹽度(如鹽度20～40)脅迫對(duì)魚類組織的影響或損傷可能較小，魚類能通過自身的調(diào)節(jié)機(jī)制或通過修復(fù)可逐步適應(yīng)環(huán)境的改變。例如，在河口半咸水地區(qū)生活的鯔魚(Mugilcephalus)和魚(Planilizahaematocheila)，若從海水立即投入淡水中則會(huì)很快死亡，而在其生活的水體中逐漸加入淡水，直至養(yǎng)殖水體完全或大部分淡化，這個(gè)過程僅僅需要一兩個(gè)小時(shí)，它們便可以完全適應(yīng)淡水生活[20]。而極端鹽度(如鹽度≥60或鹽度≤5)脅迫可能會(huì)對(duì)魚類的鰓部等組織結(jié)構(gòu)造成不可逆的影響，帶來嚴(yán)重且不可修復(fù)的損傷。本實(shí)驗(yàn)也表明，細(xì)鱗幼魚在鹽度為65的極端高鹽度脅迫下，在3.75 h內(nèi)全部死亡，最短死亡時(shí)間為0.97，平均死亡時(shí)間僅為1.88 h；在鹽度為60下的幼魚24 h死亡率也高達(dá)70%，最短死亡時(shí)間也僅為1.18 h。鹽度為0的幼魚24 h死亡率為10%，最短死亡時(shí)間為9.80 h，顯著長(zhǎng)于鹽度為65和60的極端高鹽度下的存活時(shí)間，但在鹽度恢復(fù)實(shí)驗(yàn)24 h內(nèi)死亡率增加到20%，這可能說明極高鹽度對(duì)魚鰓部組織的損傷程度大于極低鹽度對(duì)鰓部組織的損傷程度，高鹽度導(dǎo)致鰓小片上的扁平細(xì)胞變薄，且極高鹽度還可能致使鰓上某些酶活力降低或失活，甚至直接導(dǎo)致某些運(yùn)載蛋白的變性。

環(huán)境脅迫打破魚類與環(huán)境之間的平衡與協(xié)調(diào)，引起魚體內(nèi)分泌等生理狀態(tài)的紊亂[21]。當(dāng)鹽度脅迫可導(dǎo)致魚類去甲腎上腺素分泌的增加，當(dāng)這種脅迫加重或持續(xù)時(shí)間過長(zhǎng)超出了魚體的調(diào)節(jié)和免疫應(yīng)答應(yīng)對(duì)能力時(shí)，會(huì)造成魚體體內(nèi)各種生理生化指標(biāo)的變化，出現(xiàn)行為異常甚至死亡[22]。Cannon應(yīng)急反應(yīng)學(xué)說(Emergency Reaction Hypothesis)認(rèn)為，當(dāng)機(jī)體遭受特殊緊急情況時(shí)，如鹽度突變，會(huì)使交感-腎上腺髓質(zhì)系統(tǒng)反應(yīng)立即被調(diào)動(dòng)起來，腎上腺素與去甲腎上腺素分泌大大增加，它們作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，提高興奮性，使機(jī)體處于警覺狀態(tài)[22]，表現(xiàn)為反應(yīng)靈敏、呼吸加強(qiáng)加快、心跳加快、糖原分解代謝加快等以利于應(yīng)急時(shí)的氧氣及能量供給，本實(shí)驗(yàn)的細(xì)鱗幼魚呼吸頻率達(dá)160次/min以上即是其中的外在生理反應(yīng)。而童燕等[23]研究表明，急性鹽度脅迫導(dǎo)致施氏鱘血漿皮質(zhì)醇濃度顯著升高，鹽度15的皮質(zhì)醇在5 h時(shí)達(dá)到峰值，而鹽度為22的在0.5 h時(shí)達(dá)到峰值。皮質(zhì)醇能刺激魚類鰓上皮氯細(xì)胞密度增加，增強(qiáng)鰓內(nèi)Na+/K+-ATPase活性，促使過多的鹽分排出體外[24]。本實(shí)驗(yàn)的細(xì)鱗幼魚生理和激素變化是否遵循此規(guī)律有待進(jìn)一步研究。

一般海區(qū)海水鹽度在35以下，而本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了50～65的鹽度處理組，超高鹽度設(shè)計(jì)的目的是考慮以下兩個(gè)可能的應(yīng)用：1)用于推測(cè)自然界中細(xì)鱗幼魚在海水極端鹽度中能生存的最高鹽度，與其現(xiàn)有的生態(tài)分布數(shù)據(jù)作比較、印證；2)用于將來養(yǎng)殖細(xì)鱗時(shí)，選擇養(yǎng)殖鹽度、低鹽度或者高鹽處理寄生蟲或者其他對(duì)鹽度敏感型的魚類疾病，如小瓜蟲，甚至是為推廣到鹽湖、鹽田等高鹽地區(qū)或者內(nèi)陸蝦池的混養(yǎng)模式中，作為養(yǎng)殖鹽度參考資料。

3.2 細(xì)鱗幼魚鹽度脅迫適應(yīng)能力與鹽度梯度變化速率的關(guān)系

此外，如圖2所示，在鹽度為65和60的極高鹽度脅迫下，細(xì)鱗幼魚出現(xiàn)明顯脫水現(xiàn)象，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行2 h后脫水率分別達(dá)到12.70%和12.62%并出現(xiàn)死亡，這可能說明細(xì)鱗幼魚對(duì)極高鹽度脅迫下的調(diào)節(jié)能力有限，無法應(yīng)對(duì)極高鹽度帶來的組織損傷及滲透壓改變等而最終導(dǎo)致死亡。在鹽度為5和0的極端低鹽度脅迫下，細(xì)鱗幼魚出現(xiàn)明顯吸水現(xiàn)象，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行2 h后吸水率分別為2.44%和6.46%，8 h后吸水率分別為1.03%和13.30%，24 h后吸水率分別為0.10%和10.40%(相對(duì)于8 h時(shí)的吸水率出現(xiàn)了止升下跌的趨勢(shì))，細(xì)鱗幼魚在鹽度為5的脅迫下吸水率低于鹽度為0環(huán)境下的吸水率，且經(jīng)24 h的自身滲透壓調(diào)節(jié)后，其含水量基本恢復(fù)至原狀即滲透壓恢復(fù)平衡，此外，鹽度為0的幼魚在實(shí)驗(yàn)進(jìn)行9.8 h后開始出現(xiàn)死亡，24 h內(nèi)死亡率為10%，并且在鹽度恢復(fù)過程中亦出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，鹽度恢復(fù)后24 h內(nèi)總死亡率升至19%，這可能表明幼魚在鹽度為5的海水下的調(diào)節(jié)能力強(qiáng)于鹽度為0的淡水下的調(diào)節(jié)能力，細(xì)鱗幼魚在鹽度逐步降低的情況下才能完全適應(yīng)淡水生活，并且需要一定的時(shí)間，通過逐步的適應(yīng)過程使機(jī)體適應(yīng)新的鹽度環(huán)境。于娜等[26]對(duì)不同年齡的暗紋東方鲀(Takofuguobscurus)的研究認(rèn)為，0齡組的幼魚的滲透壓調(diào)節(jié)能力較1齡魚的要弱，可能是其滲透壓調(diào)節(jié)的器官發(fā)育還不完善，不能完全行使其調(diào)節(jié)能力而導(dǎo)致死亡，細(xì)鱗幼魚是否也是因滲透壓調(diào)節(jié)的器官發(fā)育還不完善而導(dǎo)致死亡，還有待與成魚的鹽度實(shí)驗(yàn)進(jìn)行進(jìn)一步對(duì)比研究。