楊求華

(福建省水產研究所，福建省海洋生物增養(yǎng)殖與高值化利用重點實驗室，福建 廈門 361013)

腸道內源性細菌是定殖在健康生物腸道內，并與宿主建立密切聯(lián)系的一類微生物，具有促進宿主生長、提高宿主免疫力及幫助宿主抵御外界病原刺激等多種生物學功能。通過來源于健康動物自身環(huán)境的正常優(yōu)勢菌或次優(yōu)勢菌，以抑制特定病原菌為目的的拮抗篩選法，是益生菌株最常用的篩選方法[1-4]。

解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)作為芽孢桿菌屬的重要成員，在其培養(yǎng)過程中會產生多種具有抗菌功能的次級代謝產物，包括小肽和蛋白類、聚酮類化合物和非核糖途徑形成的脂肽類等，具有廣譜的抑菌活性，可以抑制真菌、細菌等多種病原[5-9]。解淀粉芽孢桿菌可以從土壤、植物、畜禽和水生動物腸道中被分離培養(yǎng)[10-13]，且營養(yǎng)要求簡單、非致病性、環(huán)境適應能力強[14]，可作為潛在的抗生素替代物，在農業(yè)病蟲害防治和益生菌添加劑開發(fā)等生物防治領域發(fā)揮重要作用[13]。已有報道表明，解淀粉芽孢桿菌可作為一種仿刺參腸道內源性益生菌[11-12]。

為提高菌株的生物量和抑菌物質產量，提高其生物防治效果，也為進一步的產業(yè)化應用開發(fā)提供基礎資料，近年來已有眾多學者對解淀粉芽孢桿菌的培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進行了優(yōu)化[15-16]。汪晶晶等[17]確定解淀粉芽孢桿菌GM-1-2的最適培養(yǎng)基配方為馬鈴薯200 g/L、葡萄糖17.5 g/L、酵母膏12.5 g/L、硫酸亞鐵0.12 g/L；最佳發(fā)酵條件為初始pH 7.0、溫度28℃、轉速180 r/min，裝液量60 mL/250 mL、接種量10%、發(fā)酵時間30 h。王勇等[18]等研究發(fā)現(xiàn)，解淀粉芽孢桿菌GZ-5的最適碳源為葡萄糖，最適氮源為牛肉膏+蛋白胨+酵母粉，最佳發(fā)酵條件為初始pH 7.0、溫度30℃，裝液量200 mL/500 m、接種量0.3%、發(fā)酵時間48 h。葛慈斌等[19]分析了解淀粉芽孢桿菌FJAT-8754發(fā)酵過程中菌體數(shù)量、pH、底物濃度，以及纖維素酶和淀粉酶等動態(tài)變化，采用Logistic方程和Luedeking-Piret方程構建了菌株FJAT-8754的發(fā)酵動力學模型，指出其發(fā)酵過程中產物的合成屬于生長部分偶聯(lián)型。

海參(仿刺參，Apostichopusjaponicus)，自2003年開展“北參南養(yǎng)”試驗以來，經過十多年的發(fā)展，至2018年福建省海參養(yǎng)殖產量達到29 829 t[20]，占全國總產量的17.11%，位列全國第三大海參養(yǎng)殖省份。解淀粉芽孢桿菌CQN-2菌株從南移池塘養(yǎng)殖仿刺參腸道中分離得到，其對仿刺參病原菌燦爛弧菌、哈維氏弧菌以及水產常見病原菌創(chuàng)傷弧菌等[21-23]具有較好的拮抗作用，經生理生化和16S rRNA鑒定為解淀粉芽孢桿菌。為進一步提高其生物量、降低發(fā)酵成本、開發(fā)其應用價值，通過對其培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進行參數(shù)優(yōu)化，以期為該菌株的規(guī)?；a和應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株

解淀粉芽孢桿菌CQN-2菌株為本所分離純化菌種，分離自福建莆田池塘養(yǎng)殖健康仿刺參前腸，并保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心(保藏編號：CGMCC No.12420)和福建省水產研究所海洋生物疾病防治研究中心。

1.1.2 供試培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基(1 L)：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、蛋白胨3 g、KH2PO41 g、MgSO40.5 g，pH 7.0。

LB固體培養(yǎng)基(1 L)：蛋白胨10 g、酵母粉5 g、NaCl 10 g、瓊脂20 g，pH 7.0。

基礎發(fā)酵培養(yǎng)基(1 L)：糖蜜20 g、酵母粉20 g、KH2PO40.5 g、MgSO40.5 g、NaCl 0.3 g，pH 7.0。

1.2 試驗方法

1.2.1 CQN-2菌株種子液的制備

取100 μL CQN-2甘油菌種接種于裝有100 mL種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，30℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)12 h；取活化后的CQN-2菌株1 mL轉接于100 mL新鮮種子培養(yǎng)基中，30℃、200 r/min搖瓶培養(yǎng)24 h。

1.2.2 CQN-2菌株生物量測定

用紫外分光光度計，在波長600 nm處測定CQN-2菌株發(fā)酵液的吸光值(OD600)，以無菌培養(yǎng)液作為對照，吸光值超過1時，使用雙蒸水進行適當稀釋。

1.2.3 CQN-2菌株生長曲線測定

在超凈工作臺中按接種量的5%取種子液轉接于30 mL/250 mL基礎發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30℃、200 r/min搖床中培養(yǎng)48 h，每隔6 h取樣測定菌體濃度OD600，每次3個重復。

1.2.4 培養(yǎng)條件優(yōu)化

利用基礎發(fā)酵培養(yǎng)基對影響CQN-2菌株生長的關鍵因子，包括初始pH(7.0)、裝液量(30 mL/250 mL)、接菌量(5%)等發(fā)酵條件進行優(yōu)化。發(fā)酵初始pH分別為4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5；裝液量分別為20、25、30、40、50、60、75、100、125 mL/250 mL；接菌量分別為1%、3%、5%、7%、9%。每個處理3次重復，測定菌體濃度OD600，測定不同發(fā)酵條件對CQN-2菌株生長的影響。

1.2.5 發(fā)酵培養(yǎng)基成分優(yōu)化

以基礎發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基，以初始pH 7.0、接種量5%、裝液量30 mL/250 mL、發(fā)酵溫度30℃、轉速200 r/min、發(fā)酵時間36 h為基礎發(fā)酵條件，對培養(yǎng)基中幾種重要成分及其濃度進行篩選優(yōu)化。設置不同碳源成分(蔗糖、木糖、葡萄糖、可溶性淀粉、糊精，濃度為20 g/L)、不同氮源成分(細菌學蛋白胨、酵母膏、魚粉蛋白胨、牛肉膏、NH4Cl，濃度為20 g/L)、不同金屬離子成分(Fe2+、Fe3+、Zn2+、Ca2+、 Mn2+、Ba2+、Al3+，設置2個終濃度梯度，1 mmol/L和5 mmol/L)等，同時，設置不同最優(yōu)碳源濃度(5、10、15、20、25、30、35 g/L)、不同最適氮源濃度(20、30、40、50、60、70、80 g/L)和不同糖蜜濃度(5、10、15、20、30、40、50、60、70、80 g/L)。每個處理3次重復，測定菌體濃度OD600，測定不同發(fā)酵培養(yǎng)基成分及其濃度對CQN-2菌株生長的影響。

1.2.6 正交試驗分析

為了獲得最優(yōu)培養(yǎng)方法，在1.2.4和1.2.5單因素試驗的基礎上，以菌體濃度OD600為指標，利用軟件Minitab 7.0設計7因素3水平正交試驗(表1)。

表1 試驗因素水平

1.2.7 優(yōu)化后發(fā)酵條件驗證試驗

將CQN-2菌株接種于優(yōu)化后的培養(yǎng)基中，并在優(yōu)化后的培養(yǎng)條件下發(fā)酵，以基礎培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件為對照，每6 h取樣一次測定OD600值，每組3個重復，并繪制菌株生長曲線，共測定48 h，菌株生長進入穩(wěn)定期。

1.2.8 CQN-2菌株上罐發(fā)酵

按5%接種量取種子液轉接至3 L(5 L發(fā)酵罐)最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基中，設置溫度30℃、通氣量0.5 VVM、轉速600 r/min條件下進行發(fā)酵培養(yǎng)，同時設計控制pH試驗組(調節(jié)pH控制在6.0)和不控pH試驗組，每8 h取樣一次測定OD600值，每組3個重復，吸光值超過1時，使用雙蒸水進行適當稀釋。取適量發(fā)酵液于超凈工作臺用滅菌雙蒸水梯度稀釋至10-11；取稀釋至10-9、10-10、10-11三個梯度的稀釋液100 μL平板涂布于LB固體培養(yǎng)基，在30℃倒置培養(yǎng)48 h后計數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)用SPSS軟件進行差異顯著性分析，用Microsoft Excel軟件和Origin 8.0軟件作圖并進行分析。

2 結果與分析

2.1 CQN-2菌株生長曲線

為了解試驗菌株CQN-2生長的基本特征，采用OD600值測定菌株生長規(guī)律[24]。試驗結果如圖1所示，CQN-2菌株接種后迅速生長，隨著培養(yǎng)時間的延長，菌體濃度迅速升高，培養(yǎng)至30 h后生長速度逐漸減緩，36 h以后菌體濃度基本穩(wěn)定，此時測得菌株的濃度OD600值為18.80。

2.2 CQN-2菌株發(fā)酵條件優(yōu)化

pH、接種量、裝液量等發(fā)酵條件均會對微生物的生長產生較大的影響。本文對pH、接種量和裝液量等發(fā)酵條件進行優(yōu)化(圖2)。結果顯示，CQN-2菌株生物量隨pH的升高呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(圖2A)，當pH大于8.5時會抑制菌株的生長，而初始pH維持在5.5～8.0時均可獲得較大的生物量，其中當pH為6.5時的菌株生物量最高，菌液OD600值為19.78。從圖2B可以看出，當接種量為1%和3%時，CQN-2菌株的生物量均要高于接種量大于5%時的生物量。圖2C可以看出，隨著錐形瓶中裝液量的提高，CQN-2菌體的生物量逐漸降低，表明該菌株為好氧型細菌，當裝液量為25 mL/250 mL時，發(fā)酵液的OD600值為20.46，是裝液量為100 mL/250 mL的3.28倍。

2.3 CQN-2菌株發(fā)酵培養(yǎng)基成分優(yōu)化

2.3.1 碳源對CQN-2菌株生長的影響

試驗結果(圖3A)顯示，以可溶性淀粉、糊精為碳源，CQN-2菌株的細胞生物量顯著高于其他試驗組，其36 h培養(yǎng)后的OD600值分別為20.03和19.35。本文以OD600值最高的可溶性淀粉作為碳源進行后續(xù)濃度優(yōu)化試驗，從圖4A可以看出，隨著可溶性淀粉濃度的提高，CQN-2菌體生物量也逐漸提高，當可溶性淀粉濃度提高至20 g/L后菌體濃度逐漸穩(wěn)定，因此確定可溶性淀粉濃度為20 g/L為宜。

2.3.2 氮源對CQN-2菌株生長的影響

試驗結果(圖3B)顯示，CQN-2菌株在有機氮源條件下的生物量顯著高于無機氮源，說明有機氮源更有利于CQN-2菌株的生長。在有機氮源中，細菌學蛋白胨、酵母膏和魚粉蛋白胨為氮源的CQN-2菌株生物量差異不顯著，OD600值分別為17.88、17.42和17.80，其中細菌學蛋白胨的生物量最高，因此選用細菌學蛋白胨繼續(xù)進行氮源濃度優(yōu)化試驗。結果顯示(圖4B)，隨著氮源濃度的增加，CQN-2菌株的生物量呈現(xiàn)先提高后降低的趨勢，表明適宜的氮源濃度更有利于CQN-2菌株的生長，其中當細菌學蛋白胨濃度為60 g/L時，CQN-2菌體生物量最大，OD600值為21.20。

2.3.3 金屬離子對CQN-2菌株生長的影響

試驗結果(圖3C)顯示，添加Fe2+、Mn2+、Al3+三種金屬離子的發(fā)酵液有助于CQN-2菌株生物量的提高，其中添加1 mmol/L水平的菌液OD600值分別為17.04、19.93和17.74，添加5 mmol/L水平的OD600值分別為16.59、19.84和16.32。因此在后續(xù)正交試驗中選擇Fe2+、Mn2+、Al3+三種離子。

2.3.4 糖蜜濃度對CQN-2菌株生長的影響

試驗結果(圖4C)顯示，糖蜜作為一種添加劑對CQN-2菌株的生長具有明顯促進作用，隨著發(fā)酵液中糖蜜濃度的提高，CQN-2菌株的生物量也迅速增加，而后保持基本穩(wěn)定。當糖蜜添加量為50 g/L時，CQN-2菌體的生物量最大，OD600值達到21.03。

2.4 正交試驗優(yōu)化

單因素篩選結果顯示，裝液量、初始pH、金屬離子、糖蜜和氮源對CQN-2菌株的生長具有較大的影響，因此本文選擇裝液量、pH、Fe2+、Mn2+、Al3+、糖蜜和氮源等7個因素作為正交試驗因素進行正交試驗。結果(表2)顯示，不同正交組合之間CQN-2菌株的生物量差異顯著，進一步進行均值效益分析結果表明，最適裝液量為15 mL/250 mL、最適初始pH為7.0、最適Mn2+濃度為5 mmol/L、最適Al3+濃度為1 mmol/L、最適糖蜜濃度為50 g/L、最適氮源濃度為30 g/L，不需要添加Fe2+。

表2 不同正交試驗組合對CQN-2生長的影響表

續(xù)表2

2.5 優(yōu)化后發(fā)酵條件驗證試驗

將CQN-2菌株接種于優(yōu)化后的培養(yǎng)基(可溶性淀粉20 g/L、細菌學蛋白胨30 g/L、糖蜜50 g/L、KH2PO40.5 g/L、MgSO40.5 g/L、NaCl 0.3 g/L、Mn2+5 mmol/L、Al3+1 mmol/L)，在優(yōu)化后的培養(yǎng)條件(初始pH 7.0，裝液量15 mL/250 mL、接種量為3%)進行發(fā)酵，同時以優(yōu)化前的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件為對照，繪制CQN-2菌株生長曲線(圖5)。結果顯示，在優(yōu)化后的培養(yǎng)條件下，CQN-2菌株生長速度明顯快于優(yōu)化前，在培養(yǎng)至24 h時，優(yōu)化前培養(yǎng)基中CQN-2生長開始進入穩(wěn)定期，而優(yōu)化后培養(yǎng)基中的CQN-2菌株仍在繼續(xù)生長直至42 h后開始進入穩(wěn)定期，此時二者的OD600值分別為21.33和39.00，優(yōu)化后較優(yōu)化前提高了82.84%。

2.6 上罐發(fā)酵后CQN-2菌株生長曲線

根據(jù)搖瓶優(yōu)化培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的結果，在5 L罐上進行CQN-2發(fā)酵工藝的放大，其生長代謝曲線如圖6所示。結果表明，在裝液量3 L、溫度30℃、轉速600 r/min條件下，pH對CQN-2菌體生物量有重要影響，不控制pH試驗組的CQN-2生長要優(yōu)于控制pH試驗組，從發(fā)酵開始隨著時間推移，CQN-2菌體濃度就迅速增加，24 h后開始逐漸放緩，至36 h時CQN-2菌體OD600值達到72.45，而同期控制pH試驗組的OD600值為63.54。取適量發(fā)酵液進行梯度稀釋并平板涂布計數(shù)，得到不控pH試驗組CQN-2菌株發(fā)酵36 h后的菌體濃度為3.03×1012CFU/mL。

3 結論與討論

芽孢桿菌廣泛存在于自然環(huán)境中，對人畜無害，不污染環(huán)境，又具有極好的抗菌活性和抗逆性，且繁殖能力強、便于工業(yè)化生產，因此近年來作為重要的生防菌種來源受到普遍關注。解淀粉芽孢桿菌是重要的生防菌和益生菌菌種[12-14]，本研究以提高漁源解淀粉芽孢桿菌CQN-2菌體生物量為目標，通過單因素、正交試驗優(yōu)化CQN-2的發(fā)酵條件，結果顯示，CQN-2菌株的最適碳源為可溶性淀粉，最適氮源為細菌學蛋白胨，經優(yōu)化后的最佳培養(yǎng)基配方為可溶性淀粉20 g/L、細菌學蛋白胨30 g/L、糖蜜50 g/L、KH2PO40.5 g/L、MgSO40.5 g/L、NaCl 0.3 g/L、Mn2+5 mmol/L、Al3+1 mmol/L。權春善等[14]、汪晶晶等[17]、王勇等[18]、錢文靜等[25]學者的研究結果均顯示葡萄糖為解淀粉芽孢桿菌的最優(yōu)碳源，而最優(yōu)氮源包括牛肉膏、蛋白胨和酵母粉等。楊冬靜等[26]指出解淀粉芽孢桿菌XZ-1的最佳碳源、氮源分別為糊精和蛋白胨。無機鹽方面，KCl、MgCl2、CaCl2和FeSO4等均被篩選為最適培養(yǎng)基的組成成分[14，17，25-26]。可見，不同學者根據(jù)不同來源的解淀粉芽孢桿菌菌株進行發(fā)酵條件優(yōu)化，但由于菌株本身特征存在一定差異，其最適的發(fā)酵培養(yǎng)基組成可能存在差異[26]。

此外，溫度、pH、接種量、培養(yǎng)時間等都會影響到細菌發(fā)酵過程中的生物量[18]。菌體自身生長和產物的代謝都與溫度密切相關，在適宜的溫度下，微生物快速生長，而溫度不適時會抑制細菌的正常生長，甚至殺滅菌體。此外，菌體自身體內的酶合成和能量代謝都受到溫度的影響。發(fā)酵液pH可以通過影響菌體的細胞膜上電荷，以及培養(yǎng)液的離子化過程等影響微生物的生長[25]。本研究結果顯示，CQN-2菌株的最佳發(fā)酵培養(yǎng)條件為初始pH值7.0、溫度30℃，250 mL錐形瓶中裝液量為15 mL、接種量為3%、發(fā)酵時間42 h。這與汪晶晶等[17]、王勇等[18]的研究結果類似，而與其他學者[25-26]得到的最適培養(yǎng)條件存在一定的差異。因此，根據(jù)自身的菌種和菌株類型，選擇適合菌株本身生長的培養(yǎng)基成分和發(fā)酵條件，才能更有利于菌體生物量的增加。

本研究只是對CQN-2菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)條件進行優(yōu)化，以及小試規(guī)模發(fā)酵條件的初步探究，今后還需要進行中試和規(guī)?；a，將發(fā)酵工藝進一步完善，獲得應用于工業(yè)化的發(fā)酵工藝，為其產業(yè)化生產提供依據(jù)。目前，解淀粉芽孢桿菌已被廣泛應用于植物生防領域[27]，可作為微生物肥料[28]、微生物種子處理劑、微生物殺菌劑和微生物保鮮劑[29]等；同時解淀粉芽孢桿菌作為益生菌在畜禽領域的應用也受到越來越多的關注[13，30]。此外，解淀粉芽孢桿菌也將作為新的益生菌添加劑被應用于水產領域，前景廣闊。