王朋云

(1.莆田市水產(chǎn)技術(shù)推廣站，福建 莆田351100；2.福建省海洋生物增養(yǎng)殖與高值化利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門(mén)361013)

雙線(xiàn)紫蛤(Soletellinadiphos)常埋棲于潮間帶中、下區(qū)至淺海的細(xì)沙和砂泥質(zhì)海底，分布地區(qū)為印度洋及西太平洋，在中國(guó)主要產(chǎn)于福建以南沿海。雙線(xiàn)紫蛤肉質(zhì)鮮美，食用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值高，但天然采捕產(chǎn)量較少，已被列入福建省重點(diǎn)保護(hù)野生動(dòng)物名錄。南日島是福建沿海雙線(xiàn)紫蛤棲息與繁殖的自然主產(chǎn)區(qū)，亦是南日群島的主島，位于平海灣與興化灣的交匯處，呈西北-東南方向具芒角啞鈴狀排列，長(zhǎng)約14.0 km，最狹處寬約3.0 km，島岸線(xiàn)總長(zhǎng)66.43 km，面積45.08 km2，該海域分布的雙線(xiàn)紫蛤資源常被供應(yīng)于青島、福州、廈門(mén)多家科研院所高校做研究和平潭、連江等地水產(chǎn)企業(yè)做苗種繁育。海區(qū)生物資源的豐度與遺傳多樣性、海域生態(tài)環(huán)境的狀況存有緊密的聯(lián)系，為遏制野生雙線(xiàn)紫蛤種群資源衰退，聚焦當(dāng)?shù)胤N質(zhì)遺傳背景并清晰了解生境水域條件，開(kāi)展人工繁殖育苗，評(píng)估生態(tài)影響科學(xué)增殖放流以復(fù)壯種群，進(jìn)行群體內(nèi)基因序列多態(tài)性及海區(qū)水樣檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析勢(shì)在必行，對(duì)保護(hù)和修復(fù)南日島的雙線(xiàn)紫蛤種質(zhì)資源意義重大。目前國(guó)內(nèi)已有雙線(xiàn)紫蛤的研究報(bào)道，主要在人工養(yǎng)殖擴(kuò)繁[1-3]、形態(tài)差異[4]、軟體部營(yíng)養(yǎng)成分[5]、血細(xì)胞組成[6]和系統(tǒng)親緣進(jìn)化[7-8]等方面，但尚未有開(kāi)展雙線(xiàn)紫蛤地理群體序列多態(tài)性和棲息地水環(huán)境分析的詳細(xì)報(bào)道。

線(xiàn)粒體COI基因序列被廣泛應(yīng)用于檢測(cè)雙殼貝類(lèi)等的群體遺傳多樣性、遺傳結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)發(fā)育研究，基因序列的單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphism，SNP)位點(diǎn)是可被應(yīng)用于區(qū)別不同地理種群以及評(píng)估自然群體遺傳變異程度的有效分子標(biāo)記。開(kāi)展海域水體鹽度、溫度、pH、溶解氧、葉綠素a、透明度常規(guī)和化學(xué)需氧量、無(wú)機(jī)氮、無(wú)機(jī)磷、石油類(lèi)常見(jiàn)污染物等多項(xiàng)參數(shù)追蹤檢測(cè)，是全面掌握海區(qū)水環(huán)境狀況動(dòng)態(tài)變化特征的科學(xué)技術(shù)手段。為調(diào)研雙線(xiàn)紫蛤南日島自然種群的遺傳差異和生長(zhǎng)環(huán)境情況，本研究在直接利用COI條形碼雙向測(cè)序檢測(cè)SNP位點(diǎn)的基礎(chǔ)上，結(jié)合統(tǒng)計(jì)多年南日島海域水樣檢測(cè)數(shù)據(jù)，對(duì)其遺傳多樣性與生長(zhǎng)海域水環(huán)境情況進(jìn)行分析，以期為雙線(xiàn)紫蛤的遺傳標(biāo)記、生態(tài)調(diào)查等研究積累數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)所用雙線(xiàn)紫蛤野生群體樣本由福建省南日島海洋生物技術(shù)有限公司在南日島海域所采集，同一海區(qū)水樣檢測(cè)結(jié)果由莆田市海洋與漁業(yè)環(huán)境監(jiān)測(cè)站提供。

1.2 方法

1.2.1 序列多態(tài)性

于2018年10月22日—11月28日捕獲的雙線(xiàn)紫蛤活體立即低溫帶回實(shí)驗(yàn)室處理，隨機(jī)抽選30枚個(gè)體，剪取前閉殼肌抽提基因組DNA，檢測(cè)定量后低溫保存。引物(表1)為依據(jù)簡(jiǎn)并引物[9]擴(kuò)增測(cè)序結(jié)果在通用引物[10]基礎(chǔ)上修改下游堿基而來(lái)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，PCR擴(kuò)增COI序列體系及條件同《雙線(xiàn)紫蛤(Soletellinadiphos)形態(tài)、序列測(cè)定和同工酶的初步研究》采用的方法[7]，回收產(chǎn)物后送樣。樣本雙向直接測(cè)序結(jié)果經(jīng)人工校對(duì)后采用NCBI blastn在線(xiàn)比對(duì)驗(yàn)證核酸序列同源性、BankIt程序批量提交至GenBank，BioEdit編輯，Clustal X 對(duì)位，MEGA 6.0轉(zhuǎn)換格式、統(tǒng)計(jì)堿基組成和轉(zhuǎn)換顛換比、Kimura 2-parameter計(jì)算遺傳距離(bootstrap值重復(fù)1 000次)，DnaSP 6[11]計(jì)算多態(tài)位點(diǎn)數(shù)目、單倍型數(shù)目、單倍型多樣性(Hd)、核苷酸多樣性(Pi)、平均核苷酸變異數(shù)(k)及Tajima’s D[12]和Fu’s Fs中性檢驗(yàn)值[13]。

表1 雙線(xiàn)紫蛤COI基因序列片段擴(kuò)增所用的引物

1.2.2 棲息地水環(huán)境

2008—2018 年選擇數(shù)個(gè)具有季節(jié)代表性的月份(表2)安排出海取樣，南日島的雙線(xiàn)紫蛤棲息海區(qū)初期(2008—2010年)采樣站點(diǎn)6個(gè)，后續(xù)(2011—2018年)追加調(diào)整為12個(gè)，所布設(shè)的12個(gè)站點(diǎn)位置同2019年8月10—16日監(jiān)測(cè)站位[14](圖1)，10項(xiàng)理化因子樣品的采樣、運(yùn)輸、測(cè)定與質(zhì)量控制過(guò)程均嚴(yán)格依據(jù)GB 17378—2007《海洋監(jiān)測(cè)規(guī)范》要求進(jìn)行[15]。水樣的鹽度、溫度、pH、溶解氧、葉綠素a、透明度、化學(xué)需氧量、無(wú)機(jī)氮、無(wú)機(jī)磷、石油類(lèi)檢測(cè)結(jié)果按航次整理分項(xiàng)記入Excel軟件，計(jì)算不同時(shí)間尺度下的極值、均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差并繪制月份數(shù)據(jù)點(diǎn)折線(xiàn)圖。

表2 南日島海區(qū)水樣采集時(shí)間

2 結(jié)果

2.1 序列多態(tài)性

雙線(xiàn)紫蛤樣本編號(hào)為1～50(圖2-A)，盲選出30枚個(gè)體(圖2-B)進(jìn)行PCR，擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果與預(yù)期目的序列長(zhǎng)度一致(圖2-C)，測(cè)得的30條COI基因序列片段(MN176021～MN176050)分子量為702 bp，去除上、下游引物后為655 bp，其中保守位點(diǎn)642個(gè)，群體序列的4種堿基組成：T>G>A>C，個(gè)體間的各堿基含量變化不大，C占比最低、為16.07%，T比例最高、為41.95%，平均(G+C)含量39.52%明顯低于(A+T)含量60.48%(表3)，樣本間的遺傳距離介于0～0.009 2，總平均距離為(0.002 9±0.001 0)。

表3 雙線(xiàn)紫蛤COI基因序列片段堿基組成

雙線(xiàn)紫蛤群體30枚個(gè)體的COI片段中共計(jì)檢測(cè)出13個(gè)變異位點(diǎn)(表4)，出現(xiàn)頻率為1.98%，序列間的變異位點(diǎn)分布不均勻，在68～201 bp、393～532 bp兩段相對(duì)保守的區(qū)域沒(méi)有突變。其中202位點(diǎn)、601位點(diǎn)的突變頻率大于25.00%，分別為30.00%、26.67%，202位點(diǎn)突變模式為T(mén)/C轉(zhuǎn)換(圖3-A)，601位點(diǎn)為G/A轉(zhuǎn)換(圖3-B)，這2個(gè)SNP位點(diǎn)的波峰均較整齊且無(wú)雜峰干擾。全部變異位點(diǎn)經(jīng)雙向測(cè)試為純合突變，簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)4個(gè)(202、203、265、601)，自裔位點(diǎn)9個(gè)，無(wú)插入/缺失位點(diǎn)。在這13個(gè)位點(diǎn)中僅有1個(gè)顛換位點(diǎn)(占7.69%)，即55位點(diǎn)的A/T顛換，其余為轉(zhuǎn)換位點(diǎn)，T/C之間轉(zhuǎn)換5個(gè)、C/T轉(zhuǎn)換3個(gè)、G/A轉(zhuǎn)換3個(gè)、A/G轉(zhuǎn)換1個(gè)，T/C轉(zhuǎn)換比例較高、占41.67%；序列中出現(xiàn)的突變總數(shù)為34，轉(zhuǎn)換/顛換的偏倚率(R)為13.04(>2.0)。群體的序列翻譯成氨基酸，發(fā)現(xiàn)203位點(diǎn)的C/T轉(zhuǎn)換引起了相應(yīng)氨基酸亮氨酸(Leu)/苯丙氨酸(Phe)的變化，為非同義替換，其余12個(gè)位點(diǎn)屬于同義替換，非同義和同義替換比值為0.08(<1.0)。編碼氨基酸的密碼子中，第3位的轉(zhuǎn)換最多、有9個(gè)位點(diǎn)，第1位次之、有3個(gè)(203、392、533)，顛換出現(xiàn)在第3位、有1個(gè)位點(diǎn)，第2位的轉(zhuǎn)換和顛換數(shù)為0。

表4 雙線(xiàn)紫蛤COI基因序列片段檢出的SNP位點(diǎn)

雙線(xiàn)紫蛤群體30枚個(gè)體的COI序列依據(jù)片段中SNP位點(diǎn)的分布情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，共檢測(cè)到9個(gè)單倍型(表5)，占樣本總數(shù)的30.00%，單倍型多態(tài)性指數(shù)(Hd)為(0.598 0±0.103 0)(Hd>0.5)，核苷酸多樣性指數(shù)(Pi)為(0.002 9±0.000 6)(Pi<0.005)，平均核苷酸變異數(shù)(k)為1.912 6，中性檢驗(yàn)Tajima’s D值為-1.377 5(<0.00)、不顯著(P>0.05)，F(xiàn)u’s Fs值-2.354 0(<0.00)、不顯著(P>0.05)。單倍型Hap1包含的樣本個(gè)體數(shù)最多、為19枚(樣本1、2、4、7、10、14、19、22、25、27、28、29、31、32、35、39、43、45、47)，占樣本含量的63.33%，是群體基于COI序列片段的主要單倍型，Hap5次之、含3枚(樣本12、41、42)，Hap4有2枚(樣本11、15)，其余Hap2(樣本5)、Hap3(樣本6)、Hap6(樣本13)、Hap7(樣本24)、Hap8(樣本36)、Hap9(樣本46)6個(gè)單倍型各僅出現(xiàn)1枚個(gè)體，占單倍型種類(lèi)的66.67%。

表5 雙線(xiàn)紫蛤COI基因序列片段單倍型和SNP位點(diǎn)的分布情況

續(xù)表5

2.2 棲息地水環(huán)境

2008年4月—2018年12月南日島雙線(xiàn)紫蛤棲息海域74個(gè)航次海水的10項(xiàng)理化因子共測(cè)得7 740個(gè)水環(huán)境數(shù)據(jù)，其中鹽度、溫度、pH、溶解氧、葉綠素a、透明度、化學(xué)需氧量、無(wú)機(jī)氮、無(wú)機(jī)磷和石油類(lèi)分析項(xiàng)目檢測(cè)結(jié)果各774個(gè)。

2008—2018年海水鹽度變化范圍為25.80～34.90，11年間的月平均波動(dòng)為26.84～34.33，平均值為(31.48±1.89)，鹽度總體上夏季(33.60±0.40)>春季(31.40±1.17)>秋季(30.07±1.54)>冬季(29.11±1.22)，在秋季變化幅度較大；各年鹽度春、夏、秋三季變化均呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)，夏季均為全年的最高值，春季除2013年外均為次高值，有8年最低值出現(xiàn)在冬季、7年次低值出現(xiàn)在秋季，年平均值：2018年>2008年>2011年>2010年>2015年>2013年>2017年>2009年>2014年>2012年>2016年；最低值出現(xiàn)在2016年10月的站點(diǎn)當(dāng)中，當(dāng)月平均為(27.46±0.59)，最高在2016年7月，當(dāng)月平均值為(34.33±0.29)。

2008—2018年海水溫度變化范圍為12.80～29.90℃，11年間的月均波動(dòng)為13.27～29.33℃，平均值為(21.73±4.83)℃，溫度總體上夏季(27.71±1.09)℃>秋季(23.33±1.54)℃>春季(18.72±3.26)℃>冬季(16.89±2.19)℃，在春季變化幅度較大；除2010年缺少冬季數(shù)據(jù)外，各年溫度四季變化均呈現(xiàn)出先上升后下降再下降的趨勢(shì)，溫度全年的最高值均出現(xiàn)在夏季，次高值均出現(xiàn)在秋季，有8年最低值出現(xiàn)在冬季、9年次低值出現(xiàn)在春季，年平均值：2008年>2015年>2017年>2010年>2018年>2016年>2014年>2013年>2011年>2012年>2009年；最低值出現(xiàn)在2012年3月，當(dāng)月平均為(13.27±0.43)℃，最高在2012年8月，當(dāng)月平均值為(29.33±0.33)℃。

2008—2018年pH變化范圍為7.73～8.74，11年間的月均波動(dòng)為7.89～8.54，平均值為(8.09±0.09)，pH總體上春季(8.13±0.09)>冬季(8.10±0.06)>秋季(8.09±0.06)>夏季(8.03±0.09)，在春、夏兩季變化幅度相對(duì)較大；各年pH春、夏兩季變化均呈現(xiàn)出下降的趨勢(shì)，有6年最高值出現(xiàn)在春季，8年夏、秋兩季升高且最低值出現(xiàn)在夏季，6年秋、冬兩季升高或次低值出現(xiàn)在秋季，年平均值：2010年>2011年>2008年>2018年>2012年>2017年>2009年>2014年>2013年>2015年>2016年；最低值出現(xiàn)在2016年7月，當(dāng)月平均為(7.92±0.08)，最高在2010年5月，當(dāng)月平均值為(8.54±0.13)。

2008—2018年溶解氧變化范圍為5.45 ～9.92 mg/L，11年間的月均波動(dòng)為5.64 ～9.31 mg/L，平均值為(7.44±0.71)mg/L，溶解氧總體上春季(7.89±0.61)mg/L >冬季(7.49±0.66)mg/L >秋季(7.30±0.40)mg/L >夏季(6.84±0.54)mg/L，在冬季變化幅度較大；各年溶解氧含量春夏變化均呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)，有8年最高值出現(xiàn)在春季，9年夏、秋兩季升高且最低值出現(xiàn)在夏季，6年秋、冬兩季升高，7年次低值出現(xiàn)在秋季，年平均值：2012年>2014年>2017年>2010年>2018年>2013年>2016年>2011年>2015年>2009年>2008年；最低值出現(xiàn)在2009年7月，當(dāng)月平均為(5.64±0.19)mg/L，最高在2010年5月，當(dāng)月平均值為(9.31±0.67)mg/L。

2008—2018年葉綠素a變化范圍為0.06 ～20.93 μg/L，11年間的月均波動(dòng)為0.33 ～15.57 μg/L，平均值為(1.81±1.84)μg/L，葉綠素a總體上夏季(2.57±1.79)μg/L >春季(1.75±2.18)μg/L >秋季(1.54±0.99)μg/L >冬季(0.76±0.26)μg/L，在春季變化幅度較大；除2010年外，其余各年葉綠素a含量春、夏兩季變化均呈現(xiàn)出升高，秋、冬兩季則均降低的趨勢(shì)，有9年夏、秋兩季降低，8年最高值出現(xiàn)在夏季，9年最低值出現(xiàn)在冬季，年平均值：2010年>2009年>2008年>2011年>2017年>2016年>2012年>2013年>2015年>2018年>2014年；最低值出現(xiàn)在2018年3月，當(dāng)月平均為(0.33±0.27)μg/L，最高在2010年5月，當(dāng)月平均值為(15.57±4.38)μg/L。

2008—2018年透明度變化范圍為0.30 ～2.00 m，11年間的月均波動(dòng)為0.40 ～1.79 m，平均值為(0.79±0.24)m，透明度總體上春季(0.86±0.24)m >夏季(0.83±0.26)m >秋季(0.73±0.16)m >冬季(0.61±0.17)m，在夏季變化幅度較大；各年透明度有8年春、夏兩季降低且最高值出現(xiàn)在春季，7年夏、秋兩季或秋、冬兩季降低，年平均值：2008年>2014年>2010年>2011年>2013年>2009年>2015年>2016年>2017年>2018年>2012年；最低值分別出現(xiàn)在2009年3月、2012年12月、2017年12月的站點(diǎn)，當(dāng)月平均依次為(0.45±0.08)m、(0.45±0.16)m、(0.40±0.04)m，最高在2008年7月，當(dāng)月平均值為(1.79±0.13)m。

海水年鹽度、年葉綠素a含量大多數(shù)月份的數(shù)值隨著水溫升降，月均波動(dòng)趨勢(shì)同溫度變化相對(duì)較一致；溶解氧含量則一般隨著溫度升高而降低，檢測(cè)結(jié)果其變動(dòng)與水溫升降呈現(xiàn)出一定的負(fù)相關(guān)；pH、透明度的季節(jié)月份變化沒(méi)有規(guī)律，二者波動(dòng)與溫度變化的直接影響關(guān)系不明顯(圖4)。

2008—2018年南日島海區(qū)的化學(xué)需氧量變化范圍為0.11～2.28 mg/L，11年間的月平均波動(dòng)為0.22 ～1.59 mg/L，均值為(0.67±0.29)mg/L，化學(xué)需氧量總體上冬季(0.72±0.36)mg/L >夏季(0.68±0.28)mg/L >春季(0.67±0.28)mg/L >秋季(0.58±0.21)mg/L，在冬季變化幅度較大；各年化學(xué)需氧量季節(jié)變化無(wú)規(guī)律，年均值：2010年>2018年>2009年>2008年>2017年>2013年>2014年>2011年>2016年>2015年>2012年；最低值出現(xiàn)在2008年9月的站位，當(dāng)月平均值為(0.22±0.07)mg/L，最高在2010年5月，當(dāng)月平均值為(1.22±0.55)mg/L。

2008—2018年無(wú)機(jī)氮變化范圍為0.03～0.54 mg/L，11年間的月均波動(dòng)為0.04～0.45 mg/L，均值為(0.23±0.12)mg/L，無(wú)機(jī)氮總體上冬季(0.37±0.09)mg/L >秋季(0.30±0.08)mg/L >春季(0.23±0.10)mg/L >夏季(0.13±0.07)mg/L，在春季變化幅度較大；各年無(wú)機(jī)氮含量春、夏、秋三季變化均呈現(xiàn)出先減少后增加的趨勢(shì)，最低值均在夏季，年均值：2016年>2012年>2014年>2013年>2017年>2015年>2009年>2008年>2011年>2018年>2010年；最低值出現(xiàn)在2017年7月，當(dāng)月平均值為(0.04±0.01)mg/L，最高在2016年4月，當(dāng)月平均值為(0.36±0.09)mg/L。

2008—2018年無(wú)機(jī)磷變化范圍為0～0.37 mg/L，11年間的月均波動(dòng)為0.00～0.16 mg/L，均值為(0.02±0.03)mg/L，無(wú)機(jī)磷總體上冬季(0.03±0.01)mg/L >秋季(0.03±0.02)mg/L >春季(0.02±0.02)mg/L >夏季(0.01±0.03)mg/L，在夏季變化幅度較大；除2008年外，各年無(wú)機(jī)磷含量夏、秋兩季變化均呈現(xiàn)出增加的趨勢(shì)，有9年春、夏兩季減少的波動(dòng)，最低值出現(xiàn)在夏季，年均值：2008年>2010年>2013年>2012年>2016年>2011年>2018年>2009年>2014年>2017年>2015年；最低值出現(xiàn)在2017年7月，當(dāng)月平均值為(0.01±0.00)mg/L，最高在2008年6月，當(dāng)月平均值為(0.16±0.14)mg/L。

海水年化學(xué)需氧量的測(cè)試結(jié)果：季節(jié)月份變化沒(méi)有顯著特點(diǎn)，不與海區(qū)水溫的升降同步或相反；無(wú)機(jī)氮的部分年度數(shù)據(jù)表現(xiàn)出了隨著水溫升高而降低、降低而回升的負(fù)相關(guān)趨勢(shì)，部分月份的結(jié)果則不支持這一現(xiàn)象；無(wú)機(jī)磷含量的月均數(shù)值波動(dòng)同溫度變化的關(guān)系存在著和無(wú)機(jī)氮檢測(cè)結(jié)果類(lèi)似的負(fù)相關(guān)情況(圖5)。

2008—2018年南日島海區(qū)的石油類(lèi)檢測(cè)數(shù)據(jù)變化范圍為0～0.49 mg/L，11年期間的月平均波動(dòng)為0～0.20 mg/L，平均值為(0.02±0.03)mg/L，石油類(lèi)總體上夏季>秋季>春季>冬季，在夏季變化幅度較大；各年石油類(lèi)含量季節(jié)變化無(wú)規(guī)律，年平均值：2009年>2008年>2016年>2014年>2013年>2018年>2017年>2011年>2015年>2012年>2010年；最低值在2008年12月、2011年12月、2013年5月的站位中都有出現(xiàn)，當(dāng)月平均值皆為0 mg/L，最高在2009年7月，當(dāng)月平均值為(0.20±0.22)mg/L。石油類(lèi)含量多年度的月份波動(dòng)不規(guī)律，與海水的溫度高低變化模式?jīng)]有發(fā)現(xiàn)明顯的關(guān)聯(lián)(圖6)。

11年間南日島雙線(xiàn)紫蛤群體棲息海區(qū)水環(huán)境的鹽度、溫度等10項(xiàng)理化參數(shù)檢測(cè)結(jié)果年際統(tǒng)計(jì)分析均沒(méi)有出現(xiàn)逐年遞增或遞減的波動(dòng)現(xiàn)象(表6)。

表6 南日島海區(qū)水環(huán)境各項(xiàng)理化因子歷年比較

續(xù)表6

3 討論

3.1 序列多態(tài)性

本研究利用PCR產(chǎn)物直接測(cè)序法對(duì)雙線(xiàn)紫蛤群體的COI基因片段進(jìn)行分析，在樣本個(gè)體的標(biāo)記序列PCR過(guò)程中，簡(jiǎn)并引物[9]能夠很好地?cái)U(kuò)增，但因其正、反向引物皆較多簡(jiǎn)并堿基而不適用于直接測(cè)序，需經(jīng)連接轉(zhuǎn)化；而通用引物[10]一直無(wú)法成功擴(kuò)增測(cè)序，表明其通用性不適用于雙線(xiàn)紫蛤。通過(guò)簡(jiǎn)并引物的單克隆測(cè)序結(jié)果，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)物重疊區(qū)域中不含通用引物的上游引物(LCO1490)結(jié)合位點(diǎn)，而下游引物(HCO2198)錨定區(qū)域26個(gè)堿基中分布著6個(gè)變異位點(diǎn)，據(jù)此修改后的引物則可以有效地應(yīng)用于雙線(xiàn)紫蛤群體樣本的COI基因部分序列測(cè)定。群體序列間的堿基組成含量，(A+T)含量占比優(yōu)勢(shì)明顯，與菲律賓蛤仔(Venerupisphilippinarum)[16]、文蛤(Meretrixmeretrix)[17]、麗文蛤(M.lusoria)[18]、西施舌(Coelomactraantiquata)[19]等海水雙殼類(lèi)COI基因序列的堿基組成特點(diǎn)相似。雙線(xiàn)紫蛤樣本個(gè)體間的遺傳距離都很小，遺傳距離的大小往往與分化的程度正相關(guān)，說(shuō)明南日島群體的遺傳分化程度不高。轉(zhuǎn)換/顛換比值遠(yuǎn)大于臨界值2.0，COI序列的突變未達(dá)到飽和狀態(tài)，可有效檢測(cè)多樣性，轉(zhuǎn)換比顛換的發(fā)生頻率明顯偏高，表明雙線(xiàn)紫蛤群體片段區(qū)域內(nèi)的變異相對(duì)較多的是發(fā)生在同類(lèi)型堿基之間，群內(nèi)個(gè)體間的親緣關(guān)系較近，符合近緣階元間核苷酸替換以轉(zhuǎn)換為主的常規(guī)[20-21]。獲得的測(cè)序峰圖堿基主峰清晰，無(wú)干擾雜峰，易于對(duì)COI基因片段的突變位點(diǎn)進(jìn)行精確地統(tǒng)計(jì)分析，突變大多數(shù)發(fā)生在密碼子第3位，占76.92%，第1位和第2位的突變較低，分別占23.08%和0%，392位點(diǎn)、533位點(diǎn)雖同203位點(diǎn)一樣突變發(fā)生在密碼子第1位，但CTA/TTA、TTG/CTG在無(wú)脊椎動(dòng)物線(xiàn)粒體基因中都表達(dá)為亮氨酸(Leu)，故堿基替換未引起氨基酸的變化。群體序列的非同義和同義替換比值小于1.0，說(shuō)明COI基因在進(jìn)化過(guò)程中可能受到負(fù)選擇壓力的作用。在30個(gè)樣本的655 bp序列中檢測(cè)出了13個(gè)突變位點(diǎn)，變異位點(diǎn)之間的位置分布、發(fā)生突變情況和突變頻率暫未觀察到明顯的規(guī)律，只在小部分樣本中具有一定程度的相似，但并不總是一致。遺傳多樣性的高低直接體現(xiàn)了群體的遺傳變異程度[22]，也間接反映了其適應(yīng)環(huán)境變化能力的強(qiáng)弱[23-25]，遺傳變異低的群體面對(duì)生境變化的壓力也較大[26]，種群的遺傳多樣性常用單倍型及核苷酸多樣性指數(shù)[27-28]來(lái)衡量，變異多樣性程度與指數(shù)大小正相關(guān)。南日島群體的Hd略大于標(biāo)準(zhǔn)值0.5、單倍型多樣性相對(duì)稍微偏高，而Pi低于0.005、核苷酸多樣性較低，低于菲律賓蛤仔(V.philippinarum)[16]、光滑河藍(lán)蛤(Potamocorbulalaevis)[29]、奇異指紋蛤(Acilamirabilis)和指紋蛤(A.divaricata)[30]等海洋貝類(lèi)，顯示單倍型與核苷酸多樣性高低沒(méi)有直接關(guān)系，說(shuō)明雙線(xiàn)紫蛤遺傳多樣性水平較低，對(duì)生存水環(huán)境條件改變敏感，種群可能有面臨嚴(yán)重衰退的風(fēng)險(xiǎn)，有必要加強(qiáng)保護(hù)，這與曾廣泛分布于南日島周邊海區(qū)的雙線(xiàn)紫蛤野生資源量近些年受干擾分布范圍有所減小的情況相符，遺傳多樣性因群體變小而降低。種群的高Hd低Pi被認(rèn)為可能是在經(jīng)歷過(guò)數(shù)量急劇減少的瓶頸效應(yīng)之后，幸存的優(yōu)勢(shì)個(gè)體得以繁殖形成較小的種群，短時(shí)間內(nèi)積累的核苷酸多樣性較低，群內(nèi)個(gè)體序列所屬的單倍型之間的差異較小[31-32]。Tajima’s D檢驗(yàn)值與Fu’s Fs檢驗(yàn)值為負(fù)，但二者的統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)P值并未達(dá)到顯著性差異水平，即沒(méi)有明顯地偏離0，說(shuō)明南日島群體符合中性進(jìn)化模型，顯示在過(guò)去較近的歷史時(shí)期內(nèi)群體大小保持穩(wěn)定狀態(tài)，內(nèi)部的遺傳分化現(xiàn)象還不夠明顯。線(xiàn)粒體基因一般遵循母系遺傳[33]，根據(jù)單倍型數(shù)量，推測(cè)抽選測(cè)序的30枚個(gè)體至少是9枚雌性親貝自然產(chǎn)卵繁殖的子代，單倍型Hap1代表的母系親本集體在群體中擁有最高的出現(xiàn)頻率，較其他8個(gè)單倍型，對(duì)本地海區(qū)生境有著更強(qiáng)的適應(yīng)能力，生存優(yōu)勢(shì)明顯。本研究因條件所限僅采集到莆田南日島1個(gè)地理群體，數(shù)次聯(lián)系赴廣東[4]、長(zhǎng)樂(lè)[6]等地搜集樣本未能如愿獲取，而鑒于已有資料指出雙線(xiàn)紫蛤在我國(guó)主要分布于福建以南沿海，期待后續(xù)能夠結(jié)合其他海區(qū)的自然群體進(jìn)行遺傳分化和遺傳結(jié)構(gòu)等方面的分析。

3.2 棲息地水環(huán)境

現(xiàn)有年際3—12月的水樣檢測(cè)數(shù)據(jù)表明，雙線(xiàn)紫蛤的分布和生長(zhǎng)發(fā)育對(duì)水環(huán)境有一定的要求，能夠適應(yīng)南日島潮間帶及淺海海區(qū)月均鹽度26.84～34.33的波動(dòng)幅度，適應(yīng)鹽度區(qū)間與中國(guó)紫蛤(Hiatulachinensis)[34]、波紋巴非蛤(Paphiaundulate)[35]對(duì)鹽度的耐受范圍有大部分重合，明顯不同于主要生活在鹽度相對(duì)較低的江河口咸淡水交匯處的尖紫蛤(H.acuta)[36]。棲息地環(huán)境水溫13.27～29.33℃的變化范圍，顯示出雙線(xiàn)紫蛤?qū)λh(huán)境溫度的適應(yīng)能力上限高于紫石房蛤(Saxidomuspurpuratus)[37]，低于皺紋蛤(Periglyptapuerpera)[38]但比其耐低溫，與大西洋浪蛤(Spisulasolidissima)[39]的習(xí)性相當(dāng)。每月取樣檢測(cè)日期因陰雨天氣、潮汐或任務(wù)調(diào)整而間隔時(shí)間沒(méi)有固定一致，個(gè)別月份如每年的1—2月受低溫或海況不佳風(fēng)急浪大影響無(wú)法出海，同一海區(qū)的水質(zhì)浮標(biāo)24 h全天候在線(xiàn)監(jiān)測(cè)設(shè)備[40]繪制的趨勢(shì)圖顯示2019年1—2月晝夜水溫變幅區(qū)間在10.02～13.64℃，說(shuō)明雙線(xiàn)紫蛤?qū)嶋H上可以短時(shí)間內(nèi)耐受生長(zhǎng)環(huán)境10.00℃以上的低溫。2008年8月水溫低于鄰近的7月、9月，也低于其他所有年份的同期值，海區(qū)表層水溫的日變化受太陽(yáng)輻射、氣象條件等的調(diào)節(jié)[41]，日間水溫逐漸上升，一般在下午至傍晚的時(shí)刻達(dá)到最高值[42]，夜間水溫呈下降的趨勢(shì)，凌晨至日出前的時(shí)刻達(dá)到最低值[43]，反映出之后根據(jù)天氣考慮合理安排出海時(shí)間對(duì)水溫測(cè)量結(jié)果至關(guān)重要；10月水溫在11年間的同期數(shù)據(jù)中處于第二高位，11月采樣時(shí)間與上月較近，冷空氣還未到達(dá)而未造成降溫，溫度略高0.26℃，但尚在正常逐日變化差值波動(dòng)范圍內(nèi)。2010年5月海水的葉綠素a含量檢測(cè)結(jié)果偏高，約是2017年7月第二高值6.34 μg/L的2.46倍，另外顯微鏡檢在水樣中發(fā)現(xiàn)大量的東海原甲藻(Prorocentrumdonghaiense)，應(yīng)該是該藻的快速生長(zhǎng)繁殖導(dǎo)致了葉綠素a含量猛增。透明度的降低，除了水溫、營(yíng)養(yǎng)等條件適宜浮游生物活躍增殖的影響外，亦會(huì)受海區(qū)水深[44]、氣象風(fēng)浪[45]翻動(dòng)海區(qū)底泥沉積物或懸浮物[46]等的影響。冬季低溫條件下細(xì)菌、浮游植物等生長(zhǎng)繁殖活力不強(qiáng)，初級(jí)生產(chǎn)力水平降低對(duì)營(yíng)養(yǎng)元素吸收利用減弱，使得南日島海域的無(wú)機(jī)氮、無(wú)機(jī)磷在冬季含量較高，多年月均變化情形基本一致，與福建多地沿海海水氮和磷監(jiān)測(cè)信息的三季時(shí)空消長(zhǎng)特征相似[47-48]。石油類(lèi)含量數(shù)值在2009年7月出現(xiàn)異常，達(dá)到2008年7月次高值0.06 mg/L的3.33倍，各站點(diǎn)的最低檢測(cè)值為0.03 mg/L，最高為0.49 mg/L，差異較大，可能與采樣雇傭船只自身或個(gè)別站位附近恰逢有作業(yè)航道有一定的關(guān)系。通過(guò)統(tǒng)計(jì)南日島海域水樣的各項(xiàng)理化因子檢測(cè)數(shù)據(jù)，分析相應(yīng)參數(shù)的水平或濃度多年度季節(jié)月份均值波動(dòng)變化范圍，對(duì)雙線(xiàn)紫蛤棲息的水環(huán)境狀況進(jìn)行初步調(diào)查了解，為進(jìn)一步的生態(tài)習(xí)性觀察實(shí)驗(yàn)提供了參考。

致謝：實(shí)驗(yàn)得到福建省水產(chǎn)研究所曾志南研究員及巫旗生助理研究員、莆田市海洋與漁業(yè)環(huán)境監(jiān)測(cè)站張麗高級(jí)工程師及全體同仁、福建省南日島海洋生物技術(shù)有限公司陳珍賜總經(jīng)理的諸多支持，特此致謝。