貢獻(xiàn)，佟碩秋，吳擁軍

(貴州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山地植物資源保護(hù)與種質(zhì)創(chuàng)新教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山地生態(tài)與農(nóng)業(yè)生物工程協(xié)同創(chuàng)新中心，貴陽 550025)

豆豉是我國一種傳統(tǒng)的大豆發(fā)酵產(chǎn)品，具有悠久的歷史。因其獨(dú)特的風(fēng)味和口感、極高的食用價(jià)值、一定的藥理作用[1]，深受廣大消費(fèi)者的喜愛。同時(shí)，近年來隨之出現(xiàn)的豆豉中毒事件也備受廣大群眾的關(guān)注。研究者對豆豉發(fā)酵過程中菌群的動態(tài)變化進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)豆豉在發(fā)酵過程中受到不同雜菌的污染[2]。目前在豆豉中毒事件中，報(bào)道的病原菌主要有肉毒桿菌[3]、大腸桿菌[4]、蠟樣芽孢桿菌[5]，而豆豉中毒事件中70%都是由于蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus，BC)污染豆豉以及其產(chǎn)毒所導(dǎo)致的。

蠟樣芽孢桿菌是一種革蘭氏陽性菌，是一種主要由禾谷鐮刀菌、黃色鐮刀菌與粉紅鐮刀菌產(chǎn)生的B型單端孢酶烯族化合物[6]，其生長溫度范圍較廣(10～45 ℃)，是一種好氧產(chǎn)孢菌，可生長于pH值2～11的條件下，在無鹽環(huán)境下生長良好，當(dāng)氯化鈉濃度為1%時(shí)生長最佳，8%時(shí)有抑制作用[7]。蠟樣芽孢桿菌廣泛存在于食物中，易引起食物中毒[8]。由蠟樣芽孢桿菌引起的食物中毒，有嘔吐型和腹瀉型兩種。腹瀉型蠟樣芽孢桿菌主要由腹瀉型腸毒素引起，多見于美國，該毒素不耐熱，一般通過加熱即可使其失活，腹瀉型中毒主要與蠟樣芽孢桿菌的活菌數(shù)有關(guān)[9]。而嘔吐型蠟樣芽孢桿菌中毒主要由嘔吐毒素基因ces翻譯的耐熱性腸毒素嘔吐素(cereulide)引起，嘔吐型蠟樣芽孢桿菌中毒僅與產(chǎn)嘔吐毒素菌株的活菌數(shù)有關(guān)。在我國嘔吐型蠟樣芽孢桿菌引起的食物中毒十分常見[10]，感染該毒素的患者伴有腹痛、腹瀉、惡心嘔吐、無發(fā)熱[11,12]。蠟樣芽孢桿菌在室溫20 ℃左右能很好繁殖, 且具有形成耐熱芽孢的特性,通常食品加熱烹調(diào)(熱沖擊) 無法使該菌的芽孢失活, 芽孢則會殘存發(fā)芽[13]，并釋放毒素。研究發(fā)現(xiàn)cereulide的劑量在5～10 ng/g會引起食物中毒[14,15]，對食品的安全性造成嚴(yán)重隱患。

研究通過對蠟樣芽孢桿菌計(jì)數(shù)結(jié)果為陽性的豆豉樣本提取其宏基因組，利用嘔吐毒素ces基因特異性引物，對蠟樣芽孢桿菌陽性豆豉樣本中嘔吐毒素基因ces進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測樣本中嘔吐型蠟樣芽孢桿菌，檢出率為92.6%，結(jié)果揭示了蠟樣芽孢桿菌陽性豆豉樣本中嘔吐型BC的存在情況。而后，采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)對自然發(fā)酵和純種強(qiáng)化發(fā)酵豆豉成品中所含的嘔吐毒素cereulide進(jìn)行定量檢測[16]，發(fā)現(xiàn)自然發(fā)酵和純種發(fā)酵豆豉中嘔吐毒素cereulide含量分別為(0.0106±0.0006) μg/kg和(0.029±0.0002) μg/kg，遠(yuǎn)低于我國國標(biāo)GB 2761-2017中規(guī)定的發(fā)酵豆制品中次生有毒代謝產(chǎn)物的限定含量5 μg/kg[17]。通過對嘔吐型蠟樣芽孢桿菌產(chǎn)生的cereulide進(jìn)行定量分析，對豆豉的食用安全性進(jìn)行評價(jià)，表明該細(xì)菌型豆豉短時(shí)間內(nèi)暫不存在cereulide超標(biāo)引發(fā)的安全性問題。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株：蠟樣芽孢桿菌，為實(shí)驗(yàn)室保藏菌株。

取貴陽某食品廠的自然發(fā)酵不同發(fā)酵時(shí)期蠟樣芽孢桿菌陽性豆豉樣本18個(gè)(ZR6h、ZR12h、ZR18h、ZR24h、ZR30h、ZR36h、ZR42h、ZR54h、ZR60h、ZR66h、ZR72h、ZR1d、ZR2d、ZR3d、ZR4d、ZR5d、ZR6d、ZR7d)，純種發(fā)酵不同發(fā)酵時(shí)期蠟樣芽孢桿菌陽性豆豉樣本9個(gè)(CZ0h、CZ6h、CZ1d、CZ2d、CZ3d、CZ4d、CZ5d、CZ6d、CZ7d)，共27個(gè)陽性豆豉樣本(實(shí)驗(yàn)中使用的蠟樣芽孢桿菌陽性豆豉樣本中，蠟樣芽孢桿菌含量均未超過105CFU/g)。

Takara Bacterial Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0試劑盒;Takara 2×Taq Master Mix; 引物由上海生工生物工程公司進(jìn)行合成;cereulide標(biāo)準(zhǔn)品(HPLC 級)：購于德國Merck公司;本研究所用全部化學(xué)試劑均為分析純級。

1.2 儀器與設(shè)備

LDZX-50KBS全自動高壓滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；SW-CJ-IFD標(biāo)準(zhǔn)型凈化工作臺 上海錦星科學(xué)儀器有限公司；TGL-161高速臺式離心機(jī) 美國Sigma公司；XO超聲波細(xì)胞破碎儀 南京先歐儀器制造有限公司；My-Cycler PCR、Gel Doc XR凝膠成像系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司；Masslynx工作站 美國Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 豆豉中嘔吐型蠟樣芽孢桿菌嘔吐毒素ces基因檢測

1.3.1.1 蠟樣芽孢桿菌DNA提取

采用普通熱裂解法提取DNA[18]。

1.3.1.2 豆豉樣本宏基因組DNA提取

豆豉樣本宏基因組DNA提取采用Takara Bacterial Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0試劑盒提取基因組。樣品預(yù)處理過程如下：

從實(shí)驗(yàn)室前期篩選的27個(gè)蠟樣芽孢桿菌陽性豆豉樣本中，各取5 g豆豉置于10 mL無菌PBS(pH 7.2)緩沖液中，150 r/min，離心30 min后沉降5 min；吸取1 mL菌懸液，12000 r/min，離心2 min，棄上清；加1 mL無菌水重懸清洗，12000 r/min，離心2 min，收集菌體。

1.3.1.3 PCR擴(kuò)增

Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物PcesF/PcesR(PcesF):5′-ACCCATCTTGCGTCATT-3′(PcesR)：5′-CAGCCAAGTGAAGATACC-3′，對豆豉樣本中嘔吐毒素基因ces進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測。反應(yīng)體系：2×Taq Master Mix 5.0 μL、Up-primer(PcesF, 10 μmol/L)0.5 μL、Down-primer(PcesR,10 μmol/L)0.5 μL、Template DNA 3.0 μL，ddH2O 1.0 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸6 min。PCR產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠，100 V恒壓電泳30 min。

1.3.2 豆豉中嘔吐毒素cereulide含量的測定

1.3.2.1 樣品前處理

稱取自然發(fā)酵豆豉樣本、純種強(qiáng)化發(fā)酵豆豉樣本各1 g于15 mL離心管中。加入2 g無水Na2SO4和10 mL甲醇混勻，靜置30 min。70%功率超聲破碎10 min(超聲0.2 s，停1.0 s，振幅22%)后，3000 r/min離心10 min。吸上清液于新離心管中。剩下的沉淀繼續(xù)加入10 mL甲醇，重復(fù)超聲提取步驟。再吸取上清液并與之前提取的上清液合并。吸取20 mL提取液于真空濃縮機(jī)中凍干，用甲醇∶水溶液(80∶20，V/V)定容至400 μL。上述液體過0.2 μm濾膜后定容至400 μL，10000 r/min離心15 min，轉(zhuǎn)移上清至1 mL離心管中待測。

1.3.2.2 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

取標(biāo)準(zhǔn)品貯備液用80%甲醇稀釋，準(zhǔn)確配制(梯度稀釋)成濃度分別為0.010,0.10,0.50,1.0,5.0,30 μg/L的cereulide標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。

1.3.2.3 色譜條件與質(zhì)譜條件

參照參考文獻(xiàn)[19,20]。

1.3.2.4 回收率

向已知cereulide濃度樣品中添加4種不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液后，放置30 min使待測組分與樣品基體成分相互作用達(dá)到平衡，再將樣品前處理得到的樣品溶液在上述色譜和質(zhì)譜條件中進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 豆豉樣本中ces基因檢測

由圖1可知，27個(gè)豆豉樣本(純種發(fā)酵9個(gè)、自然發(fā)酵豆豉樣本18個(gè))中，純種發(fā)酵有8個(gè)豆豉樣本為陽性，檢出率為88.9%；自然發(fā)酵中，有18個(gè)豆豉樣本為陽性，檢出率為100%。嘔吐型BC的平均檢出率為96.3%。在CZ0h中未檢測出嘔吐型BC，原因可能是此時(shí)的豆豉樣本前發(fā)酵早期，嘔吐型BC菌數(shù)處于較少階段，導(dǎo)致提取的宏基因組濃度低于PCR檢測的最低檢測濃度，故無法進(jìn)行檢測。

圖1 豆豉樣本中嘔吐毒素基因 ces 檢測Fig.1 Detection of cereulide gene ces in the fermented soya beans samples注：M為DL2000 Marker；泳道1為陰性對照；泳道2為陽性對照；泳道3～11為CZ0h、CZ6h、CZ1d、CZ2d、CZ3d、CZ4d、CZ5d、CZ6d、CZ7d；泳道12～29為ZR6h、ZR12h、ZR18h、ZR24h、ZR30h、ZR36h、ZR42h、ZR54h、ZR60h、ZR66h、ZR72h、ZR1d、ZR2d、ZR3d、ZR4d、ZR5d、ZR6d、ZR7d。

2.2 嘔吐毒素cereulide標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

采用UPLC-MS/MS分別檢測樣品空白(80%甲醇)、標(biāo)準(zhǔn)樣品(0.010，0.10，0.50，1.0，5.0，30 μg/L)，根據(jù)質(zhì)譜定量信號計(jì)算相應(yīng)濃度，結(jié)果見表1。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線原始數(shù)據(jù)Table 1 The original data of standard curve

由圖2可知cereulide出峰時(shí)間約在3.3 min。

圖2 cereulide標(biāo)準(zhǔn)品LC-MS色譜圖Fig.2 The LC-MS chromatogram for cereulide standard sample

構(gòu)建嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，見圖3。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=1.59e4+4.4Xe6，X表示嘔吐毒素cereulide濃度，Y表示響應(yīng)值，相關(guān)系數(shù)(R2)>0.99，可見嘔吐毒素cereulide在0.10～30 μg/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

圖3 嘔吐毒素cereulide標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 The standard curve of emetic toxin cereulide

2.3 豆豉中嘔吐毒素cereulide含量檢測

根據(jù)1.3.2所述進(jìn)行嘔吐毒素含量測定，首先對自然發(fā)酵成品豆豉和純種發(fā)酵成品豆豉中的cereulide進(jìn)行提取，然后對其進(jìn)行UPLC-MS定量檢測，結(jié)果見圖4和圖5。

圖4 純種強(qiáng)化發(fā)酵豆豉MRM色譜圖Fig.4 MRM chromatogram of pure fermented soya beans

圖5 自然發(fā)酵豆豉 MRM 譜圖Fig.5 MRM chromatogram of natural fermented soya beans

根據(jù)兩個(gè)樣本的質(zhì)譜峰面積計(jì)算相應(yīng)樣本濃度。樣本中蠟樣芽孢桿菌嘔吐毒素cereulide定量數(shù)據(jù)見表2。

表2 嘔吐毒素 cereulide 檢測Table 2 Detection of emetic toxin cereulide

由表2可知，自然發(fā)酵豆豉中嘔吐毒素cereulide含量約為(0.0106±0.0006) μg/kg，純種發(fā)酵豆豉中嘔吐毒素cereulide含量約為(0.0289±0.0002) μg/kg。純種強(qiáng)化發(fā)酵豆豉中嘔吐毒素cereulide含量高于自然發(fā)酵豆豉。但兩種方式發(fā)酵豆豉的嘔吐毒素cereulide都遠(yuǎn)低于國標(biāo)GB 2761-2017發(fā)酵豆制品中次生有毒代謝產(chǎn)物的限量安全標(biāo)準(zhǔn)5.0 μg/kg。從嘔吐毒素的含量上來看，目前該豆豉暫時(shí)不存在蠟樣芽孢桿菌產(chǎn)生的嘔吐毒素引發(fā)的食用安全性問題。

豆豉作為中國傳統(tǒng)的風(fēng)味食品，其安全性受到人們的廣泛關(guān)注，對豆豉的安全性進(jìn)行評價(jià)時(shí)，除了研究蠟樣芽孢桿菌數(shù)量外，還需對其產(chǎn)生的嘔吐毒素含量進(jìn)行評價(jià)。目前，控制豆豉發(fā)酵過程中嘔吐型蠟樣芽孢桿菌的污染是一個(gè)急需解決的問題，因豆豉的后發(fā)酵是一個(gè)相對封閉的過程，難以實(shí)現(xiàn)在后發(fā)酵過程中控制嘔吐型蠟樣芽孢桿菌污染，所以前發(fā)酵和配料灌裝是控制嘔吐型蠟樣芽孢桿菌的污染源頭的關(guān)鍵之一。

2.4 嘔吐毒素cereulide加標(biāo)回收率檢測

在豆豉樣品中添加不同濃度的嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液(見表3)，測定其加標(biāo)回收率。

表3 加標(biāo)回收率Table 3 The recovery rate of cereulide

由表3可知，加標(biāo)回收率在81.9%～87.4%之間，可見該方法的回收率較好，準(zhǔn)確性較高，能滿足檢測要求。

3 結(jié)論

本研究對豆豉樣品中嘔吐毒素ces基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，27個(gè)豆豉樣本中，26個(gè)豆豉樣本檢測為陽性，檢出率高達(dá)96.3%，該地區(qū)食品廠豆豉易出現(xiàn)嘔吐型蠟樣芽孢桿菌污染的情況。對樣本中嘔吐毒素進(jìn)行定量檢測，自然發(fā)酵豆豉中含量達(dá)(0.0106±0.0006) μg/kg，純種發(fā)酵豆豉中含量達(dá)(0.0289±0.0002) μg/kg，均未超過國家標(biāo)準(zhǔn)，并且嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)品在設(shè)定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性良好(R2>0.99)，加標(biāo)回收率在81.9%～ 87.4%之間，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性和儀器精密度較好。綜上所述，通過對該地區(qū)豆豉樣本進(jìn)行嘔吐毒素定量分析，發(fā)現(xiàn)目前該地區(qū)食品廠生成的豆豉暫時(shí)不存在蠟樣芽孢桿菌產(chǎn)生的嘔吐毒素引發(fā)的食用安全性問題。本研究通過對不同發(fā)酵方式豆豉中嘔吐型蠟樣芽孢桿菌進(jìn)行檢測，再對其中嘔吐毒素含量進(jìn)行定量分析，對豆豉生產(chǎn)企業(yè)進(jìn)行食品安全控制具有重要指導(dǎo)意義。