王雯丹，董彩霞，劉 彪，蔭士安

(1.內(nèi)蒙古伊利實(shí)業(yè)集團(tuán)股份有限公司，伊利母嬰營(yíng)養(yǎng)研究院，北京 100022；2.甘肅省疾病預(yù)防控制中心，甘肅 蘭州 730000；3.中國(guó)疾病預(yù)防控制中心營(yíng)養(yǎng)與健康所，北京 100050)

近年來(lái)越來(lái)越多的研究報(bào)道，不管是全母乳還是混合喂養(yǎng)，對(duì)于嬰兒腸道菌群的組成與定植以及腸道免疫功能的啟動(dòng)與成熟均非常重要；且母乳喂養(yǎng)與嬰兒糞便中高豐度雙歧桿菌的數(shù)量顯著相關(guān)；停止(或過(guò)早停止)母乳喂養(yǎng)將導(dǎo)致以厚壁菌門為標(biāo)志的嬰兒腸道微生態(tài)的快速成熟[1]。母乳喂養(yǎng)是與嬰兒腸道菌群早期形成關(guān)聯(lián)最密切的因素。本文綜述了母乳中存在的細(xì)菌種類及檢測(cè)方法等。

1 母乳中的細(xì)菌種類及數(shù)量

由于傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為人乳清潔無(wú)菌，使得人乳中細(xì)菌成分以及在嬰兒腸道成熟與免疫功能建立方面的重要作用長(zhǎng)期被忽視。近二十年的研究結(jié)果表明，母乳喂養(yǎng)持續(xù)不斷地為嬰兒腸道提供共生菌、互生菌和/或益生菌。這些發(fā)現(xiàn)也讓人乳微生物組學(xué)的研究成為近年來(lái)關(guān)注和研究的熱門領(lǐng)域。

2013年，Martin等學(xué)者在健康母親的乳汁中通過(guò)滅菌采樣方法，首次發(fā)現(xiàn)人乳中存在乳酸菌(非外源性污染)，確認(rèn)人乳中存在非致病菌；隨后已發(fā)現(xiàn)人乳中超過(guò)200多種不同的微生物(屬于50種不同菌屬)[2]，個(gè)體間差異相當(dāng)大[3-5]，且受檢測(cè)技術(shù)的影響。影響母乳菌群組成的因素主要有：母親自身因素，包括體重、過(guò)敏史、膳食、免疫狀態(tài)等；產(chǎn)后因素，包括分娩方式、孕齡、母親抗生素類藥物使用、哺乳期等[6-7]；此外，喂養(yǎng)方式、人乳寡糖的含量、地域環(huán)境等都可能影響母乳的菌群結(jié)構(gòu)[8-10]。

人乳是嬰兒腸道細(xì)菌的主要來(lái)源。按嬰兒每天攝入約800mL母乳計(jì)算，母乳喂養(yǎng)兒攝入約十萬(wàn)到一千萬(wàn)的細(xì)菌。這也能解釋為何母乳喂養(yǎng)嬰兒的腸道菌群與其母親乳汁中發(fā)現(xiàn)的菌群組成密切相關(guān)[11]。母乳也是母乳喂養(yǎng)兒共生菌和益生菌的來(lái)源，包括葡萄球菌、乳酸菌和雙歧桿菌、鏈球菌、棒狀桿菌等[12]，其中乳酸菌和雙歧桿菌被認(rèn)為是益生菌[13]。人乳基因組分析結(jié)果顯示，人乳微生物群主要由葡萄球菌、假單胞菌和愛(ài)德華氏菌占主導(dǎo)，也含少量其他菌種[14-15]。

Sakwinska等[16]匯總了人乳微生物檢測(cè)結(jié)果，有相似結(jié)論，即人乳中微生物群主要由共生的葡萄球菌(如表皮葡萄球菌和鏈球菌)組成。Togo等[17]梳理了人乳微生物文獻(xiàn)，包括38個(gè)國(guó)家/地區(qū)的242篇論文，涉及10 000多名母親的15 000多份乳房與母乳微生物采樣樣本。共發(fā)現(xiàn)820個(gè)微生物物種，主要是變形菌門和厚壁菌門，出現(xiàn)頻次降序排列為金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、無(wú)乳鏈球菌等。

2 母乳中細(xì)菌種類的文獻(xiàn)綜述

Latuga等[6]匯總了用培養(yǎng)基和生物學(xué)方法發(fā)現(xiàn)的母乳中常見(jiàn)細(xì)菌(表1)；Fernandez等[11]梳理了文獻(xiàn)報(bào)道的采用傳統(tǒng)細(xì)菌分離或DNA檢測(cè)手段的研究(表2)；基于不同國(guó)家/地區(qū)的人乳中檢測(cè)到的細(xì)菌種類總結(jié)于表3。

表1 用培養(yǎng)基和生物學(xué)方法發(fā)現(xiàn)的母乳中常見(jiàn)細(xì)菌種類

表2 用傳統(tǒng)細(xì)菌分離或DNA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)的母乳中常見(jiàn)細(xì)菌種類

續(xù)表2

表3 不同國(guó)家報(bào)告的母乳中常見(jiàn)的細(xì)菌種類

3 母乳中細(xì)菌的檢測(cè)方法

目前對(duì)母乳菌群的研究仍處于初期，早期檢測(cè)方法是用傳統(tǒng)培養(yǎng)基將獲取的母乳樣品進(jìn)行培養(yǎng)和分離。由于絕大多數(shù)現(xiàn)場(chǎng)采集的人體樣品中，微生物無(wú)法直接進(jìn)行體外人工培養(yǎng)，因此在DNA測(cè)序技術(shù)，特別是宏基因組技術(shù)成熟之前，人們無(wú)法確定人乳中微生物的菌落組成，更談不上研究菌落的多樣性和穩(wěn)定性。歸功于近十年來(lái)新一代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，人們對(duì)體內(nèi)微生物群落組成的理解有了顯著進(jìn)展。目前用于鑒別人乳微生物的常用方法有培養(yǎng)基篩查法和不依賴培養(yǎng)基的方法。

3.1 傳統(tǒng)培養(yǎng)基法與不依賴培養(yǎng)基法的比較

傳統(tǒng)培養(yǎng)基篩選法是最常用于母乳微生物分離的方法，優(yōu)點(diǎn)是可得到分離的菌株進(jìn)行鑒定和計(jì)數(shù)，還可進(jìn)一步研究，但操作復(fù)雜、耗時(shí)，且該方法的檢測(cè)結(jié)果一定程度上取決于母乳樣本的新鮮程度，若存在交通不便和樣品轉(zhuǎn)運(yùn)不及時(shí)，則不能使用這種方法。不依賴培養(yǎng)基法即分子生物學(xué)分析方法，近年來(lái)被用于母乳微生物的測(cè)定，該方法可使用冷凍保存的母乳樣本，可直接分析母乳中微生物DNA多樣性，從而獲得微生物的種類與構(gòu)成。此方法操作簡(jiǎn)單快速，但無(wú)法分離得到細(xì)菌菌株。

上述檢測(cè)母乳微生物的分析方法各有優(yōu)劣，傳統(tǒng)的培養(yǎng)基篩選可分離得到相應(yīng)的菌株且可對(duì)菌株作后續(xù)研究，而分子生物學(xué)的方法分析快速、簡(jiǎn)便。因此選擇何種方法取決于研究目的。在2015年前，使用不基于培養(yǎng)基技術(shù)，如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reactions，PCR)等檢測(cè)母乳菌群組成的研究相對(duì)較少，近年來(lái)PCR技術(shù)逐漸成為檢測(cè)母乳菌群的主流技術(shù)。

3.2 分子生物學(xué)分析方法的應(yīng)用

宏基因組技術(shù)的成熟催生了2008年前后展開(kāi)的人類宏基因組研究計(jì)劃。該計(jì)劃為微生物菌落生態(tài)學(xué)的復(fù)興奠定了堅(jiān)實(shí)技術(shù)基礎(chǔ)。例如，在Hunt等[2]的宏基因組測(cè)序研究中，收集并分析了16例哺乳期婦女的47份乳樣，提供了較為全面的母乳細(xì)菌菌群測(cè)序數(shù)據(jù)。目前聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳/溫度梯度凝膠電泳(PCR-denatured gradient gel electrophoresis/temperature gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE/TGGE)、定量即時(shí)PCR(quantitative real time- PCR，qRT-PCR)和454焦磷酸測(cè)序等分子生物學(xué)方法已被用于分析人乳微生物種類與構(gòu)成。

3.2.1聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳/溫度梯度凝膠電泳

利用PCR-DGGE/TGGE方法，根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)的比對(duì)結(jié)果可分析母乳中微生物的種屬及其亞種，Martin等[4]用PCR-DGGE分析了母乳中細(xì)菌多樣性，從4個(gè)人乳樣品中共檢出20多種細(xì)菌，如人葡萄球菌、表皮葡萄球菌、唾液鏈球菌等。然而采用qRT-PCR卻只能分析出復(fù)雜樣品內(nèi)某一群微生物及數(shù)量，如Martin等[32]用該方法分析了母乳中總細(xì)菌和雙歧桿菌的數(shù)量，比較了母乳和嬰兒糞便細(xì)菌組成的差異，Collado等[5]分析了母乳中細(xì)菌菌落的多樣性。而454焦磷酸測(cè)序具有高通量、快速、準(zhǔn)確和靈敏度高等特點(diǎn)，已被應(yīng)用于多種微生物種類的分析，如Hunt等[2]用該方法證明母乳中存在沙雷氏菌屬、羅爾斯通菌屬和鞘氨醇單胞菌屬。

3.2.2定量即時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

由于qRT-PCR需要依賴標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)定量，而且會(huì)造成較低豐度的DNA定量的不精準(zhǔn)，Qian等[24]比較了用數(shù)字微滴式(droplet digital)PCR和qRT-PCR檢測(cè)中國(guó)人乳中的乳酸菌和雙歧桿菌，發(fā)現(xiàn)不需要校準(zhǔn)曲線的數(shù)字微滴式PCR的檢出限比另一種方法提升了十多倍，且兩種技術(shù)的檢測(cè)結(jié)果有較好的相關(guān)性和一致性。

基因組學(xué)、環(huán)境基因組、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白組學(xué)、代謝組學(xué)等組學(xué)方法用于人乳和乳腺中微生物的研究也在進(jìn)行中，這些結(jié)果將有助于更好地了解人乳中存在的微生物種類和多樣性。這些不基于培養(yǎng)的、高通量分子手段的應(yīng)用，使人們得以探究之前并不廣為人知的人乳微生物組學(xué)[33]。隨著組學(xué)研究的不斷深入，未來(lái)將會(huì)有更多的組學(xué)技術(shù)被用來(lái)研究人乳微生物[11]。

4 展望

在母乳喂養(yǎng)兒的早期免疫系統(tǒng)啟動(dòng)和腸道成熟方面，母乳的細(xì)菌多樣性發(fā)揮了重要作用。目前的研究尚存在一定局限：人乳微生物研究多是橫斷面觀察研究，且基于16S rRNA擴(kuò)增測(cè)序，在測(cè)量較低生物量的樣品(如乳樣)時(shí)，易受試劑污染的影響，且不能鑒別細(xì)菌是否存活。建議未來(lái)重點(diǎn)研究人乳微生物菌群組成及與喂養(yǎng)兒健康狀況的關(guān)系，包括：①人乳中細(xì)菌的多樣性、活性與功能的鑒定；②不同泌乳期乳汁中細(xì)菌菌群豐度和多樣性的變化及影響因素；③微生物中其他成分，如母乳中病毒或真菌及其毒素的含量以及對(duì)喂養(yǎng)兒健康狀況的影響；④人乳微生物組成與母親和嬰兒免疫系統(tǒng)交互影響的評(píng)價(jià)，以及這些微生物如何影響喂養(yǎng)兒的健康狀況；⑤通過(guò)系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)方法和恰當(dāng)?shù)脑囼?yàn)?zāi)Ｐ?，研究人乳微生物的功能作用；⑥特殊醫(yī)學(xué)狀況下的母乳微生物組學(xué)，及捐贈(zèng)母乳對(duì)早產(chǎn)兒腸道菌群的影響仍待探尋。通過(guò)這些深入研究，可揭示在生命最初1 000天母親-微生物-嬰兒間的相互作用、人乳微生物群的功能以及對(duì)母嬰健康狀況的近期與遠(yuǎn)期效應(yīng)。