昌莉麗，裴淑麗，李華坤，孫朋，王海軍，王玉燕

(1. 徐州生物工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 徐州 221006；2. 河南農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院，河南 中牟 451450)

作為豬肉消費(fèi)大國，養(yǎng)豬業(yè)在我國發(fā)展迅速，規(guī)?；i場逐漸增多，同時也對豬場飼養(yǎng)管理和疾病防控提出更高要求。大腸桿菌作為繁殖和定居在腸道內(nèi)致病菌，很容易隨糞便排出體外污染環(huán)境。一旦環(huán)境改變，豬場飼養(yǎng)管理不當(dāng)，仔豬抵抗力下降就會引起仔豬腹瀉，造成大腸桿菌病在豬場流行。目前，對該病的防治臨床多采取疫苗預(yù)防和藥物治療，但在防治上還存在問題。一方面大腸桿菌血清型種類眾多，難以確定抗原的血清型，造成疫苗免疫的針對性差和有效保護(hù)不足；另一方面多重耐藥菌株的產(chǎn)生又使藥物療效大打折扣導(dǎo)致臨床不能有效防治。為了掌握本地區(qū)豬場大腸桿菌血清型分布和耐藥情況，2015年6月至2019年8月，對徐州周邊17個中小規(guī)模養(yǎng)豬場和屠宰場進(jìn)行病料采集和大腸桿菌分離鑒定，并進(jìn)行藥敏試驗(yàn)和血清型鑒定，為本地豬場大腸桿菌病防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料和樣本采集

采集病料和樣本共117份。分別來自銅山、邳州、蕭縣等17個豬場或屠宰場。2015年至2017年，主要采集具有臨床癥狀的病仔豬十二指腸和直腸糞便，2018年和2019年采集病豬直腸肛門處糞便，以及飼料和飲水樣本。

1.2 主要試劑

營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、LB肉湯培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基(即用型)、M-H瓊脂培養(yǎng)基(即用型)、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(即用型)均由杭州微生物試劑有限公司生產(chǎn)。大腸桿菌O抗原定型血清型購于天津生物芯片技術(shù)有限責(zé)任公司。藥敏紙片由BIO-KONT 溫州市康泰生物科技有限公司生產(chǎn)，藥敏質(zhì)控菌株大腸桿菌ATCC25922株，來自于河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院友情饋贈，本實(shí)驗(yàn)室保存。細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、2倍HStaq master mix、DL2000 Marker、DL5000 Marker、引物設(shè)計(jì)合成均由江蘇溥博生物科技有限公司合成。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物

昆明種小鼠240只，體重18～23 g，徐州醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.4 臨床菌株分離和初步鑒定

無菌分離病仔豬十二指腸腸道內(nèi)容物或直腸肛門糞便接種于LB肉湯培養(yǎng)基增菌培養(yǎng)，置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)16～18 h，劃線接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基(即用型)，37 ℃培養(yǎng)18 h，挑取粉紅色疑似菌落接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基培養(yǎng)18 h,再次劃線接種于尹紅美蘭培養(yǎng)基(即用型)37 ℃培養(yǎng)18 h，挑取黑色疑似菌落，分別接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基和營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(即用型)37 ℃培養(yǎng)18 h 后，置于4 ℃冰箱保存待用。菌液經(jīng)鑒定后作為臨床分離株制備甘油菌，-20 ℃保存?zhèn)溆谩Ｌ羧I養(yǎng)瓊脂平板單菌落涂布于載玻片，經(jīng)革蘭氏染色后，光學(xué)顯微鏡下鏡檢進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。

1.5 病原菌特異性PCR鑒定

取1 mL LB肉湯過夜震蕩培養(yǎng)的新鮮菌液，參照細(xì)菌基因組提取試劑盒的說明書方法，提取細(xì)菌基因組DNA,作為分離菌株P(guān)CR鑒定的DNA模板。參照文獻(xiàn)[1]設(shè)計(jì)引物，Ecoli-F:CGATTCTGAAAT-GGCAAAAG,Ecoli-R:CGTGATCAGCGGTGACTAT-GAC,由江蘇溥博公司科技有限公司合成。PCR反應(yīng)條件為94 ℃熱變性5 min,94 ℃解鏈30 s,52～60 ℃退火30 s,72 ℃延伸60 s,共進(jìn)行35個循環(huán)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，預(yù)期擴(kuò)增片段長度為750 bp。

1.6 病原菌O抗原血清型鑒定

將鑒定后的菌株接種于營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基37 ℃過夜培養(yǎng)，用0.5%石碳酸生理鹽水2 mL沖洗細(xì)菌菌落，收集密封在5 mL玻璃瓶內(nèi)并用生理鹽水稀釋至1×1010CFU/mL，121 ℃高壓滅菌2 h，作為待檢抗原備用。移液槍吸取O抗原單因子血清1滴到玻片上，再取1滴待檢抗原加入血清，立即混勻，靜置5 min后觀察結(jié)果，如果出現(xiàn)凝集則為陽性。以待測抗原和生理鹽水混合液作為空白對照，排除細(xì)菌自凝現(xiàn)象。

1.7 毒力試驗(yàn)

毒力試驗(yàn)參照文獻(xiàn)[2]。選取體重均勻，20 g左右健康小鼠，隨機(jī)分為80組，每組3只，從中分出1個對照組和2個試驗(yàn)組。取待檢菌株，接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，過夜培養(yǎng)18 h后，取菌液稀釋至1010CFU/mL作為待檢菌液，試驗(yàn)組小鼠腹腔接種待檢菌液0.3 mL/只，對照組腹腔接種同劑量滅菌肉湯，隔離飼養(yǎng)，觀察小鼠發(fā)病和致死情況，統(tǒng)計(jì)發(fā)病率和死亡率。以每組3只小鼠全部死亡判定為強(qiáng)毒力毒株，2只小鼠死亡判定為中等毒力毒株，1只小鼠死亡判定為低毒力毒株。無小鼠死亡判定為無毒力毒株。同時剖檢死亡小鼠，觀察病變并取病料接種麥康凱瓊脂培養(yǎng)基分離培養(yǎng)，染色鏡檢，鑒定大腸桿菌。

1.8 藥敏試驗(yàn)

采用K-B紙片法[3]，對臨床分離的有致病性大腸桿菌進(jìn)行耐藥性測定。結(jié)果判斷按照CLSI推薦的標(biāo)準(zhǔn)，以標(biāo)準(zhǔn)菌株大腸桿菌ATCC25922株為參照物，根據(jù)抑菌圈直徑(D)判斷結(jié)果。D>16 mm為敏感，D<10 mm為耐藥， 16 mm>D>10 mm為中介。

2 結(jié)果與分析

2.1 臨床菌株分離和初步鑒定

經(jīng)過初步分離培養(yǎng)和初步鑒定，117份樣本分離到大腸桿菌102株(表1)，所分離的大腸桿菌在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上長出紫紅色圓形菌落；在伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上長出黑色金屬光澤菌落；在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上長出灰白色半透明光滑的圓形菌落；營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基培養(yǎng)試管底部有白色沉淀，管口有菌環(huán)，菌液混濁。病原菌染色后鏡檢(圖1)，可發(fā)現(xiàn)兩端鈍圓，散在分布紅色短桿菌，說明分離菌株為革蘭陰性無芽孢桿菌。

表1 樣品來源及大腸桿菌分離率

2.2 病原菌特異性PCR鑒定

將所分離鏡檢后的臨床菌株進(jìn)行特異性PCR鑒定，均能擴(kuò)增到750 bp的目的條帶(圖2)。

1.大腸桿菌ATCC25922株； 2～9.臨床分離菌株；M.DNA分子量標(biāo)準(zhǔn) (DL2000)圖2 臨床分離菌株P(guān)CR鑒定

2.3 病原菌O抗原血清型鑒定

在分離的102株臨床大腸桿菌中，除21株未能鑒定出血清型、2株自凝外，余下79株均能發(fā)生凝集，可鑒定為O抗原，占檢測菌株的77.4%，分屬18 個血清型。其中O15、045、O78、O138 4種血清型分別占已定型血清的17.7%，11.4%，13.9%，12.6%，合計(jì)占已定型菌株的55.6%。由此說明，O15、O45、O78、O138為徐州周邊地區(qū)的優(yōu)勢血清型(見表2)。

2.4 毒力試驗(yàn)

小鼠經(jīng)攻毒后12 h相繼表現(xiàn)精神食欲不振，呼吸加快，拉稀、死亡，剖檢可見肝脾腫大、出血，涂片染色鏡檢可見兩端鈍圓、單個或散在的的革蘭陰性桿菌，劃線接種麥康凱培養(yǎng)基可見粉紅色圓形菌落。80組小鼠，對照組和2個試驗(yàn)組全部存活，余下77組均為致病菌株。其中25株菌接種后小鼠全部死亡，占31.6%，主要分布在O15(5株)、O25(1株)、O78(3株)、O44(2株)、O138(5株)、O126(1株)、O45(6株)、O141(2株)血清型，說明這些菌株具有很強(qiáng)的致病力。中等毒株 38株，占48.1%；弱菌株14株，占17.7%，說明這些臨床分離菌株具有不同程度的致病性，一旦條件具備就會引發(fā)疾病。

2.5 耐藥試驗(yàn)結(jié)果及多重耐藥率分析

采用K-B紙片法，量取不同藥物藥敏片抑菌圈直徑并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果顯示(表3)，2015至2019年間臨床分離保存有致病性的77株大腸桿菌，對20種藥物均有不同程度的耐藥性，其中耐藥率在50%以上的藥物多達(dá)17種，占到了臨床常用藥物的85%；其中阿莫西林、氨芐西林鈉、強(qiáng)力霉素、氟苯尼考、恩諾沙星、乳酸環(huán)丙沙星臨床耐藥尤其嚴(yán)重，高達(dá)80%以上；耐藥率比較低在50%以下的藥物僅有頭孢曲松、頭孢噻呋、氨曲南3種藥物。此外，所分離的77株致病性菌株均表現(xiàn)出了多重耐藥性，至少耐藥12種以上，其中12耐和13耐菌株所占比例最大，分別為25.9%和22.1%，耐藥譜型多達(dá)8種，常見耐藥譜為氨芐西林鈉-阿莫西林-強(qiáng)力霉素-氟苯尼考-阿奇霉素-鹽酸林可霉素-慶大霉素-新霉素-痢菌凈-復(fù)方新諾明-恩諾沙星-乳酸環(huán)丙沙星。

表3 2015年至2019年臨床分離菌株對20種藥物的耐藥率分析

3 討論

通過對徐州周邊豬場大腸桿菌進(jìn)行分離鑒定、血清型調(diào)查和耐藥檢測，發(fā)現(xiàn)徐州地區(qū)豬源大腸桿菌分離率高，血清型復(fù)雜，耐藥率高且具有多重耐藥性。在采集的117份樣本中，分離到102株大腸桿菌，檢出率高達(dá)87.2%，提示該病原在本地各豬場廣泛存在。對大腸桿菌的分離鑒定，本研究放棄傳統(tǒng)的生化鑒定，在選擇性培養(yǎng)基初篩、細(xì)菌形態(tài)觀察的基礎(chǔ)上，直接進(jìn)行大腸桿菌特異性PCR鑒定，快速準(zhǔn)確。PCR法可進(jìn)行大批量樣本檢測，適用于臨床疾病的流行病學(xué)調(diào)查；經(jīng)血清型和致病性檢測，檢出O抗原血清型大腸桿菌79株，分屬18 個血清型，檢出率77.4%，致病毒株達(dá)到97.4%，提示血清型眾多的O抗原菌株仍為臨床常見流行菌株，并且不同血清型菌株之間存在不同程度的毒力差異。已定型菌株中O15、O45、O78、O138為優(yōu)勢血清型占55.6%，其中O45、O15、O138 3種血清型致病力較強(qiáng)，占強(qiáng)毒株的64.0%，充分說明O抗原血清種類和致病性有一定聯(lián)系，這和文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)論一致[5-6]。 結(jié)合近年報(bào)道的相關(guān)血清型監(jiān)測結(jié)果，發(fā)現(xiàn)除O138血清型檢出率略高外，各地區(qū)檢測優(yōu)勢血清型均有不同[5-7]。提示在徐州地區(qū)可針對性地選擇與O15、O45、O78和O138 4種血清型相吻合疫苗預(yù)防接種，以提高豬免疫效果；耐藥檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，臨床菌株不僅耐藥嚴(yán)重還表現(xiàn)出多重耐藥性，這和很多文獻(xiàn)對豬源大腸桿菌耐藥性的報(bào)道一致[6-8]。說明菌株耐藥性增加是成為各大集約化豬場共同面臨的重要問題。本研究臨床菌株耐藥達(dá)12種以上，對阿莫西林、氨芐西林鈉、強(qiáng)力霉素、氟苯尼考、恩諾沙星、乳酸環(huán)丙沙星等臨床常用藥耐藥率高達(dá)80%以上，說明這些藥物在徐州地區(qū)臨床應(yīng)用泛濫，已不適合進(jìn)一步作為豬大腸桿菌病防治用藥，豬場應(yīng)引起重視并考慮選用相對敏感的頭孢曲松、頭孢噻呋、氨曲南、多黏菌素、卡那霉素等藥物。目前，豬場常用治療藥物，受成本、適口性、藥殘等因素限制，臨床可供選擇的藥物已經(jīng)有限，但日趨嚴(yán)重的耐藥性又進(jìn)一步導(dǎo)致臨床幾乎無藥可用。因此，克服耐藥性，開發(fā)新獸藥，尋找新的抗生素替代品，改進(jìn)用藥方式，都將是未來解決這一難題的重要途徑。

多年來，仔豬大腸桿菌病一直是困擾養(yǎng)豬業(yè)的一個難題，雖然臨床采取多種防治措施減少大腸桿菌病的發(fā)病率和死亡率，但至今未能完全杜絕。該病之所以難治，與菌株眾多血清型和日趨嚴(yán)重的耐藥性密切相關(guān)[10-11]，因此，菌株血清型和耐藥性的定期檢測對指導(dǎo)本地豬場大腸桿菌病的防治至關(guān)重要。