何博，王勤，歐云文

(1. 達(dá)州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，四川 達(dá)州 635001；2. 開江縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，四川 達(dá)州 636250；3. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所，家畜疫病病原生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730046)

豬圓環(huán)病毒(porcine circovirus，PCV)屬于圓環(huán)病毒科(Circoviridae)圓環(huán)病毒屬(Circovirus)。目前已知的PCV分為3種基因型，即PCV1、PCV2和PCV3。PCV1致病性弱，一般不引起細(xì)胞病變；PCV2在豬群中普遍存在，致病性較強(qiáng)；PCV3是一種新發(fā)現(xiàn)的豬圓環(huán)病毒，2016年在美國(guó)首次發(fā)現(xiàn)[1]。近年來我國(guó)的山東、湖北、廣西等多個(gè)省市豬群中也陸續(xù)檢測(cè)出PCV3[2-4]。研究表明，感染PCV3可能引起豬皮炎腎病綜合征、母豬繁殖障礙、多系統(tǒng)炎癥、仔豬先天性震顫等多種疫病，是當(dāng)前威脅養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展的一個(gè)潛在致病原[5-6]。PCV3基因組結(jié)構(gòu)與PCV2相似，為單鏈環(huán)狀DNA病毒，基因組全長(zhǎng)約為2 000 bp，主要有3個(gè)開放閱讀框(ORF1、ORF2和ORF3)，其中ORF1基因編碼含有296個(gè)氨基酸的復(fù)制酶(Rep蛋白)，ORF2基因編碼含有214個(gè)氨基酸的衣殼蛋白(Cap蛋白)，ORF3基因編碼含有230個(gè)氨基酸的蛋白(目前該蛋白功能未知)[7-8]。ORF2基因編碼的Cap蛋白是PCV-3的唯一結(jié)構(gòu)蛋白，存在病毒主要抗原決定簇，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，且PCV3與PCV1和PCV2ORF2基因不具有共同的線性抗原表位[9-10]。以O(shè)RF2基因編碼的Cap蛋白作為診斷抗原可實(shí)現(xiàn)PCV3與PCV1、PCV2特異性抗體的鑒別檢測(cè)。鑒于此，本研究進(jìn)行了PCV3ORF2基因的截短表達(dá)，并以重組蛋白為包被抗原，建立了檢測(cè)PCV3抗體的間接ELISA方法。同時(shí)將其初步應(yīng)用于四川地區(qū)豬場(chǎng)的臨床樣品檢測(cè)，旨在掌握PCV3在四川地區(qū)的陽性感染率，為PCV3的臨床鑒別診斷和血清學(xué)監(jiān)測(cè)提供了一種敏感性強(qiáng)、特異性高、適合大規(guī)模樣品檢測(cè)的方法。

1 材料與方法

1.1 病毒與抗體

PCV3陽性病料、PCV2、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬瘟病毒(CSFV)、豬細(xì)小病毒(PPV)、豬偽狂犬病毒(PRV)、乙型腦炎病毒(JEV)、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)和豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)等病毒陽性血清均由本校動(dòng)物傳染病實(shí)驗(yàn)室保存。PCV3陽性血清采集于臨床感染PCV3的發(fā)病豬血清，PCV3陰性血清采集于臨床未感染致病原、未吃初乳的新生仔豬血清。

1.2 試劑與試劑盒

原核表達(dá)載體pET-32a(+)、Premix Taq酶、BamHⅠ和HindⅢ內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、大腸桿菌DH5α和BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞、核酸提取試劑盒、膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；HRP標(biāo)記兔抗豬IgG購(gòu)自美國(guó)Solarbio公司；DAB與TMB底物顯色液均購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；Ni-NTA蛋白純化試劑盒購(gòu)自南京金斯瑞公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)

參照GenBank中PCV3基因組序列(GenBank登陸號(hào)為MF069115)設(shè)計(jì)1對(duì)擴(kuò)增引物，片段大小為348 bp并包含ORF2基因主要抗原表位，上游引物F：5′-ATAGGATCCTTCCGCATAAGG-3′；下游引物R：5′-ATTCAAGCTTCCAAGGAGACGACGAC-3′，引物序列中陰影部分分別為BamHⅠ和HindⅢ酶切位點(diǎn)序列。

1.4 ORF2基因PCR擴(kuò)增

利用核酸提取試劑盒提取PCV3陽性病料的核酸DNA，利用合成的引物進(jìn)行ORF2基因主要抗原區(qū)域的PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為：2×Premix Taq 25 μL、核酸DNA 5 μL、上游引物F 0.5 μL、下游引物R 0.5 μL、水18 μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。

1.5 pET-32a-ORF2載體的構(gòu)建與鑒定

利用BamHⅠ和HindⅢ，分別對(duì)ORF2基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與原核表達(dá)載體pET-32a進(jìn)行雙酶切。酶切產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒回收純化后，利用T4 DNA連接酶于4 ℃過夜連接，次日轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞。質(zhì)粒提取試劑盒提取重組質(zhì)粒，經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定正確后命名為pET-32a-ORF2，并送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序分析，驗(yàn)證閱讀框架是否正確。

1.6 重組蛋白的表達(dá)與純化

將測(cè)序分析正確的重組質(zhì)粒pET-32a-ORF2轉(zhuǎn)入BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，利用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。將表達(dá)菌體利用超聲波裂解，離心裂解產(chǎn)物，12 000 r/min離心10 min。分別采集離心后的上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE，鑒定重組蛋白的表達(dá)形式。對(duì)以包涵體形式表達(dá)的重組蛋白，利用Ni-NTA蛋白純化試劑盒對(duì)重組蛋白進(jìn)行純化，純化蛋白經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)純化效果。

1.7 重組蛋白的Western blot鑒定

重組蛋白和pET-32a空載體蛋白經(jīng)SDS-PAGE后轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜，將硝酸纖維素膜用5%脫脂奶粉封閉2 h。洗滌后加入40倍稀釋的PCV3陽性血清，37 ℃感作45 min，洗滌后加入3 000倍稀釋的HRP標(biāo)記兔抗豬IgG，37 ℃感作30 min，洗滌后加入DAB顯色液感作5 min。

1.8 間接ELISA檢測(cè)方法的建立

1.8.1 間接ELISA操作方法

將重組蛋白適當(dāng)稀釋后，4 ℃過夜包被ELISA反應(yīng)板，洗滌后加入適當(dāng)稀釋的血清樣品(一抗)，37 ℃感作適當(dāng)時(shí)間，洗滌后加入適當(dāng)稀釋的HRP標(biāo)記兔抗豬IgG(二抗)，37 ℃感作適當(dāng)時(shí)間，洗滌后加入TMB底物顯色液，37 ℃感作適當(dāng)時(shí)間，2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)，在波長(zhǎng)450 nm處測(cè)定OD值。

1.8.2 間接ELISA最佳反應(yīng)條件的確定

抗原最佳包被量和一抗最佳稀釋度的確定：將重組蛋白稀釋至終濃度分別為0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、10 μg/mL，將一抗分別進(jìn)行1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320倍稀釋，采用方陣滴定法確定抗原的最佳包被量和一抗最佳稀釋度。

最佳封閉液和最佳封閉時(shí)間的確定：分別選擇5%脫脂奶粉、10%脫脂奶粉、1% BSA、3% BSA作為封閉液，封閉液作用時(shí)間分別為30、60、90 min，采用方陣滴定法確定最佳封閉液和最佳封閉時(shí)間。

二抗最佳稀釋度和最佳作用時(shí)間的確定：將HRP標(biāo)記兔抗豬IgG分別進(jìn)行1∶3 000、1∶4 000、1∶5 000倍稀釋，HRP標(biāo)記兔抗豬IgG作用時(shí)間分別為30、60、90 min，采用方陣滴定法確定二抗最佳稀釋度和最佳作用時(shí)間。

一抗最佳作用時(shí)間的確定：在相同試驗(yàn)條件下，將一抗分別作用30、60、90 min，根據(jù)陽性血清和陰性血清比值(P/N值)，確定一抗最佳作用時(shí)間。

底物最佳作用時(shí)間的確定：在相同試驗(yàn)條件下，將TMB底物分別作用5、10、15 min，根據(jù)陽性血清和陰性血清比值(P/N值)，確定底物最佳作用時(shí)間。

1.8.3 間接ELISA臨界值的確定

1.9 間接ELISA敏感性試驗(yàn)

將PCV3陽性血清分別進(jìn)行1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320、1∶640、1∶1 280、1∶2 560、1∶5 120、1∶10 240、1∶20 480、1∶40 960倍系列稀釋，以各稀釋度作為一抗進(jìn)行ELISA檢測(cè)，確定對(duì)PCV3陽性血清的最低檢出效價(jià)。

1.10 間接ELISA特異性試驗(yàn)

分別選取已知的PCV3陽性血清和陰性血清、PCV2、PRRSV、CSFV、PPV、PRV、JEV、PEDV和TGEV等病毒陽性血清，利用間接ELISA方法依次進(jìn)行檢測(cè)，確定方法的特異性。

1.11 間接ELISA重復(fù)性試驗(yàn)

批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)：用同一批次制備的純化蛋白包被ELISA板，分別在4個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)6份PCV3抗體水平不同的血清樣品進(jìn)行檢測(cè)，統(tǒng)計(jì)檢測(cè)結(jié)果并計(jì)算變異系數(shù)，確定間接ELISA方法的批內(nèi)重復(fù)性。

批間重復(fù)性試驗(yàn)：用不同批次制備的4批純化抗原分別包被ELISA反應(yīng)板，并分別在4個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)6份PCV3抗體水平不同的血清樣品進(jìn)行檢測(cè)，統(tǒng)計(jì)檢測(cè)結(jié)果并計(jì)算變異系數(shù)，確定間接ELISA方法的批間重復(fù)性。。

1.12 間接ELISA臨床樣品檢測(cè)試驗(yàn)

2018年至2019年，在四川地區(qū)的32個(gè)豬場(chǎng)采集了533份不同飼養(yǎng)階段和用途的臨床豬血清樣品。應(yīng)用間接ELISA方法進(jìn)行檢測(cè)，評(píng)估當(dāng)前四川地區(qū)的PCV3感染情況，確定間接ELISA方法的臨床適用性。

2 結(jié)果與分析

2.1 ORF2基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

如圖1所示，利用合成的針對(duì)ORF2基因引物，可以對(duì)PCV3陽性病料核酸DNA擴(kuò)增出1條特異性條帶，大小為348 bp，與試驗(yàn)預(yù)期的擴(kuò)增片段大小相符。

M. DL 2000 DNA Marker；1. PCV3陽性病料；2. 水對(duì)照?qǐng)D1 PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2 pET-32a-ORF2載體的構(gòu)建與鑒定結(jié)果

如圖2所示，pET-32a-ORF2重組質(zhì)粒通過BamHⅠ和HindⅢ雙酶切后，可分別獲得2條特異性條帶，大小約為5 900 bp和348 bp。對(duì)該重組質(zhì)粒的測(cè)序結(jié)果表明，其閱讀框架完全正確。

M. DL 15000 DNA Marker；1. 重組質(zhì)粒的BamHⅠ/HindⅢ雙酶切產(chǎn)物圖2 重組質(zhì)粒雙酶切鑒定結(jié)果

2.3 重組蛋白的表達(dá)與純化

如圖3所示，重組質(zhì)粒pET-32a-ORF2轉(zhuǎn)入BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞后，利用IPTG誘導(dǎo)獲得了以非可溶蛋白形式大量表達(dá)的重組蛋白，并經(jīng)Ni-NTA蛋白純化試劑盒純化后獲得了高純度的純化蛋白。

M. 蛋白Marker；1. pET-32a-ORF2未誘導(dǎo)菌；2. pET-32a載體誘導(dǎo)菌；3. pET-32a-ORF2誘導(dǎo)菌；4. 上清；5. 沉淀；6. 純化后蛋白圖3 重組蛋白表達(dá)與純化的SDS-PAGE

2.4 重組蛋白的Western blot鑒定

如圖4所示，重組蛋白可與PCV3陽性血清發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)，說明重組蛋白具有良好的反應(yīng)原性。

M. 預(yù)染蛋白Marker；1. 純化蛋白與PCV3陽性血清反應(yīng)；2. pET-32a載體誘導(dǎo)菌與PCV3陽性血清反應(yīng)圖4 Western blot鑒定結(jié)果

2.5 間接ELISA最佳反應(yīng)條件的確定

2.5.1 抗原最佳包被量和一抗最佳稀釋度的確定

當(dāng)抗原包被量為0.8 μg/mL，一抗稀釋度為1∶40時(shí)，P/N值最大，且陽性血清OD450值接近1.0。經(jīng)方陣滴定法確定抗原的最佳包被量為0.8 μg/mL，一抗最佳稀釋度為1∶40。

2.5.2 最佳封閉液和最佳封閉時(shí)間的確定

當(dāng)封閉液為1% BSA和封閉時(shí)間為60 min時(shí)，P/N值最大，且陽性血清OD450值接近1.0。經(jīng)方陣滴定法確定最佳封閉液為1% BSA，最佳封閉時(shí)間為60 min。

2.5.3 二抗最佳稀釋度和最佳作用時(shí)間的確定

當(dāng)HRP標(biāo)記兔抗豬IgG稀釋倍數(shù)為1∶4 000，作用時(shí)間為30 min時(shí)，P/N值最大，且陽性血清OD450值接近1.0。經(jīng)方陣滴定法確定二抗最佳稀釋度為1∶4 000，二抗最佳作用時(shí)間為30 min。

2.5.4 一抗最佳作用時(shí)間的確定

在相同試驗(yàn)條件下，當(dāng)一抗作用60 min時(shí)，P/N值最大，且陽性血清OD450值接近1.0，故確定一抗最佳作用時(shí)間為60 min。

2.5.5 底物最佳作用時(shí)間的確定

在相同試驗(yàn)條件下，當(dāng)TMB底物作用10 min，P/N值最大，且陽性血清OD450值接近1.0，故確定底物最佳作用時(shí)間為10 min。

2.6 間接ELISA臨界值的確定

2.7 間接ELISA敏感性試驗(yàn)

如表1所示，當(dāng)PCV3陽性血清進(jìn)行1∶20 480倍稀釋時(shí)，間接ELISA檢測(cè)其OD450值為0.356，呈陽性反應(yīng)。間接ELISA對(duì)PCV3陽性血清的最低檢出效價(jià)可達(dá)1∶20 480。

表1 間接ELISA敏感性試驗(yàn)結(jié)果

2.8 間接ELISA特異性試驗(yàn)

如表2所示，間接ELISA檢測(cè)PCV3陽性血清為陽性，而檢測(cè)PCV2、PRRSV、CSFV、PPV、PRV、JEV、PEDV和TGEV等病原的陽性血清均為陰性?？梢姡g接ELISA方法具有很好的特異性。

表2 間接ELISA特異性試驗(yàn)結(jié)果

2.9 間接ELISA重復(fù)性試驗(yàn)

2.9.1 批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)

6份血清樣品經(jīng)過同一批次純化蛋白，在4個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)，變異系數(shù)最低為2.52%，最高為3.75%，見表3。試驗(yàn)結(jié)果說明，間接ELISA方法具有良好的批內(nèi)重復(fù)性。

表3 批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.9.2 批間重復(fù)性試驗(yàn)

6份血清樣品經(jīng)過4批次純化蛋白，在4個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，變異系數(shù)最低為3.52%，最高為4.18%，見表4。試驗(yàn)結(jié)果說明，間接ELISA方法具有良好的批間重復(fù)性。

表4 批間重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.10 間接ELISA臨床樣品檢測(cè)試驗(yàn)結(jié)果

應(yīng)用間接ELISA方法對(duì)533份臨床豬血清樣品進(jìn)行PCV3抗體檢測(cè)，共檢測(cè)出PCV3抗體陽性的樣品79份，PCV3陽性感染率達(dá)14.82%，其中種豬、仔豬、育肥豬的陽性感染率分別為29.22%、8.11%、9.79%，見表5。表明當(dāng)前四川地區(qū)存在一定程度的PCV3感染，尤其是種豬中PCV3的感染情況較嚴(yán)重。

表5 臨床檢測(cè)結(jié)果

3 討論

目前針對(duì)PCV3的研究處于起步階段，尚無病毒成功分離報(bào)道，加強(qiáng)對(duì)PCV3感染的診斷和流行病學(xué)監(jiān)測(cè)對(duì)其綜合防控至關(guān)重要。由于PCV3與PCV2引起的臨床癥狀極其相似，故對(duì)于PCV3的診斷應(yīng)依靠實(shí)驗(yàn)室鑒別診斷方法。當(dāng)前，對(duì)于PCV3的實(shí)驗(yàn)室鑒別診斷方法主要有分子生物學(xué)診斷方法和血清學(xué)診斷方法，其中PCR[11]、套式PCR[12]、熒光定量PCR[13]、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)等分子生物學(xué)方法能夠檢測(cè)到PCV3特定的核苷酸序列，具有敏感性高、特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確性好等特點(diǎn)，在豬場(chǎng)進(jìn)行PCV3和PCV2感染的臨床鑒別診斷中得到了廣泛應(yīng)用，并取得了良好的應(yīng)用效果[14]。但分子生物學(xué)方法檢測(cè)成本高，檢測(cè)一次的數(shù)量有限，僅適合發(fā)病豬場(chǎng)的實(shí)驗(yàn)室確診，不適合大批量樣品或大面積范圍的流行病學(xué)監(jiān)測(cè)。而ELISA等血清學(xué)診斷方法操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)周期短、檢測(cè)成本低、通量高，特別適合大批量樣品或大面積范圍的血清學(xué)監(jiān)測(cè)。由于PCV3的全病毒抗原制備過程繁瑣，且存在非常高的生物安全危險(xiǎn)性，故利用基因工程技術(shù)體外制備人工抗原成為研究的熱點(diǎn)，為新型血清學(xué)診斷試劑的研發(fā)提供了方向。在體外制備人工抗原中，表達(dá)系統(tǒng)的合理選擇至關(guān)重要，由于原核表達(dá)系統(tǒng)具有成本低、試驗(yàn)周期短、表達(dá)量大、重組蛋白易于純化等優(yōu)勢(shì)，其一直是異源蛋白體外表達(dá)的首選系統(tǒng)。本研究選擇大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)，對(duì)PCV3中OPR2基因編碼的Cap蛋白，也是PCV3的唯一衣殼蛋白進(jìn)行了體外表達(dá)，后續(xù)試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，截短表達(dá)的Cap蛋白表達(dá)量較大，易于純化，且具有良好的反應(yīng)活性，以其作為包被抗原建立的間接ELISA檢測(cè)方法，對(duì)PCV3陽性血清的最低檢出效價(jià)可達(dá)1∶20 480，檢測(cè)PCV2、PRRSV、CSFV、PPV、PRV、JEV、PEDV、TGEV等8種豬病病毒陽性血清均為陰性，批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗(yàn)的變異系數(shù)均小于5%，顯示出了良好的敏感性、特異性和重復(fù)性。

鑒于過去PCV2對(duì)我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成的巨大危害，PCV3一開始流行就引起了我國(guó)研究者的高度重視。為確定PCV3在我國(guó)不同地區(qū)的感染情況，近年來研究人員陸續(xù)對(duì)國(guó)內(nèi)不同地區(qū)PCV3感染情況進(jìn)行了流行病學(xué)監(jiān)測(cè)。何長(zhǎng)生等[15]采用熒光定量PCR方法對(duì)采集于安徽省3個(gè)地區(qū)12個(gè)豬場(chǎng)的239份樣品進(jìn)行了PCV3檢測(cè)，PCV3陽性感染率為14.6%；趙宇等[16]采用PCR方法對(duì)河南不同地區(qū)豬場(chǎng)的152份臨床樣品進(jìn)行PCV3檢測(cè)，PCV3陽性感染率為30.26%；劉相聰?shù)萚17]利用PCR技術(shù)對(duì)廣東、廣西、海南、福建、江西、湖南177家規(guī)?；i場(chǎng)的1 078份樣品進(jìn)行檢測(cè)PCV3陽性感染率為29.04%。本研究利用間接ELISA方法，對(duì)2018至2019年四川地區(qū)32個(gè)豬場(chǎng)采集的533份臨床豬血清樣品進(jìn)行PCV3抗體檢測(cè)，共檢測(cè)出PCV3抗體陽性樣品79份，PCV3陽性感染率達(dá)14.82%，顯著低于趙宇等[16]、劉相聰?shù)萚17]的檢測(cè)結(jié)果，與何長(zhǎng)生等[15]的檢測(cè)結(jié)果基本相同，表明當(dāng)前四川地區(qū)存在一定的PCV3感染，但相對(duì)于國(guó)內(nèi)其他地區(qū)仍然較低，這與四川省多年來一直重視加強(qiáng)生物安全防控措施密不可分。鑒于PCV3的流行態(tài)勢(shì)，進(jìn)一步加強(qiáng)對(duì)PCV3感染的綜合防控仍刻不容緩。何長(zhǎng)生等[15]研究表明，保育豬、育肥豬、后備母豬、能繁母豬、種公豬PCV3陽性感染率分別為0%、2.9%、44.4%、51.9%和25.0%。本研究中發(fā)現(xiàn)種豬、仔豬、育肥豬的陽性感染率分別為29.22%、8.11%、9.79%，該結(jié)果與何長(zhǎng)生等[15]的調(diào)查結(jié)果基本一致。上述研究結(jié)果說明，不同豬群均存在PCV3感染，以種豬最易感，該情況需引起足夠重視，對(duì)于PCV3的防控應(yīng)重點(diǎn)加強(qiáng)對(duì)種豬的控制。

綜上，本研究利用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)截短表達(dá)的OPR2基因主要抗原區(qū)域，具有良好的反應(yīng)活性，以其作為包被抗原建立的間接ELISA檢測(cè)方法具有良好的敏感性、特異性、重復(fù)性和臨床適用性，顯示出了良好的臨床應(yīng)用前景。