鄭屠園，李婭慧，周繼勇，胡伯里*

(1. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210095；2.浙江大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)系，農(nóng)業(yè)部動(dòng)物病毒學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310058)

血凝素(hemagglutinin, HA)是A型流感病毒(influenza A virus, IAV)的囊膜蛋白，是引發(fā)機(jī)體感染的重要蛋白之一，對病毒的致病性以及毒力至關(guān)重要。此外，HA在病毒感染過程中也發(fā)揮著重要作用：IAV通過HA識(shí)別在宿主細(xì)胞表面受體，進(jìn)而吸附在宿主細(xì)胞上；還可以介導(dǎo)病毒囊膜與宿主細(xì)胞膜的融合，促進(jìn)病毒入胞，完成感染[1]?，F(xiàn)如今，共發(fā)現(xiàn)了18個(gè)HA亞型，其中H1～H16在水禽中流行，H17和H18是從蝙蝠中分離出來的[2]。幾乎所有的蛋白質(zhì)都是在細(xì)胞質(zhì)中合成的，信號(hào)肽(signal peptide, SP)是位于新合成蛋白質(zhì)N端的一段的序列[3]，可以指導(dǎo)蛋白質(zhì)在胞質(zhì)的正確轉(zhuǎn)移。在信號(hào)肽的引導(dǎo)下，新生蛋白質(zhì)向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)移，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)進(jìn)入合適的位置后，信號(hào)肽序列被切除[4]。然后蛋白質(zhì)被接著加工轉(zhuǎn)移，最終到達(dá)合適的場所發(fā)揮功能。

HA是一個(gè)跨膜蛋白，在其N端含有信號(hào)肽序列[5-6]。本研究在含F(xiàn)lag標(biāo)簽真核載體N端和C端分別引入H1N1分離株(A/Puerto Rico/8/34)的 HA 序列，構(gòu)建帶有HA信號(hào)肽序列的SP-HA-Flag載體和缺失信號(hào)肽序列的 Flag-HA載體，并利用Western blot和間接免疫熒光檢測H1N1的HA重組蛋白的表達(dá)情況，進(jìn)而分析信號(hào)肽的有無對HA表達(dá)的影響，期望為HA蛋白功能的深入研究提供一定的基礎(chǔ)信息。

1 材料與方法

1.1 菌株、載體及細(xì)胞

大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞和293T細(xì)胞來自本實(shí)驗(yàn)室保存細(xì)胞。A型流感病毒H1N1 (A/Puerto Rico/8/34)株為本實(shí)驗(yàn)室保存材料，通過7～9日齡雞胚擴(kuò)毒，病毒的毒價(jià)為2.0×107TCID50/mL。

1.2 主要試劑

DL5 000 DNA Marker(TaKaRa公司),Flag鼠單抗(Sigma公司),辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG二抗、FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG熒光二抗(Kirkegaard & Perry Laboratories公司),基因擴(kuò)增高保真酶Phanta Super-Fidelity DNA Polymerase試劑盒和T4 DNA連接酶(南京諾威贊生物科技有限公司)，質(zhì)粒小提試劑盒(天根生物公司)；其他常用試劑為國產(chǎn)分析純。

1.3 HA基因的擴(kuò)增

根據(jù)GenBank中A/Puerto Rico/8/1934 (H1N1)的HA基因(NC_002017.1)的序列設(shè)計(jì)特異性引物，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

表1 擴(kuò)增目的基因的PCR引物

1.4 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

PCR擴(kuò)增目的基因后，進(jìn)行清潔回收?；厥债a(chǎn)物進(jìn)行雙酶切，酶切體系為：質(zhì)粒或目的片段2 μg、限制性內(nèi)切酶各2 μL、10 × Cutsmart buffer 10 μL、ddH2O補(bǔ)至100 μL。37 ℃酶切2 h，回收酶切產(chǎn)物，然后利用T4 DNA 連接酶連接。16 ℃連接過夜，取連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，在含有抗性的LB固體平板上37 ℃過夜培養(yǎng)。挑取單克隆菌落進(jìn)行菌液PCR鑒定，選取1～3個(gè)陽性克隆，送南京通用生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。將測序比對正確的菌株進(jìn)行保種以備后續(xù)試驗(yàn)使用。

1.5 Western blot 檢測HA蛋白表達(dá)

293T細(xì)胞接種至六孔板中，待其貼壁長至密度為50%～60%時(shí)，利用Exfect 2000轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染相應(yīng)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染后6～10 h更換培養(yǎng)液為含2% 血清的DMEM，繼續(xù)培養(yǎng)至24 h。收集細(xì)胞沉淀制樣，進(jìn)行SDS-PAGE后，轉(zhuǎn)印至NC膜，于5% 脫脂奶中室溫封閉2 h，用PBST洗膜3次，洗膜完成后根據(jù)蛋白Marker大小，剪取所需蛋白大小的膜至稀釋好的Flag鼠單抗中，4 ℃孵育過夜。撈取膜用PBST清洗5次后置于5% 脫脂奶稀釋的HRP-YKS二抗中于37 ℃孵育1 h，再次用PBST清洗5次。利用ECL 化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒進(jìn)行化學(xué)發(fā)光顯色，檢測蛋白表達(dá)情況。

1.6 間接免疫熒光檢測HA在細(xì)胞內(nèi)的定位

293T細(xì)胞接種至共聚焦小皿中，待其貼壁長至密度為50%～60%時(shí)，利用Exfect 2000轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染后6～10 h更換培養(yǎng)液為含2%血清的DMEM，繼續(xù)培養(yǎng)至24 h。除去上清液，加入1 mL 4% 的多聚甲醛固定液，室溫固定15 min。棄去固定液后，用含5% 脫脂奶的PBS溶液于37 ℃ 封閉30 min。加入5% 脫脂奶稀釋的一抗，于37 ℃ 結(jié)合2～4 h。PBS清洗細(xì)胞3～5次，再加入5% 脫脂奶稀釋的二抗，于37 ℃ 結(jié)合1 h。PBS清洗細(xì)胞3～5次，用PBS稀釋DAPI，于室溫孵育細(xì)胞10 min。最后觀察蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位。

2 結(jié)果

2.1 HA基因擴(kuò)增及質(zhì)粒的構(gòu)建

信號(hào)肽引導(dǎo)蛋白進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)加工后會(huì)被切除，為了避免因信號(hào)肽切除而丟失檢測標(biāo)簽，將標(biāo)簽蛋白置于HA基因蛋白的C端，成功構(gòu)建了含有信號(hào)肽的SP-HA-Flag載體，菌液PCR鑒定結(jié)果如圖1A所示。接著又構(gòu)建了不含有信號(hào)肽序列的Flag-HA載體，菌液PCR鑒定結(jié)果如圖1B所示。菌液PCR所得條帶均與陽性對照條帶的分子量大小相符。

M. DNA Marker (DL5000);1～8. PCR產(chǎn)物;-. 陰性對照;+. 陽性對照圖1 重組載體菌液PCR鑒定結(jié)果

2.2 信號(hào)肽對HA蛋白表達(dá)的影響

獲得測序正確且含有信號(hào)肽的SP-HA-Flag質(zhì)粒和不含信號(hào)肽的Flag-HA質(zhì)粒后，將其轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞24 h。收取細(xì)胞樣品，利用Western blot分別檢測蛋白表達(dá)情況，結(jié)果如圖2A、圖2B所示，蛋白大小存在明顯差異，并且含有信號(hào)肽的HA蛋白表達(dá)量低于不含信號(hào)肽的HA蛋白表達(dá)量。

M．未預(yù)染的蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1. HA蛋白圖2 Western blot鑒定重組蛋白表達(dá)情況

2.3 信號(hào)肽對HA蛋白在細(xì)胞內(nèi)定位的影響

為了研究信號(hào)肽對HA蛋白定位的影響，進(jìn)行了間接免疫熒光試驗(yàn)，檢測HA在細(xì)胞內(nèi)的定位情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，含有信號(hào)肽序列的HA蛋白主要集中在胞膜位置(圖3A)，而不含信號(hào)肽的HA蛋白主要分布在細(xì)胞質(zhì)中(圖3B)。此外，與圖2結(jié)果一致的是含有信號(hào)肽的SP-HA-Flag蛋白表達(dá)量低于不含信號(hào)肽的Flag-HA蛋白表達(dá)量。

A．SP-HA-Flag；B．Flag-HA圖3 熒光顯微鏡檢測重組蛋白定位情況

3 討論

流感病毒是造成養(yǎng)禽業(yè)重大損失的主要病毒之一，如果防控不當(dāng)就會(huì)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。HA是流感病毒不可或缺的功能性蛋白，病毒通過HA結(jié)合宿主受體進(jìn)入細(xì)胞，參與病毒感染過程。Flag標(biāo)簽通常不會(huì)影響目的蛋白的功能[7]，本文成功構(gòu)建含有Flag標(biāo)簽的HA蛋白，這有助于對HA蛋白進(jìn)行更好的分析。因此，成功構(gòu)建的重組載體可以用來進(jìn)行免疫共沉淀及間接免疫熒光試驗(yàn)，檢測外源性表達(dá)的病毒蛋白，節(jié)省病毒蛋白抗體的經(jīng)費(fèi)支出。信號(hào)肽位于新生多肽鏈的N-末端，介導(dǎo)蛋白質(zhì)向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)移。信號(hào)肽在序列和長度上各有不同，通常為含有特征性結(jié)構(gòu)的16至30個(gè)氨基酸殘基(N端帶正電荷，具有親水性；中間部分包含數(shù)個(gè)疏水殘基；C端具有信號(hào)肽酶切割位點(diǎn))[8]。除了可以將蛋白質(zhì)靶向轉(zhuǎn)運(yùn)至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜，信號(hào)肽還可以調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的分泌效率。盡管已有許多關(guān)于信號(hào)肽控制蛋白的膜定位的研究，但是還沒有信號(hào)肽對于流感病毒HA蛋白的具體表達(dá)定位的分析。

本研究中將H1N1的HA蛋白分別引入pCMV-Flag-N及pCMV-Flag-C載體中，其中前者將Flag標(biāo)簽連接到去除信號(hào)肽的HA的氨基端，而后者將Flag標(biāo)簽連接到未去除信號(hào)肽的HA蛋白的羧基端，意在探討信號(hào)肽對HA蛋白在細(xì)胞中表達(dá)的影響。雖然信號(hào)肽在引導(dǎo)蛋白到達(dá)細(xì)胞內(nèi)合適的位置后會(huì)被切除，Western blot結(jié)果仍能檢測到部分含有信號(hào)肽的蛋白，并且大小明顯大于不含信號(hào)肽的蛋白，表明信號(hào)肽在指導(dǎo)HA蛋白合成以及定位后，未發(fā)生完全剪切。這可能是由于細(xì)胞內(nèi)的剪切酶活力不足以應(yīng)對快速合成的新蛋白，這種不完全剪切在外源性表達(dá)酵母基因工程產(chǎn)物的過程中也會(huì)出現(xiàn)[9]。但引起不完全剪切的具體原因，還需要更多的試驗(yàn)予以探明。熒光顯微鏡檢查結(jié)果顯示，HA蛋白的信號(hào)肽序列會(huì)影響HA蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位，其中，含有信號(hào)肽的HA主要定位在胞膜上，而不含信號(hào)肽的HA主要定位在胞質(zhì)中。此外，有數(shù)據(jù)表明信號(hào)肽的有無會(huì)影響蛋白的表達(dá)及分泌情況[10]。本試驗(yàn)Western blot 和間接免疫熒光結(jié)果都發(fā)現(xiàn)，檢測到的含有信號(hào)肽的HA蛋白表達(dá)量比不含信號(hào)肽的HA蛋白表達(dá)量少，表明信號(hào)肽的存在會(huì)減少HA蛋白的表達(dá)量，這與蘇艷等[11]的報(bào)道是一致的。因此在試驗(yàn)過程中可以利用信號(hào)肽來控制外源性蛋白的表達(dá)，但引起蛋白減少的具體原因還有待研究。

有研究顯示，HA信號(hào)肽序列部分氨基酸的缺失將會(huì)影響HA蛋白糖基化、成熟以及紅細(xì)胞凝集的功能[12]，而在本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)信號(hào)肽會(huì)影響HA蛋白的表達(dá)及定位，因此在抗病毒藥物的研究中可以通過干擾信號(hào)肽序列影響HA蛋白的功能, 進(jìn)而影響子代病毒的產(chǎn)生及傳播?？傊诒疚闹邪l(fā)現(xiàn)信號(hào)肽會(huì)影響HA蛋白的表達(dá)及定位，這為進(jìn)一步對HA蛋白進(jìn)行生物學(xué)分析奠定了基礎(chǔ)。