唐塔婭，佘銳萍，劉天龍，田紀(jì)景

（中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)，北京 100193）

戊型肝炎（hepatitis，HE）是由戊型肝炎病毒（Hepatitis E virus，HEV）引起的一種急性自限性疾病。研究發(fā)現(xiàn)HEV主要有4種傳播途徑，分別為糞口傳播、食源性傳播、血液和垂直傳播，其中主要以糞口途徑為主。在近幾十年里，戊型肝炎在亞洲和非洲一些發(fā)展中國(guó)家呈大規(guī)模暴發(fā)性流行，并且在歐洲及美國(guó)等發(fā)達(dá)國(guó)家也發(fā)現(xiàn)了散發(fā)病例[1]。目前戊型肝炎是世界衛(wèi)生組織認(rèn)定的一個(gè)重要公共衛(wèi)生疾病。在感染HEV人群中，大部分患者表現(xiàn)為亞臨床癥狀，少部分表現(xiàn)為急性自限性肝炎。據(jù)估計(jì)，每年可發(fā)生2000萬(wàn)例HEV感染，有臨床癥狀的HEV感染者超過330萬(wàn)，其中死亡44 000例[2]。人群感染后死亡率為0.5%～4.0%，孕婦的病死率則高達(dá)30%[3]。此外，因器官移植或免疫功能缺陷而感染HEV的人群，還可能轉(zhuǎn)化為慢性肝炎，并形成肝硬化[4]。

戊型肝炎在全球范圍內(nèi)造成了嚴(yán)重的危害，并逐漸引起研究人員的重視，越來(lái)越多的動(dòng)物種類被證實(shí)為HEV的宿主[5-6]。此外，國(guó)內(nèi)外多項(xiàng)研究表明，動(dòng)物糞便和肉制品中可以檢出HEV RNA，并且食用被糞便污染的水源和未經(jīng)充分烹飪的動(dòng)物肉制品是導(dǎo)致戊型肝炎發(fā)生的主要原因。截止到目前，已從家豬、野豬、兔、鼠、雞、鹿、雪豹等多種動(dòng)物體內(nèi)檢出HEV核酸。雖然在狗、貓、馬、羊等動(dòng)物體內(nèi)尚未檢出HEV核酸，但這些動(dòng)物的血清中HEV抗體陽(yáng)性率較高。下文就戊型肝炎實(shí)驗(yàn)感染動(dòng)物模型的研究進(jìn)展做一綜述。

1 非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物

近年來(lái)各國(guó)研究學(xué)者都在致力于建立HEV實(shí)驗(yàn)動(dòng)物感染模型。Balayan等[7]在1983年開創(chuàng)了戊型肝炎非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物模型的先例。此后國(guó)內(nèi)外學(xué)者又陸續(xù)建立了10余種HEV的非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物模型。黑猩猩被證實(shí)對(duì)HEV易感，并已用作動(dòng)物模型以表征HEV病毒學(xué)和免疫學(xué)方面的特征[8-10]，但是目前已不再適用于侵入性生物醫(yī)學(xué)研究。此外，獼猴被證實(shí)可用于模擬急性HEV感染。Li等[11]發(fā)現(xiàn)接種了1型HEV的獼猴，其血清和糞便中可檢出HEV RNA，并且HEV抗原檢測(cè)呈陽(yáng)性。Ji等[12]分別用豬HEV的a亞型和b亞型毒株感染獼猴，組織病理學(xué)檢查顯示獼猴的肝臟病變與人急性肝炎的病理學(xué)變化相似。黃芬等[13]在對(duì)中國(guó)云南獼猴的HEV血清流行病學(xué)和分子特征進(jìn)行分析后，發(fā)現(xiàn)獼猴可能不是HEV的天然儲(chǔ)庫(kù)。隨后Huang等[14]提出了一種HEV跨物種感染的新途徑，他們通過給恒河猴灌喂被4型HEV污染的牛奶，發(fā)現(xiàn)恒河猴發(fā)生急性戊肝感染，從而證實(shí)了牛奶作為感染途徑的可能性，并存在將HEV傳播給人類的風(fēng)險(xiǎn)。Liu等[15]用來(lái)自中國(guó)的兔源HEV成功感染了2只食蟹猴，食蟹猴表現(xiàn)出典型的肝炎癥狀，這一研究提示了人們兔作為戊型肝炎傳染源的可能性。Lanford等[10]在最新研究中證實(shí)了食蟹猴和恒河猴對(duì)1-4型HEV均易感，這兩種動(dòng)物模型可用于評(píng)估HEV備選疫苗的臨床反應(yīng)。截止至今，研究人員已證實(shí)了黑猩猩、獼猴、恒河猴、食蟹猴以及非洲綠猴等非人靈長(zhǎng)類對(duì)1-4型HEV的易感性。非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物在感染人源HEV后的臨床表現(xiàn)和病程轉(zhuǎn)歸與人急性肝炎的癥狀極為相似，是研究HEV致病性較為理想的動(dòng)物模型，但由于不是HEV的天然宿主，并且來(lái)源有限價(jià)格較昂貴，因此無(wú)法批量應(yīng)用，這些問題都導(dǎo)致非靈長(zhǎng)類動(dòng)物在科研中的應(yīng)用受到限制。

2 豬

1990年，Balayan等[16]用人源HEV經(jīng)口和靜脈途徑感染豬，結(jié)果表明豬對(duì)人源HEV具有易感性。Meng等[17]首次從豬體內(nèi)分離得到了1株豬HEV后，是首次報(bào)道的豬感染HEV的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了基因測(cè)序，對(duì)比結(jié)果提示豬源HEV與美國(guó)人源HEV有極高的同源性，豬源HEV還可以感染黑猩猩和恒河猴，這一研究結(jié)果暗示動(dòng)物作為戊型肝炎傳染源的可能性。Feagins等[18]將人源4型HEV衣殼基因克隆于豬源3型HEV主干中，制成基因嵌合HEV，成功感染了豬動(dòng)物模型，進(jìn)一步證實(shí)了3型和4型HEV的人畜共患性質(zhì)。Cossaboom等[19]用來(lái)自中、美兩國(guó)的兔源HEV毒株感染SPF豬，結(jié)果顯示感染了中、美兩國(guó)兔源HEV的豬中均出現(xiàn)糞便排毒，感染美國(guó)兔源HEV的豬還表現(xiàn)出一過性的病毒血癥，該現(xiàn)象表明豬對(duì)兔源HEV有一定易感性。Sanford等[20-21]將豬HEV、大鼠HEV和禽HEV的重組衣殼抗原接種到豬體內(nèi)，誘導(dǎo)HEV IgG的特異性應(yīng)答，研究發(fā)現(xiàn)該免疫應(yīng)答對(duì)3型HEV具有部分交叉保護(hù)作用。將豬用作HEV疫苗試驗(yàn)的動(dòng)物模型，并用于評(píng)估重組HEV抗原的交叉保護(hù)潛力，這對(duì)于開發(fā)針對(duì)3型和4型HEV的疫苗至關(guān)重要。

豬是HEV重要的儲(chǔ)存宿主和感染源之一，作為感染模型可用于研究HEV的病原分布，分子學(xué)特征、傳播及感染機(jī)制等，但豬只能感染基因3、4型HEV且無(wú)明顯的臨床表現(xiàn)[22]，不能復(fù)制人感染HEV的致病機(jī)制，還存在飼養(yǎng)處理不便等缺點(diǎn)，因此豬動(dòng)物模型在HEV研究中應(yīng)用受限。

3 嚙齒動(dòng)物

Johne等[23]在2009年首次從德國(guó)野生大鼠糞便中檢出了鼠源HEV。此后，研究人員在歐洲、亞洲和美國(guó)幾個(gè)國(guó)家的動(dòng)物體內(nèi)也檢測(cè)到了鼠源HEV[24]。Guan等[25]用含有鼠源HEV的組織勻漿靜脈接種大鼠，證實(shí)了鼠源HEV具有嗜肝性，但感染后的大鼠不表現(xiàn)明顯的臨床癥狀。這表明鼠HEV可以作為感染模型，但不適用于發(fā)病機(jī)制的研究。Hong等[26]用1型HEV感染蒙古沙鼠，沙鼠的肝臟、脾臟和腎臟內(nèi)顯示出組織病理學(xué)變化，在接種后7～42 d在糞便樣品中檢測(cè)到HEV RNA，ALT水平僅適度增加，但未檢測(cè)到HEV特異性抗體，因此還需要進(jìn)一步研究蒙古沙鼠是否真的對(duì)人類HEV感染敏感。Maneerat等[27]用含感染性HEV分離株TK-037/92的人體糞便懸浮液靜脈接種Wistar大鼠，結(jié)果證實(shí)HEV可以在Wistar大鼠中復(fù)制。Debing等[28]用鼠HEV株LA-B350感染無(wú)胸腺裸鼠，結(jié)果顯示無(wú)胸腺裸鼠對(duì)LA-B350易感，并與免疫功能低下的慢性戊型肝炎患者的情況相似。此外還發(fā)現(xiàn)利巴韋林能夠有效抑制無(wú)胸腺裸鼠中的LA-B350復(fù)制，這證實(shí)了大鼠模型對(duì)抗病毒研究的適用性。

筆者所在團(tuán)隊(duì)近年來(lái)在HEV長(zhǎng)爪沙鼠動(dòng)物模型方面進(jìn)行了系統(tǒng)的研究（表1）。毛晶晶等[29]用豬源HEV成功感染長(zhǎng)爪沙鼠，觀察結(jié)果表明HEV可損傷長(zhǎng)爪沙鼠的腸道結(jié)構(gòu)，同時(shí)能激發(fā)腸道的黏膜免疫功能。楊依霏等[30-31]用豬源HEV感染長(zhǎng)爪沙鼠，研究結(jié)果表明HEV可以誘導(dǎo)肝細(xì)胞線粒體凋亡途徑激活，這是HEV造成沙鼠肝臟結(jié)構(gòu)功能損傷的重要機(jī)制之一。Soomro等[32-33]研究了沙鼠通過腹腔注射感染豬源HEV后腎臟的損傷機(jī)制。研究結(jié)果表明，線粒體Caspase-3蛋白酶的激活可能誘導(dǎo)蒙古沙鼠HEV感染急性期后腎上皮細(xì)胞壞死和細(xì)胞死亡。隨后他們又檢測(cè)了豬源HEV對(duì)長(zhǎng)爪沙鼠睪丸組織結(jié)構(gòu)和分子變化的影響和作用，結(jié)果表明，HEV在睪丸組織中病毒蛋白產(chǎn)生結(jié)構(gòu)和分子變化，進(jìn)而破壞血睪屏障并誘導(dǎo)生殖細(xì)胞凋亡。石蕊寒等[34]也采用了已有的豬源HEV感染沙鼠模型，證實(shí)了HEV能夠在沙鼠腦和脊髓組織中進(jìn)行復(fù)制從而引發(fā)病理?yè)p傷。此外，劉天龍等[35]也用豬源HEV感染了本實(shí)驗(yàn)室建立的長(zhǎng)爪沙鼠HEV模型，研究結(jié)果表明，HEV感染能引起沙鼠機(jī)體抗氧化能力降低，肝臟糖代謝紊亂，并通過激活肝細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑引發(fā)肝細(xì)胞損傷。雖然嚙齒類動(dòng)物具有背景清晰、病死率低、重復(fù)性好、選模方法簡(jiǎn)便和繁殖力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，但鼠作為動(dòng)物模型感染后無(wú)明顯的臨床表現(xiàn)，且鼠源HEV的人畜共患潛力尚不清楚，因此還需要進(jìn)一步的深入研究。

表1 豬源HEV感染的沙鼠模型的系統(tǒng)研究Table 1 Systematic study of gerbil model of pig-derived HEV infection

4 兔

兔源HEV最早在中國(guó)兔群中被檢測(cè)到，基因測(cè)序結(jié)果顯示，兔源HEV與3型HEV最密切相關(guān)。隨后研究人員在美國(guó)、亞洲及歐洲部分國(guó)家的兔群中也陸續(xù)檢測(cè)到兔源HEV[36-39]。這些研究表明，兔是HEV的天然宿主之一。在2015至2016年期間，根據(jù)法國(guó)的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，在919名HEV感染患者中，有5名感染了與兔HEV密切相關(guān)的病毒，這表明兔HEV毒株可能傳染給人類并引起人畜共患感染[40]。兔是最常使用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物之一，兔源HEV的發(fā)現(xiàn)，揭示了兔作為感染模型的可能性。

Ma等[41]研究發(fā)現(xiàn)，兔在感染HEV毒株后可出現(xiàn)糞便排毒，體內(nèi)可檢測(cè)到HEV抗體，并且感染HEV時(shí)，血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）活性顯示升高，這表明兔發(fā)生急性肝損傷。Cheng等[42]在一項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)兔對(duì)1型HEV不易感，并且在接種了血清轉(zhuǎn)化的3型HEV后兔也沒有表現(xiàn)出病毒血癥和糞便排毒。Xia等[43]研究發(fā)現(xiàn)用兔HEV感染懷孕母兔，可導(dǎo)致高死亡率和病毒的垂直傳播現(xiàn)象，并可見兔肝臟的局部肝細(xì)胞明顯壞死，相反，當(dāng)用兔HEV感染非妊娠兔時(shí)則病死率較低，甚至沒有明顯的病理變化。Wang等[44]在一項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)，慢性感染兔HEV的兔還會(huì)出現(xiàn)腎臟損傷，并且在其尿液中可檢測(cè)到HEV RNA，將該尿液樣品注射到SPF兔體內(nèi)可成功誘導(dǎo)兔感染HEV。

筆者所在團(tuán)隊(duì)近年來(lái)在兔感染HEV模型的建立上取得了良好的進(jìn)展（表2）。毛晶晶等[45]通過檢測(cè)實(shí)驗(yàn)感染兔腸道內(nèi)的ORF2抗原信號(hào)，證實(shí)了兔腸道上皮細(xì)胞在HEV復(fù)制過程中的重要作用。吳橋興等[46]采用4型豬HEV成功感染了新西蘭兔，感染兔表現(xiàn)出典型的病毒性肝炎變化和多種肝外器官損傷。雖然通過灌胃途徑感染能更客觀的反應(yīng)在自然感染狀況下病毒的致病機(jī)制，但與腹腔注射途徑相比感染的陽(yáng)性率較低。此外他們還發(fā)現(xiàn)病毒在感染兔后能通過唾液排出。該研究證實(shí)了新西蘭兔可以作為豬HEV跨種間感染的動(dòng)物模型。An等[47]通過腹腔注射4型豬HEV感染兔，研究了HEV在卵巢和子宮內(nèi)的復(fù)制以及HEV引起的組織結(jié)構(gòu)變化，發(fā)現(xiàn)卵巢是HEV的復(fù)制位點(diǎn)之一，并且HEV在卵巢組織中的復(fù)制促進(jìn)了生殖細(xì)胞的凋亡。這是為研究HEV垂直傳播的機(jī)制提供了新思路。

5 其他動(dòng)物

2001年，美國(guó)研究人員從患有肝脾綜合征的雞中分離出了一種新的HEV毒株，禽源HEV與人源HEV有極高的同源性，但僅局限于在禽類動(dòng)物中傳播，至今尚未發(fā)現(xiàn)禽HEV感染人的現(xiàn)象。因此禽作為HEV動(dòng)物模型的應(yīng)用價(jià)值非常有限[48-49]。2010年，荷蘭學(xué)者首次從雪貂糞便中檢出HEV RNA，該病毒株與基因1-4型HEV、兔源HEV、禽源HEV的基因相似性為54.5%～60.5%，與鼠源HEV的相似性較高，為72.3%[50]。雖然雪貂為HEV新的動(dòng)物宿主，但尚無(wú)因感染HEV而致病的相關(guān)報(bào)道，其能否作為實(shí)驗(yàn)感染HEV的理想動(dòng)物模型尚待進(jìn)一步研究。Yu等[51]的一項(xiàng)研究表明，樹鼩可以被人源4型HEV感染，在血清、糞便、膽汁、脾臟和腎臟組織中可以檢測(cè)到HEV RNA，血清ALT升高并有輕度肝損傷。體內(nèi)可檢測(cè)到HEV IgG和IgM抗體。該研究表明樹鼩具備作為人源HEV感染模型的潛力，值得進(jìn)一步研究。

表2 豬源HEV感染的兔模型的系統(tǒng)研究Table 2 Systematic study of rabbit models of pig-derived HEV infection in our laboratory

6 展望

本文就上述動(dòng)物模型對(duì)HEV毒株的實(shí)驗(yàn)敏感性進(jìn)行了歸納（表3）。隨著研究人員對(duì)戊型肝炎的研究日漸深入，越來(lái)越多的HEV動(dòng)物宿主被發(fā)現(xiàn)，這對(duì)HEV在發(fā)達(dá)國(guó)家的散發(fā)流行進(jìn)行了很好的解釋，同時(shí)對(duì)于戊型肝炎病毒理想動(dòng)物模型的選擇也具有十分重要的借鑒意義。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)器官移植技術(shù)發(fā)展迅猛，這使得人類通過動(dòng)物器官移植感染上HEV的風(fēng)險(xiǎn)顯著增高。建立HEV實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型不僅可以闡明HEV的感染及致病機(jī)理，在促進(jìn)HEV新型疫苗的開發(fā)及評(píng)估方面也意義重大，并且也為建立新的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)提供了更多的可能性。但目前關(guān)于HEV實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的研究仍然存在一些問題，比如實(shí)驗(yàn)中所用的動(dòng)物模型以嚙齒類動(dòng)物與兔居多，對(duì)于其他動(dòng)物模型的研究報(bào)道較少，HEV感染方式以靜脈和腹腔注射為主，經(jīng)口及其他途徑感染的研究較少，以及機(jī)體自身的免疫反應(yīng)與HEV感染后的發(fā)病機(jī)制是否相關(guān)等問題。綜上，已經(jīng)建立的動(dòng)物模型對(duì)病毒復(fù)制、發(fā)病機(jī)制和保護(hù)性免疫應(yīng)答的研究在某種程度上還是初步的，如果要加深對(duì)戊型肝炎病毒的認(rèn)識(shí)并改善對(duì)戊型肝炎的控制狀況，還需進(jìn)一步開發(fā)戊型肝炎病毒的小動(dòng)物模型。

表3 不同動(dòng)物物種對(duì)HEV毒株的實(shí)驗(yàn)敏感性Table 3 Experimental sensitivity of different animal species to HEV strains