吳海麗

（上海動(dòng)物園，上海 200335）

腸道微生物指的是動(dòng)物腸道內(nèi)復(fù)雜且動(dòng)態(tài)變化的微生物群落，包括益生菌、有害菌和條件致病菌3種[1]。腸道微生物在動(dòng)物出生后開始定殖，與宿主共同構(gòu)成腸道的微生態(tài)系統(tǒng)。腸道微生態(tài)系統(tǒng)與宿主的營(yíng)養(yǎng)、代謝和免疫密切相關(guān)[2]，當(dāng)“宿主-腸道微生物群”系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)失調(diào)后，就會(huì)導(dǎo)致營(yíng)養(yǎng)-免疫平衡的破壞，宿主就會(huì)產(chǎn)生慢性炎癥反應(yīng)，長(zhǎng)期慢性炎癥最終會(huì)影響動(dòng)物的健康，如：食蟹猴（Macaca fascicularis）[3]、山羊（Capra aegagrus hircus）[4]及豬（Sus scrofa domestica）[5]等動(dòng)物。與大多數(shù)食草動(dòng)物相比，反芻動(dòng)物有獨(dú)特的消化特性，其腸道菌群在物種生物學(xué)中占有突出地位[6]。目前，腸道微生物已在反芻動(dòng)物中被廣泛研究，如海南坡鹿（Cervus eldii）[7]、秦嶺羚牛（Budorcas taxicolor bedfordi）[8]、綿羊（Ovis aries）[9]、林麝（Moschus berezovskii）[10]等。動(dòng)物腸道微生物的組成和多樣性受多種因素的影響[11-15]，以季節(jié)為例，在林麝[16]腸道菌群中厚壁菌門和擬桿菌門的比例隨著季節(jié)的變化而波動(dòng)，冬春季的Shannon指數(shù)高于夏秋季，夏秋季的Simpson指數(shù)高于冬春季，冬春季的腸道菌群多樣性高于夏秋季，該研究提示季節(jié)變化會(huì)影響動(dòng)物腸道微生物。

巖羊（Pseudois nayaur），隸屬于偶蹄目（Artiodactyla）?？疲˙ovidae）羊亞科（Caprinae）巖羊?qū)?，又名崖羊、石羊、藍(lán)羊，是我國(guó)Ⅱ級(jí)重點(diǎn)保護(hù)野生動(dòng)物，主要分布在我國(guó)西藏、云南、四川、青海、甘肅、寧夏、陜西和內(nèi)蒙古等地。在人工圈養(yǎng)的條件下，巖羊胃腸道功能較弱，容易發(fā)生腹瀉，尤其是季節(jié)更替時(shí)。一直以來，國(guó)內(nèi)外對(duì)巖羊生態(tài)學(xué)的研究較多，涉及種群遺傳分析[17]、行為[18]、生境選擇[19]、食性[20]、飼養(yǎng)[21]、繁殖[22]等，然而巖羊的腸道微生物研究還十分有限[23]，特別是圈養(yǎng)條件下。本研究利用Illumina的Miseq測(cè)序平臺(tái)，對(duì)圈養(yǎng)條件下巖羊腸道菌群的組成、菌群多樣性及優(yōu)勢(shì)菌群的季節(jié)性變化進(jìn)行了初步測(cè)定和分析。本研究結(jié)果同時(shí)也為人工圈養(yǎng)條件下改善巖羊腸道菌群提供了一定的理論依據(jù)，并為后續(xù)研究巖羊腸道微生物變化與疾病的關(guān)系提供非常重要的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象 本研究采集的糞便樣品來自于上海動(dòng)物園5只巖羊，年齡、性別和體重分別：為8歲、雄性、40.3 kg，6歲、雌性、25.1 kg，6歲、雌性、24.8 kg，3歲、雌性、21.5 kg，3歲、雌性、20.2 kg。圈養(yǎng)面積約330 m2，飼喂草料和配合飼料（5∶1），保證充足的飲水。

1.2 巖羊糞便的采樣 分別在2017年春季、夏季、秋季和冬季對(duì)上海動(dòng)物園的5只圈養(yǎng)巖羊進(jìn)行新鮮糞便的采集。為減少微生物在巖羊個(gè)體內(nèi)波動(dòng)造成的誤差，本實(shí)驗(yàn)分別選取早（9∶00）、中（12∶00）、傍晚（15∶00）3個(gè)時(shí)間段采集糞便，樣本收集于已滅菌的EP管中，做好標(biāo)記后立即放入冰盒，混合樣本置于-80℃冰箱中保存，待樣品采集完全后進(jìn)行糞便總DNA的提取。本次實(shí)驗(yàn)共采集到20份新鮮的巖羊糞便，樣品編號(hào)見表1。

表1 2017年不同季節(jié)采集的巖羊糞便樣品Table 1 The blue sheep feces were collected in different seasons in 2017

1.3 糞便中微生物基因組DNA的提取 采用天根生化科技（北京）有限公司的糞便基因組DNA提取試劑盒（DP328），按照試劑盒說明完成基因組DNA抽提后，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，測(cè)定其濃度，保存于-20℃中。

1.4 PCR擴(kuò)增、熒光定量 按指定測(cè)序區(qū)域，合成帶有barcode的特異引物，341F：5'-CCTACGGG NGGCWGCAG-3'，805R：5'-GACTACHVGGGT ATCTAATCC-3'。PCR擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性2 min；95℃變性45 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共28個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min。將PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒（AXYGEN公司）切膠純化。PCR產(chǎn)物經(jīng)QuantiFluor?-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)（Promega）公司定量，按照測(cè)序要求，進(jìn)行相應(yīng)比例的混合。

1.5 MiSeq文庫(kù)構(gòu)建及測(cè)序 由上海人類基因組研究中心完成。方法如下：連接“Y”字形接頭；使用磁珠篩選去除接頭自連片段；利用PCR擴(kuò)增進(jìn)行文庫(kù)模板的富集；氫氧化鈉變性，產(chǎn)生單鏈DNA片段。DNA片段的一端與引物堿基互補(bǔ)，固定在芯片上；另一端隨機(jī)與附近的另外一個(gè)引物互補(bǔ)，也被固定住，形成“橋 (bridge)”；PCR擴(kuò)增，產(chǎn)生DNA簇；DNA擴(kuò)增子線性化成為單鏈。加入改造過的DNA聚合酶和帶有4種熒光標(biāo)記的dNTP，每次循環(huán)只合成一個(gè)堿基；用激光掃描反應(yīng)板表面，讀取每條模板序列第一輪反應(yīng)所聚合上去的核苷酸種類；將“熒光基團(tuán)”和“終止基團(tuán)”化學(xué)切割，恢復(fù)3’端粘性，繼續(xù)聚合第二個(gè)核苷酸；統(tǒng)計(jì)每輪收集到的熒光信號(hào)結(jié)果，獲知模板DNA片段的序列。

1.6 生物信息分析流程 MiSeq測(cè)序得到的PE reads首先利用Mothur軟件進(jìn)行拼接，同時(shí)對(duì)序列質(zhì)量進(jìn)行質(zhì)控和過濾，區(qū)分樣本后進(jìn)行OTU聚類分析和物種分類學(xué)分析，基于OTU進(jìn)行了α多樣性（ACE、Chao、Shannon、Simpson）和β多樣性分析。基于分類學(xué)信息，在各個(gè)分類水平上進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計(jì)分析。細(xì)菌百分含量為（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差）%。

2 結(jié)果

2.1 樣品OTU稀釋曲線 基于目前高通量測(cè)序技術(shù)及環(huán)境樣品的物種復(fù)雜性，當(dāng)曲線趨向平坦時(shí)，說明測(cè)序數(shù)據(jù)量合理。結(jié)果顯示，所有樣品的稀釋曲線已經(jīng)趨于平緩（圖1），說明本次實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)量可靠。

圖1 樣品在OTU=0.03情況下得到稀釋曲線Fig.1 The dilution curve of samples at OTU=0.03

2.2 不同季節(jié)巖羊腸道菌群的結(jié)構(gòu)與組成 分析巖羊在不同季節(jié)腸道菌群的結(jié)構(gòu)與組成，共獲得25個(gè)門、264個(gè)屬。在門水平，厚壁菌門（Firmicutes）（72.73±5.84）%和擬桿菌門（Bacteroidetes）(16.61±4.37)%構(gòu)成了優(yōu)勢(shì)菌門，其余菌門豐富度較低。在屬水平，選取TOP20的菌屬（去除unclassified）進(jìn)行研究。Clostridium_XIVa（5.99±2.10）%、Bacteroides（2.62±0.96）%、Clostridium_IV（2.42±1.00）%和Alistipes（1.80±0.78）%共同構(gòu)成了巖羊腸道菌群中的優(yōu)勢(shì)菌屬（圖2）。

2.3 巖羊腸道菌群多樣性分析 腸道菌群多樣性分析主要包括α多樣性和β多樣性。α多樣性用來衡量個(gè)體內(nèi)菌群多樣性，如ACE、Chao、Shannon和Simpson指數(shù)。ACE和Chao指數(shù)用以評(píng)估樣品的稀有物種，值越大說明稀有物種越多；Shannon值越大，Simpson值越小，則說明多樣性越多。圖3所示，夏季的ACE、Chao和Shannon指數(shù)的平均值分別是51568.29、24723.80和6.72，均高于其他季節(jié)，Simpson值最低，平均是0.0074，其中ACE和Chao指數(shù)的變化具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這說明夏季的腸道菌群豐富度顯著高于其他季節(jié)。秋季和冬季之間的ACE、Chao、Shannon和Simpson指數(shù)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這說明巖羊在這兩個(gè)季節(jié)的腸道菌群豐富度和多樣性均無顯著性差異。冬春季節(jié)之間的Simpson指數(shù)雖然無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但有意思的是，春季ACE、Chao、Shannon指數(shù)分別是20617.81、10930.16和5.56，均顯著低于冬季（40745.22、19901.95和6.33）。由此可見，春季是巖羊腸道菌群豐富度和多樣性最低的季節(jié)，且具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖2 巖羊在不同季節(jié)的菌群分布Fig.2 The distribution of intestinal microorganism of blue sheep

圖3 不同季節(jié)巖羊腸道微生物α多樣性分析（P＜0.05）Fig.3 The α diversity of intestinal microbial of blue sheep in different seasons（P＜0.05）

為進(jìn)一步研究季節(jié)對(duì)腸道菌群組分多樣性的影響，我們利用非度量多維尺度分析法（NMDS）研究了巖羊腸道菌群的β多樣性（圖4）。四個(gè)季度的樣本中，春季的所有樣品間距離更近，單獨(dú)居為一簇，而夏、秋和冬三季的樣品相互重疊。這說明春季巖羊腸道菌群的組分是明顯區(qū)分與其他三個(gè)季節(jié)的。NMDS分析的 stress 值為0.143，表明排序結(jié)果相對(duì)可靠。

圖4 不同季節(jié)巖羊腸道微生物β多樣性分析Fig.4 The β diversity of intestinal microbial of blue sheep in different seasons

2.4 不同季節(jié)巖羊腸道優(yōu)勢(shì)菌群的趨勢(shì)圖 在門水平，F(xiàn)irmicutes和Bacteroidetes在春夏秋冬中對(duì)應(yīng)的組分分別是（66.82±12.44）%、（79.35±2.22）%、（6 8.9 6±4.7 3）%、（7 5.7 9±4.4 0）%和（1 5.0 8±5.9 5）%、（1 2.8 0±3.1 2）%、（22.89±4.41）%、（15.66±6.35）%（圖5）。在屬水平，Clostridium_XIVa在春夏秋冬中對(duì)應(yīng)的組分分別是（8.85±2.39）%、（4.16±0.60）%、（4.72±1.05）%和（6.22±1.51）%；Bacteroides在四季中對(duì)應(yīng)的組分分別是：（1.85±1.63）%、（1.7 9±0.6 5）%、（3.7 2±0.8 5）%和（3.12±1.40）%；Clostridium_IV所對(duì)應(yīng)的組分分別是（1.25±0.72）%、（3.61±0.53）%、（2.09±0.53）%和（2.72±1.26）%；Alistipes所對(duì)應(yīng)的組分分別是（1.92±1.10）%、（1.44±0.49）%、（2.83±0.84）%和（1.01±0.46）%（圖6）。其中春夏兩季，Clostridium_XIVa下降了52.99%（P值為0.0028），Clostridium_IV上升了1.89倍（P值為0.0004），變化具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。夏秋兩季，Clostridium_IV、Alistipes和Bacteroides這三個(gè)菌屬差異顯著，Clostridium_IV下降了42.11%（P值為0.0019），Alistipes和Bacteroides分別上升了96.53%和1.08倍（P值分別為0.0126和0.0038）。從秋季到冬季，Alistipes這個(gè)菌屬下降了64.31%（P值為0.0027），且差異呈顯著變化。由此可知夏秋季節(jié)更替時(shí)巖羊腸道優(yōu)勢(shì)菌屬變化最大。

圖5 巖羊優(yōu)勢(shì)菌門在不同季節(jié)的趨勢(shì)圖Fig.5 The trend diagram of the dominant bacteria (at the phyla levels)

圖6 巖羊優(yōu)勢(shì)菌屬在不同季節(jié)的趨勢(shì)圖Fig.6 The trend diagram of the dominant bacteria (at the genera levels)

3 討論

3.1 巖羊腸道菌群的結(jié)構(gòu)與功能 本文采用MiSeq測(cè)序平臺(tái)，通過對(duì)不同季節(jié)的圈養(yǎng)巖羊腸道菌群進(jìn)行初步研究，結(jié)果表明巖羊腸道的優(yōu)勢(shì)菌群主要包含了2個(gè)細(xì)菌門：厚壁菌門（Firmicutes）和擬桿菌門（Bacteroidetes）。大量研究表明，厚壁菌門和擬桿菌門普遍存在于反芻動(dòng)物或其他動(dòng)物胃腸道，并且是主要的優(yōu)勢(shì)菌門[24-25]。厚壁菌門是促進(jìn)宿主胃腸道微生物分解纖維素的最主要菌群[26]，擬桿菌門是促進(jìn)宿主降解寡糖的最主要菌群[27]。在草食性動(dòng)物的消化系統(tǒng)中，厚壁菌門和擬桿菌門均扮演著重要的作用。本研究中發(fā)現(xiàn)，在本園圈養(yǎng)的巖羊厚壁菌門含量為(72.73±5.84) %，擬桿菌門含量為(16.61±4.37)%，與以往的研究相比[23]，厚壁菌門含量明顯偏多而擬桿菌門含量又明顯偏少，這可能是本園為巖羊提供的食物中所含草料比例較高造成的。為有效促進(jìn)巖羊從食物中獲取能量，可以適當(dāng)優(yōu)化草料與配合飼料的比例。在屬水平的研究則發(fā)現(xiàn)，Clostridium_XIVa和Clostridium_IV分別是厚壁菌門中的優(yōu)勢(shì)菌屬。Clostridium_XIVa的平均含量是Clostridium_IV的2.5倍，這說明在巖羊腸道菌群的厚壁菌門中，Clostridium_XIVa為優(yōu)勢(shì)菌屬。有文獻(xiàn)報(bào)道，Clostridium_XIVa具有粘附黏蛋白[28]和參與腸道代謝反應(yīng)[29]等方面的功能，由此可知該菌屬與巖羊的腸道健康有密切關(guān)系。

3.2 巖羊腸道中優(yōu)勢(shì)菌群的季節(jié)性變化 目前已在大熊貓（Ailuropoda melanoleuca）[30]、非洲獅（Panthera leo）[31]、蜜蜂（Bee）[32]等動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)，腸道微生物會(huì)隨著季節(jié)有顯著性波動(dòng)，尤其是在季節(jié)交替的情況下。從巖羊優(yōu)勢(shì)菌群變化的趨勢(shì)圖來看，腸道內(nèi)的優(yōu)勢(shì)菌群存在著季節(jié)性波動(dòng)。通過α多樣性分析，從春季到夏季，巖羊腸道菌群豐富度和多樣性均呈明顯升高的趨勢(shì)。其中夏季的ACE、Chao、Shannon指數(shù)分別是春季的2.5、2.26和1.2倍，且呈極顯著性差異（P值分別為3.55×10-5、3.11×10-5和2.33×10-4）。這不僅說明了夏季巖羊腸道細(xì)菌豐富度與多樣性明顯增高，同時(shí)也暗示了隨著高溫而改變的腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)，有利于動(dòng)物適應(yīng)高溫環(huán)境。從巖羊腸道菌群β多樣性分析結(jié)果來看，春季與其他季節(jié)的菌群種類明顯分開，而夏秋冬三季菌群種類變化不大，這可能跟上海春季特有的濕冷相關(guān)。有意思的是，從春季到夏季，作為厚壁菌門優(yōu)勢(shì)菌屬的Clostridium_XIVa呈下降趨勢(shì)，Clostridium_IV含量則明顯升高，這說明在功能上Clostridium_IV可以部分彌補(bǔ)Clostridium_XIVa不足?，F(xiàn)有的文獻(xiàn)也發(fā)現(xiàn)，Clostridium_XIVa和Clostridium_IV都能參與代謝反應(yīng)[33]。當(dāng)秋季和冬季，Clostridium_XIVa的比例又開始增多時(shí)，Clostridium_IV的含量下降。作為擬桿菌門的Bacteroides和Alistipes從夏季到秋季都呈上升趨勢(shì)，并在秋季達(dá)到峰值?，F(xiàn)有文獻(xiàn)表明，Bacteroides在維持腸道菌群結(jié)構(gòu)的平衡中起著至關(guān)重要的作用[34-35]，Alistipes在提高機(jī)體免疫機(jī)能方面起到重要作用[36]。秋季氣溫波動(dòng)較大，動(dòng)物極易發(fā)生腸道疾病，Bacteroides和Alistipes的升高暗示了他們?cè)谇锛竟餐S持腸道生態(tài)平衡的功能。而在冬季，Bacteroides和Alistipes均呈下降趨勢(shì)，這可能是因?yàn)槎練鉁夭▌?dòng)幅度相對(duì)不大（與夏秋季節(jié)更替相比）。由此可見，季節(jié)變化是影響巖羊腸道菌群結(jié)構(gòu)及健康的重要因素。

綜上所述，我們研究了巖羊腸道菌群的多樣性，并發(fā)現(xiàn)巖羊腸道微生物的組成易受到季節(jié)變化的影響。本研究不僅補(bǔ)充了巖羊腸道微生態(tài)研究的基礎(chǔ)資料，為巖羊的科學(xué)飼養(yǎng)及腸道疾病的防治提供思路，同時(shí)也為進(jìn)一步保護(hù)野生動(dòng)物提供了必要的理論支撐。