劉利莎

（望都縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，保定072450）

豬流行性腹瀉（porcine epidemic diarrhea，PED）是由豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）感染所引起的一類(lèi)常見(jiàn)的腸道傳染病[1]。PEDV可感染各發(fā)育階段豬群，但感染哺乳仔豬可引起嚴(yán)重的臨床癥狀，如嘔吐、腹瀉、脫水等，并導(dǎo)致高死亡率（約100.0%），給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。PED首次于1970年在歐洲被報(bào)道，其后該病在我國(guó)也有被報(bào)道，但多為散發(fā)[3]，直至2010年，我國(guó)大部分地區(qū)相繼暴發(fā)PED，仔豬出現(xiàn)高發(fā)病率和高死亡率，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。進(jìn)一步研究顯示，引起PED暴發(fā)的毒株為變異株，傳統(tǒng)的PEDV CV777病毒株疫苗對(duì)PEDV變異株的防控效果較差，使得部分免疫PEDV疫苗的豬場(chǎng)仍暴發(fā)PED[4]。

PEDV為有囊膜正鏈RNA病毒，屬冠狀病毒科，基因組全長(zhǎng)為28 kb左右。PEDV可編碼7種蛋白（3種結(jié)構(gòu)蛋白和4種非結(jié)構(gòu)蛋白），其中S基因所編碼的糖蛋白可介導(dǎo)病毒入侵，并對(duì)宿主產(chǎn)生中和抗體至關(guān)重要。S基因分為S1區(qū)和S2區(qū)，分別編碼S1蛋白（1～789位氨基酸）和S2蛋白（790～1383位氨基酸）。大量研究表明，S1基因包含多個(gè)病毒的中和表位和受體結(jié)合區(qū)域[5]，與S2基因相比，S1基因更具遺傳變異性[6-7]，通過(guò)分析PEDV分離株S1基因遺傳變異性可以部分了解該毒株的變異情況。因此，本研究于2016年4月至2017年10月在河北省部分地區(qū)采集豬腹瀉糞便樣品共327份，檢測(cè)PEDV流行情況，并對(duì)部分PEDV分離株的S1基因進(jìn)行擴(kuò)增與分析，旨在初步了解PEDV遺傳變異情況，為該地區(qū)PED的防控提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)借鑒。

1 材料與方法

1.1 樣品 2016年4月至2017年10月河北省部分地區(qū)（保定市、張家口、廊坊和滄州市）規(guī)?；i場(chǎng)送檢豬腹瀉糞便樣品共327份，將樣品逐一標(biāo)記后保存于-80℃，待檢。

1.2 主要試劑 2×Taqmix PCR試劑、DL2000 DNA marker、瓊脂糖粉和50×TAE緩沖液均購(gòu)自生工生物工程（上海）有限公司；Trizol試劑、cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自賽默飛世爾科技有限公司。

1.3 樣品處理與RNA提取 將糞便樣品與滅菌PBS緩沖液以1∶3混合均勻，反復(fù)凍融3次后，于4℃、13 000×g離心10 min。取適量上清液按Trizol法步驟提取RNA；將RNA沉淀溶解于無(wú)RNA水中，按照cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)將獲得的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA樣品。

1.4 RT-PCR檢測(cè) 參考文獻(xiàn)[8]，設(shè)計(jì)檢測(cè)PEDV的引物M1和M2，確定送檢樣品中PEDV的流行情況；同時(shí)設(shè)計(jì)并合成擴(kuò)增PEDV分離株的S1基因全長(zhǎng)序列的引物，S1-F：5'-ATGAAGTCTTTAACT TACTTC-3'，S1-R：5'-AATACTCATACTAAAGT TGGTG-3'，引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。PCR體系（20 μL）：2×Taqmix PCR試劑10 μL，上、下游引物各1.0 μL（10 pmol/L），模板2.0 μL，無(wú)RNA酶水6.0 μL。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性1 min；56℃退火30 s；72℃延伸20s（M基因擴(kuò)增引物）/90s（S1基因擴(kuò)增引物），共30個(gè)循環(huán)；72℃再延伸7 min。

1.5 PEDV分離株S1基因序列分析 應(yīng)用DNAStar軟件對(duì)獲得的序列進(jìn)行拼接，同時(shí)分析本次獲得的序列與參考毒株的核苷酸和氨基酸同源性。通過(guò)MEGA7.0軟件中的NJ法構(gòu)架系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 河北省部分地區(qū)豬腹瀉樣品PEDV核酸檢測(cè)結(jié)果 自2010年我國(guó)出現(xiàn)PEDV變異株以來(lái)，PED在我國(guó)大部分豬場(chǎng)廣泛流行，造成仔豬大量發(fā)病與死亡，為養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失，是阻礙我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的重要傳染病之一[9-10]。為了初步分析保定市及周邊地區(qū)PED流行情況，本研究于2016-2017年收集的327份豬腹瀉糞便樣品，應(yīng)用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)PEDV感染情況。部分檢測(cè)結(jié)果顯示，被檢樣品預(yù)期片段大小為200 bp左右，327份被檢糞便樣品中有84份檢測(cè)為PEDV陽(yáng)性，陽(yáng)性率為25.08%（表2），高于張若曦等[11]檢測(cè)結(jié)果（13.89%），這可能與調(diào)查樣品數(shù)量和區(qū)域差異有關(guān)；而與江蘇（36.3%）[12]、遼寧（36.0%）[13]和福建閩西部分地區(qū)（30.37%）[14]調(diào)查結(jié)果基本一致，但低于浙江地區(qū)（64.89%）[15]，說(shuō)明PED在我國(guó)流行情況較為嚴(yán)重，分布區(qū)域廣泛。相關(guān)部門(mén)和生豬養(yǎng)殖企業(yè)（戶(hù)）應(yīng)當(dāng)引起重視，加強(qiáng)豬場(chǎng)生物安全與疫病防控。此外，該地區(qū)2016年和2017年檢測(cè)樣品數(shù)分別為142、185份，PEDV陽(yáng)性率分別為26.76%（38/142）、24.86%（46/185），陽(yáng)性率差異不大。

圖1 部分樣品PEDV M基因擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 The PCR results of partial M gene sequences of PEDV strains

2.2 PEDV分離株S1基因序列擴(kuò)增結(jié)果 在被檢測(cè)的84份PEDV陽(yáng)性糞便樣品中隨機(jī)抽取11份樣品，應(yīng)用引物S1-F/R引物擴(kuò)增出約2200 bp的PEDV S1基因片段（圖2），11個(gè)PEDV分離株分別命名為2016-BDLY-1、2016-BDWD-1、2016-BDWD-2、2016-ZJK-1、2016-LF-1、2016-CZ-1、2017-BDWD-1、2017-BDWD-2、2017-BDLY-1、2017-ZJK-1、2017-ZJK-2。

圖2 11株P(guān)EDV分離株S1基因片段擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 The PCR results of the whole S1 gene sequences of 11 PEDV strains obtained here

2.3 PEDV分離株S1基因序列分析結(jié)果 作為PEDV的主要抗原基因，S1基因具有易變異的特點(diǎn)，可以用于PEDV毒株變異和親緣關(guān)系等研究[3]。通過(guò)對(duì)11株P(guān)EDV分離株S1基因序列進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè)序，將序列片段進(jìn)行拼接后，發(fā)現(xiàn)本次研究獲得的PEDV分離株S1基因序列大小一致，為2205 bp。通過(guò)對(duì)獲得的序列進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)表1，11株P(guān)EDV分離株核苷酸、氨基酸同源性分別為95.8%～100.0%、93.6%～100.0%，與PEDV CV777、LZC疫苗株的核苷酸同源性為89.5%～90.8%；本次獲得的PEDV分離株與中國(guó)安徽株（GenBank登錄號(hào)：KC210145.1）、湖北株（GenBank登錄號(hào)：JX188454.1）和江西株（GenBank登錄號(hào)：KU710238.1）分離的流行變異株同源性較高，分別為96.8%～97.9%、96.0%～98.3%和97.1%～99.2%，與美國(guó)流行的強(qiáng)毒株（GenBank登錄號(hào)：KF272920.1）核苷酸同源性為96.3%～98.7%，這與謝榮輝[4]、張若曦等[11]報(bào)道基本一致。

2.4 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果 基于PEDV分離株S1基因構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，分析結(jié)果顯示（圖3），本研究獲得的11株P(guān)EDV分離株和GenBank收錄的PEDV分離株可聚為2個(gè)亞群，分別為G1和G2，其中G1和G2可以再次分為2個(gè)亞群，分別為G1-a、G1-b和G2-a和G2-b亞群，其中疫苗分離株分布于G1-a亞群，而本次研究所獲得的11株P(guān)EDV分離株均位于G2亞群，與我國(guó)流行的PEDV分離株相距較近；從圖中可以看出2010年后我國(guó)PEDV流行株相距較近，無(wú)明顯的地理分布差異。

表1 部分PEDV毒株的S1基因序列同源性對(duì)比Table1 Homology analysis of S1 gene sequences of partial PEDV strains

圖4 基于PEDV S1基因序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.4 Phylogenetic analysis of PEDV S1 gene sequences

本次研究通過(guò)對(duì)河北省部分地區(qū)PED流行情況和PEDV S1基因序列進(jìn)行調(diào)查和分析，初步了解了PED在該地區(qū)的流行和變異情況，本研究結(jié)果將為該地區(qū)PED科學(xué)防控措施的制定與實(shí)施奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)，從而保障該地區(qū)生豬養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。