秦芳林，李肖純，程貴鳳，吳洛濱，任雨琪，金亞美

（1中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動物寄生蟲學(xué)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，上海200241；2.上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，上海200234；3.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山西030800）

血吸蟲病嚴(yán)重危害人類健康和社會經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，廣泛流行于亞洲、非洲和拉丁美洲[1]。血吸蟲成熟雌蟲大量產(chǎn)卵，卵堆積在宿主肝臟和腸系膜靜脈形成的肉芽腫是導(dǎo)致宿主病理性損傷的根本原因，大量蟲卵排出體外又造成血吸蟲病的傳播和流行。血吸蟲雌雄合抱是雌蟲成熟產(chǎn)卵的前提，未合抱的雌蟲呈發(fā)育阻遏狀態(tài)無法產(chǎn)正常卵[2]，既不會對宿主產(chǎn)生嚴(yán)重的病理損害，也不會引起該病的再傳播。因此從控制血吸蟲的生殖發(fā)育來防治血吸蟲病具有重要意義。

ELAV-like是一類mRNA結(jié)合蛋白，含有3個高度保守的RNA識別基序RRM（RNA recognition motif），對神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和功能維持起重要作用，且多項(xiàng)研究表明，RRM RNA結(jié)合蛋白在細(xì)胞代謝過程中起著重要作用，在人和其他多種生物中其表達(dá)量變化或突變會引起發(fā)育異常或?qū)е律窠?jīng)性疾病的產(chǎn)生[3-5]。ELAV在果蠅中首次克隆獲得，因其表達(dá)改變致果蠅視神經(jīng)發(fā)育異常并于胚胎期死亡而得名。人類中與ELAV-like 1同源的HuR在細(xì)胞中廣泛表達(dá)，通過與ARE（AU-rich element）元件結(jié)合來調(diào)節(jié)mRNA的穩(wěn)定性，它的異常表達(dá)導(dǎo)致生長發(fā)育異常。HuR對胎盤的形態(tài)學(xué)發(fā)生和血管形成以及胎兒的維持有重要作用，該基因缺失將導(dǎo)致胚胎致死或發(fā)育異常[6-8]。ELAV-like 2在小鼠的生殖腺及非洲爪蟾的睪丸、卵巢和特異性的胚胎中也有表達(dá)，且研究表明，小鼠體內(nèi)ELAV-like 2蛋白過早降低會導(dǎo)致成熟卵母細(xì)胞減數(shù)分裂效益下降[9-10]。

實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)ELAV-like 1和ELAV-like 2在日本血吸蟲單性感染雌蟲中高表達(dá)[11-12]，這預(yù)示該基因可能對日本血吸蟲尤其是雌蟲的生長生殖有重要影響。本研究評估了重組蛋白rSjELAV-like 1和rSjELAV-like 2的免疫保護(hù)效果，為血吸蟲病防治研究奠定一定的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 蟲株與試驗(yàn)動物 日本血吸蟲中國大陸株尾蚴由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所血吸蟲病研究室提供；BALB/c小鼠（6～8周齡，雄性）購于上海杰思捷試驗(yàn)動物有限責(zé)任公司。

1.2 主要試劑與儀器 ExTaqHS、T4 DNA Ligase、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ均購于寶生物工程（大連）有限公司；核酸回收試劑盒、質(zhì)粒小量抽提試劑盒、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞BL21和DH5α購于天根生物科技有限公司；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit 購于賽默飛世爾科技有限公司；MONTANIDEISA206VG佐劑購于賽彼科特殊化學(xué)品有限公司；TRizol購于Sigma公司；pET28a、IPTG由本實(shí)驗(yàn)室保存；PCR引物合成及測序由上海英俊生物科技有限公司完成。

1.3SjELAV-like 1和SjELAV-like 2全長基因的克隆、表達(dá) 根據(jù)NCBI登錄的相應(yīng)序列，用Primer Primier 5.0設(shè)計(jì)引物，以日本血吸成蟲cDNA為模板，參考文獻(xiàn)[1-2]，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。SjELAV-like 1-F：5'-CCGGAATTCGTTGGTTCAATGTCAGA TAGTCCAT-3'（下劃線處為EcoRⅠ），SjELAVlike 1-R：5'-CCGCTCGAGTTGTTGTTGTTGTCAA TGTAATCAC-3'（下劃線處為XhoI），SjELAVlike 2-F：5'-GCCGGATCCATGGTTGTATATCAT GATCG-3'（下劃線處為BamHⅠ），SjELAV-like 2-R：5'-CCGCTCGAGTCAGATTTTAGAGGCAG CTATA-3'（下劃線處為XhoⅠ）。雙酶切PCR產(chǎn)物及表達(dá)載體pET28a，用T4 DNA連接酶連接后轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)中，陽性克隆采用菌液PCR和序列測序鑒定。將測序正確的重組克隆接種于LB培養(yǎng)基，D600達(dá)0.8時，加入終濃度為1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，分別收集0、1、2、3、4、6 h的菌體蛋白，以確定最佳誘導(dǎo)時間。大量表達(dá)重組蛋白經(jīng)3次反復(fù)凍融，超聲破碎后分別收集上清和沉淀，同時用SDS-PAGE凝膠電泳分析，判定其表達(dá)情況。將包涵體蛋白洗滌后溶于8 mol/L尿素，用His Bind Resin鎳柱親和層析法純化。因ELAV-like 2的等電點(diǎn)（PI）為7.91，為防止等電沉淀，純化rSjELAVlike 2時將所需Buffer的pH值調(diào)為8.5。

1.4 免疫 6～8周齡雄性BALB/c小鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組、佐劑對照組、空白對照組，每組10只。試驗(yàn)組將純化后的融合蛋白分別與206佐劑混合（46∶54）皮下注射進(jìn)小鼠體內(nèi)，佐劑對照組皮下注射PBS與206佐劑混合物，空白對照組皮下注射PBS。每隔兩周免疫1次，共免疫3次，ELAV-like 2免疫前和每次免疫后2周眼眶采血，收集血清用ELISA檢測抗體變化水平。3次免疫后2周，每只小鼠經(jīng)腹部皮膚貼片攻擊感染402條日本血吸蟲尾蚴。42 d后以肝門靜脈灌注法收集蟲體并計(jì)數(shù)，收集肝臟并分別計(jì)算肝臟荷卵數(shù)同時進(jìn)行肝卵孵化，計(jì)算減卵率和減孵化率。

1.5 減蟲率和減卵率的計(jì)算 減蟲率=（1-實(shí)驗(yàn)組蟲體數(shù)目/佐劑對照組蟲體數(shù)目）×100%。蟲卵計(jì)數(shù)：剖殺小鼠肝臟稱重，置于50 mL離心管內(nèi)加去氯水適量，勻漿后定容至20 mL，取1 mL勻漿液和10% NaOH等體積混合，37℃消化30 min，消化過程中不時混勻并取少量觀察，待消化完全，搖勻后取50 μL于顯微鏡下計(jì)數(shù)蟲卵，重復(fù)3次取平均值：減卵率=（1-實(shí)驗(yàn)組卵胚數(shù)/佐劑對照組卵胚數(shù)）×100%。蟲卵孵化：取4 mL肝臟勻漿液至細(xì)頸燒瓶，加入去氯水至瓶頸上3～5 cm，液面上塞入薄層棉花（避免氣泡產(chǎn)生）棉花上方再加入適量去氯水，26～28℃孵化，分別于孵化2 h、6 h時，將上層含毛蚴液體轉(zhuǎn)移至15 mL離心管，用碘酊固定并染色毛蚴，4000×g離心5 min，棄上清液，沉淀用去氯水定容至2 mL，取50 μL顯微鏡下計(jì)數(shù)毛蚴，重復(fù)3次取平均值。孵化率=（毛蚴總數(shù)/卵胚總數(shù)）×100%

減孵化率=（1-實(shí)驗(yàn)組孵化率/佐劑對照組孵化率）×100%

2 結(jié)果

2.1SjELAV-like-1和SjELAV-like-2基因的克隆表達(dá)和蛋白純化 以日本血吸蟲成蟲cDNA為模板，擴(kuò)增基因SjELAV-like-1和SjELAV-like-2的已知編碼區(qū)域，PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳顯示單一條帶，分子量與已知序列大小相符（圖1）。經(jīng)雙酶切連接轉(zhuǎn)化測序成功后，誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，SDS-PAGE結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒在大腸桿菌BL21（DE3）中成功表達(dá)，二者都在4 h表達(dá)量最高，且蛋白都以包涵體的形式存在；用His-bind鎳柱親和層析法獲得融合表達(dá)蛋白，分子量分別約為62 kDa和64.2 kDa，見圖2-4。

2.2 免疫小鼠后特異性抗體水平變化 分別在免疫前、1免、2免、3免后2周收集小鼠血清，用ELISA方法對rSjELAV-like 2特異性IgG水平進(jìn)行檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：實(shí)驗(yàn)組與佐劑對照組相比，1免后特異性IgG已產(chǎn)生，2免后特異性抗體水平顯著提升、3免后特異性抗體持續(xù)升高（圖5），而差異極顯著（p<0.01），具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。佐劑對照組與空白對照組無顯著性差異。

2.3 免疫保護(hù)效果 剖殺小鼠后，靜脈灌注沖蟲，收集蟲體并計(jì)數(shù)；小鼠肝臟勻漿并孵化蟲卵，顯微鏡下計(jì)數(shù)蟲卵和毛蚴，分別計(jì)算減蟲率、減卵率、減孵化率（表1）。結(jié)果顯示：rSjELAV-like 1免疫可產(chǎn)生減蟲率17.81%，減卵率44.52%，但該免疫反而提升了蟲卵孵化能力（20.38%）；rSjELAV-like 2免疫可產(chǎn)生減蟲率36.03%，減卵率為51.34%，減孵化率為46.83%。

3 討論

血吸蟲病歷史悠久、分布廣泛、危害嚴(yán)重。對血吸蟲病的治療主要依靠化學(xué)藥物如：吡喹酮，但因血吸蟲中間宿主釘螺難以消滅，化學(xué)藥物治療不能解決重復(fù)感染，因此加強(qiáng)血吸蟲病免疫預(yù)防研究極為重要。

圖3 融合蛋白表達(dá)形式的SDS-PAGE檢測Fig.3 SDS-PAGE analysis of fusion protein expression

圖4 融合蛋白rSjELAV-like 1和 rSjELAV-like 2純化后產(chǎn)物SDS-PAGE檢測Fig.4 SDS-PAGE analysis of purified rSjELAV-like 1 and rSjELAV-like 2

圖5 rSjELAV-like 2免疫后小鼠特異性IgG水平變化Fig.5 Analysis of specific IgG induced in mice immunized with rSjELAV-like 2

ELAV-like家族基因編碼RNA 結(jié)合蛋白，通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)影響 mRNA 的轉(zhuǎn)運(yùn)、定位和翻譯，控制蛋白的時空表達(dá)，并調(diào)控 RNA 與蛋白質(zhì)的結(jié)合及其相互作用，決定基因的表達(dá)水平及終產(chǎn)物，進(jìn)而發(fā)揮不同的生物學(xué)功能[3-4]。ELAV-like 1可通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制限制神經(jīng)突觸的生長，對神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和維持有重要作用[13]。ELAV-like 2與Sxl基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控機(jī)制及其相似，Sxl是果蠅性別發(fā)育決定的調(diào)節(jié)開關(guān)，與果蠅的性別決定和維持有很大的關(guān)系[14-15]。而日本血吸蟲的ELAV-like 2與果蠅的Sex-lethal（Sxl）蛋白有一定的同源性，由此可推測SjELAV-like 2在血吸蟲的生長發(fā)育中應(yīng)也有同樣重要的功能。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)SjELAV-like 1和SjELAV-like 2在25天的單性感染血吸蟲雌蟲中高表達(dá)，二者主要表達(dá)于血吸蟲體表，且其表達(dá)受干擾不僅引起形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變而且對血吸蟲的生殖產(chǎn)卵能力和卵胚孵化能力都有顯著的影響[11-12]，說明二者對血吸蟲尤其是雌蟲的生長和生殖發(fā)育有一定的影響。

表1 融合蛋白免疫BALB/c小鼠引起的免疫效果分析Table 1 Protection level in BALB/c mice induced by fusion protein immunization

本研究成功克隆并融合表達(dá)了rSjELAV-like 1和rSjELAV-like 2蛋白，評估了這兩個血吸蟲雌蟲生殖發(fā)育相關(guān)蛋白的免疫保護(hù)效果。免疫保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果表明rSjELAV-like 1和rSjELAV-like 2有一定的免疫保護(hù)效果，對宿主的荷蟲數(shù)有不同程度的降低，且rSjELAV-like 2減蟲效果優(yōu)于rSjELAV-like 1，同時它對減輕宿主肝臟的卵荷也顯著優(yōu)于rSjELAVlike 1。對宿主體內(nèi)雌蟲所產(chǎn)蟲卵孵化能力上這兩個蛋白表現(xiàn)出相反的影響，rSjELAV-like 1免疫反而會提升卵胚孵化能力，rSjELAV-like 2免疫則會降低卵胚孵化能力。

日本血吸蟲成熟雌蟲日產(chǎn)卵量可達(dá)3000個，卵沉積在宿主肝臟中會形成肉芽腫，破壞肝組織，造成宿主嚴(yán)重病理損害；蟲卵排出體外又會造成血吸蟲病的傳播和流行[16]。因此減低宿主卵荷和降低蟲卵孵化對血吸蟲病病理損害的減輕和傳播的阻斷具有重要意義。rSjELAV-like 2免疫不僅能降低宿主肝臟中蟲卵數(shù)目，而且降低蟲卵孵化能力；rSjELAVlike 1免疫能降低宿主肝臟蟲卵數(shù)目，但對蟲卵孵化能力反而是提高的。二者都對宿主肝臟蟲卵孵化有一定影響，都可以降低宿主體內(nèi)蟲荷和宿主肝臟卵荷，對減輕宿主病理損害有一定的幫助，且rSjELAV-like 2免疫可顯著降低宿主肝卵孵化，在阻斷血吸蟲病傳播方面可發(fā)揮一定作用，更適合作為抗血吸蟲病疫苗候選分子。