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        高效液相色譜法測定乳清蛋白中的α-乳白蛋白和β-乳球蛋白及其改性降敏

        2020-08-06 12:37:44趙倩如朱麗英趙權(quán)宇
        生物加工過程 2020年4期
        關(guān)鍵詞:牛乳乳清白蛋白

        趙倩如,朱麗英,趙權(quán)宇,江 凌

        (1.南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院,江蘇 南京 211800;2.南京工業(yè)大學(xué) 化學(xué)與分子工程學(xué)院,江蘇 南京 211800;3.南京工業(yè)大學(xué) 食品與輕工學(xué)院,江蘇 南京 211800)

        近年來,過敏性疾病的發(fā)病率不斷增加,食物過敏已成為一個重要的公共衛(wèi)生問題。牛乳過敏(CMA)是一種最常出現(xiàn)的食物過敏反應(yīng)[1],占所有確診食物過敏病例的9%[2],嬰兒牛乳過敏發(fā)病率從0.3%到7.5%不等[3]。牛乳過敏是由牛乳中的致敏蛋白引起的一種不良反應(yīng),主要由免疫球蛋白介導(dǎo)的免疫反應(yīng),可引起過敏性鼻炎、哮喘、濕疹、腹瀉、胃腸出血等癥狀,甚至?xí)?dǎo)致過敏性休克,嚴重危及嬰幼兒的生命[4]。牛乳中最具有營養(yǎng)價值的蛋白質(zhì)是乳清蛋白,乳清蛋白中主要的致敏蛋白是α-乳白蛋白和β-乳球蛋白。

        目前檢測乳品中過敏原的方法主要有3種:高效液相色譜法(HPLC)、電泳法、免疫化學(xué)法。最常見的蛋白電泳方法是十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)[5-7]和毛細管電泳法[8]以及酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法[9-10]通過抗原抗體特異性結(jié)合可以測定過敏原的免疫反應(yīng)性(與免疫球蛋白結(jié)合的能力)。但以上方法在測定β-乳球蛋白時都具有一定的局限性,如電泳技術(shù)在定量方面有很大的不足;毛細管電泳重復(fù)性差,容易堵塞;ELISA方法對試劑的選擇性高。牛乳中蛋白質(zhì)種類很多,很難有效檢測,以上技術(shù)局限性限制了這些方法在實踐中的推廣應(yīng)用。反相高效液相色譜法是分析乳清蛋白成分的有效方法之一,與其他檢測方法相比具有分辨率和回收率高、操作簡便、重復(fù)性好等優(yōu)勢。反相高效液相色譜法可以高效實現(xiàn)大分子以及復(fù)雜物質(zhì)快速分離,對乳品中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白進行定性定量檢測[11]。定量檢測技術(shù)為開發(fā)市場中低過敏乳制品的質(zhì)量提供了有效方法。另外,如何通過改性技術(shù)降低牛乳致敏性開發(fā)低致敏乳品[12]也成為研究的熱點。

        在食品加工過程中,主要采用的降敏方法有3種:物理[13]、化學(xué)[14]和生物學(xué)[15]方法。酶降解致敏蛋白[16-18]是最常見的一種方法,通過酶將大分子蛋白質(zhì)水解成小分子肽以被吸收利用,可以降低過敏蛋白的致敏性。沈小琴等[19]研究發(fā)現(xiàn)胰蛋白酶、胃蛋白酶和堿性蛋白酶是最常用來水解牛乳中致敏蛋白的酶。

        本研究中,筆者擬建立一種高效液相色譜技術(shù)定量檢測乳清蛋白中主要致敏蛋白α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的方法,同時評測該檢測方法的可行性,選擇胰蛋白酶作為酶解代表試劑處理乳清蛋白中的致敏蛋白,采用可視化優(yōu)化方法預(yù)測最佳的酶解處理條件[20],以期為低致敏乳品的開發(fā)提供有效的檢測方法和參考。

        1 材料與方法

        1.1 主要試劑

        α-乳白蛋白標準品(純度≥85%)、β-乳球蛋白標準品(純度≥90%)、酪蛋白、分離乳清蛋白,上海源葉生物科技有限公司;三氟乙酸(色譜純)、乙酸(分析純),美國 TEDIA 公司;乙腈(色譜純),上海凌峰化學(xué)試劑有限公司;胰蛋白酶,南京都萊生物技術(shù)有限公司;蒙牛牛奶、伊利嬰兒配方奶粉,當?shù)爻?。樣品及編號?#,α-乳白蛋白標準品;2#,β-乳球蛋白標準品;3#,分離乳清蛋白;4#,蒙牛牛奶;5#,伊利嬰兒配方奶粉。

        1.2 主要儀器

        DSHZ-300A型旋轉(zhuǎn)式恒溫水浴振蕩器,太倉市實驗設(shè)備廠;GA88-Ⅱ型超聲破碎儀,無錫上佳生物科技有限公司;UltiMate 3000型戴安高效液相色譜儀色譜儀,Dionex公司;5804R型高速冷凍離心機,德國Eppendorf公司;GZX-9140型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱,上海博訊實業(yè)有限公司;GTL100型恒溫金屬浴,北京萊普特科學(xué)儀器有限公司。

        1.3 主要溶液及配制

        醋酸緩沖液。3.86 g冰醋酸和2.93 g無水醋酸鈉加入蒸餾水定容至1 L。

        標準品溶液。分別準確稱量α-乳白蛋白標準品、β-乳球蛋白標準品4 mg,加入2 mL蒸餾水進行溶解,配制成2 mg/mL的標準儲備液,吸取適量標準儲備液,加入蒸餾水進行稀釋,稀釋成質(zhì)量濃度為2、1、0.5、0.25、0.125 mg/mL的標準溶液。

        樣品溶液。準確稱量樣品,加入蒸餾水定容至100 mL,待測。牛奶按照文獻[21]優(yōu)化的方法進行處理,將新鮮的牛奶以5 000g轉(zhuǎn)速低溫冷凍離心20 min去脂肪,去脂肪上清液和醋酸緩沖液等體積混合,以8 000g離心10 min,取上清液待測。

        1.4 檢測條件

        1.4.1 高效液相色譜條件

        流動相A為0.1%三氟乙酸水溶液,流動相B為0.1%三氟乙酸乙腈溶液,流速為1.0 mL/min,紫外檢測器檢測波長為280 nm,檢測溫度為25℃,進樣量為10 μL。梯度洗脫條件具體見表1。

        表1 梯度洗脫條件

        1.4.2 流動相及相關(guān)溶液前處理

        1)流動相A、B以及洗脫液配制完成后需要在簡易抽濾裝置下進行去除雜質(zhì);

        2)流動相在進行抽濾過后進行超聲,20 ℃條件下超聲30 min以去除氣泡;

        3)樣品以及標品溶液在上樣之前用0.22 μm的濾膜進行過濾處理。

        1.4.3 方法學(xué)驗證

        1)樣品中的蛋白含量X的計算見式(1)。

        (1)

        式中:X為試樣中的蛋白含量,以100 g樣品計算;C為蛋白的質(zhì)量濃度,mg/mL;V為試樣的實際稀釋液總體積,mL;m為樣品質(zhì)量,g。

        2)利用外推法求得樣品分析方法的檢出限,分別取3種低濃度樣品平行測定3次,求出每種濃度的相對標準偏差,用線性回歸法做出擬合曲線,擬合曲線相交于y軸的點,為S0,則3S0為樣品分析方法的檢出限。

        3)分別進行樣品分析方法的精密度、穩(wěn)定性以及樣品回收率的探究,每組實驗重復(fù)測定3次,取數(shù)據(jù)的平均值作為檢測結(jié)果。

        1.5 胰蛋白酶降解

        1.5.1 樣品預(yù)處理

        將樣品4#(市售的牛乳)進行脫脂,將脫脂牛乳加熱至85 ℃,維持10 min以使得蛋白充分變性,調(diào)節(jié)恒溫混勻儀至水解溫度,以600 r/min的轉(zhuǎn)速進行充分混合水解,水解結(jié)束后加熱至120 ℃使酶失活。改變酶解溫度、時間、酶量,多次進行實驗。

        1.5.2 智能可視化軟件優(yōu)化

        采用可視化優(yōu)化方法對酶解工藝條件進行分析處理,預(yù)測出最佳的酶解工藝條件。首先確定酶解條件的區(qū)間,酶解條件作為多維空間中的向量,再利用映射模型將多維空間中的簡單數(shù)據(jù)映射到二維平面,在該平面中自動生成目標函數(shù)或輪廓的輪廓。根據(jù)輪廓的分布直觀地定位優(yōu)化的操作方向或區(qū)域,最后在該區(qū)域中找到接近最優(yōu)的點,可以用反演映射方法映射回原始的多維空間,預(yù)測出最優(yōu)酶解條件[22]。

        2 結(jié)果與討論

        2.1 高效液相色譜法測定方法相關(guān)結(jié)果

        相比于C4柱,選用常見且分離效果更佳的C8柱對α-乳白蛋白和β-乳球蛋白進行分離,以280 nm為檢測波長,目標物出峰時間短,分離效果好。圖1為1 mg/mL的α-乳白蛋白和2 mg/mLβ-乳球蛋白標準色譜圖。由圖1可知,這兩種蛋白的分離峰形尖銳、分離度較好。其中,α-乳白蛋白在12.1 min出峰,β-乳球蛋白在14.5 min出峰,β-乳球蛋白出現(xiàn)雙峰。根據(jù)Brownlow等[23]報道,β-乳球蛋白隨著pH變化會發(fā)生構(gòu)象改變,通常它是以二聚體的形式存在,當pH低于3.5或高于7.5時,二聚體解離且構(gòu)象發(fā)生變化,形成膨脹的單體。

        圖1 α-乳白蛋白標樣和β-乳球蛋白標樣譜圖

        2.2 方法學(xué)驗證

        2.2.1 線性關(guān)系

        根據(jù)配制的一系列標準品濃度,分別繪制α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的標準曲線,對所得曲線進行線性回歸分析,具體的線性方程和數(shù)據(jù)結(jié)果如表2所示。

        表2 蛋白線性方程及檢出限

        由表2可知,對于2種致敏蛋白,所構(gòu)建的標準曲線在0.125~2.000 mg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈線性關(guān)系,其相關(guān)系數(shù)均大于0.99,說明線性關(guān)系良好。這種外標法可以快速定量分析樣品中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白濃度。

        2.2.2 定量限(LOQ)和檢出限(LOD)

        定量限結(jié)果發(fā)現(xiàn),產(chǎn)生所需精密度和準確度的定量α-乳白蛋白和β-乳球蛋白分別為0.062 5和0.080 0 mg/mL。換算成樣品(以每100 g試樣計算)中的含量α-乳白蛋白為0.03 g,β-乳球蛋白為0.02 g。α-乳白蛋白定量限達到食品安全地方標準(DBS 32/011—2016)為0.03 g,β-乳球蛋白定量限略高于團體標準(T/TDSTIA 007—2019)為0.018 g。

        儀器檢出限結(jié)果顯示α-乳白蛋白為0.090 0 mg/mL和β-乳球蛋白為0.100 0 mg/mL。結(jié)果發(fā)現(xiàn)α-乳白蛋白和β-乳球蛋白檢出限分別為0.078 0和0.090 0 mg/mL。

        2.2.3 精密度

        精密度是保證準確度的先決條件。為了進行此次精密度探究,利用α-乳白蛋白和β-乳球蛋白3種不同濃度的標準溶液進行評估,結(jié)果見表3。由表3可知,相對標準偏差(RSD)均小于5%,說明該方法對蛋白質(zhì)具有測量的再現(xiàn)性。

        表3 蛋白質(zhì)檢測精密度數(shù)據(jù)

        2.2.4 特異性

        以樣品3#為代表進行特異性探究,分別對未處理和經(jīng)過處理的樣品溶液進行分析檢測,結(jié)果見圖2。由圖2可知,經(jīng)過處理后的2種蛋白的色譜峰峰形尖銳,分離效果好,說明該分析方法對α-乳白蛋白和β-乳球蛋白具有特異性。

        圖2 不同條件下的色譜圖

        2.2.5 穩(wěn)定性研究

        將配制好的5種樣品的新鮮溶液和經(jīng)過48 h冷藏后的儲備溶液平行測定3次,研究分析方法的穩(wěn)定性,結(jié)果如表4所示。由表4可知,經(jīng)過48 h后的冷藏儲備液并沒有明顯的降解,相對標準偏差(RSD)均小于5%,說明該方法能在48 h內(nèi)實現(xiàn)蛋白含量的穩(wěn)定定量測定。

        表4 穩(wěn)定性實驗結(jié)果

        2.2.6 回收率實驗結(jié)果

        分別取樣品4#和樣品5#各1 mL,每份樣品中等體積加入標準品混合溶液(0.2 mg/mL的α-乳白蛋白溶液和0.4 mg/mL的β-乳球蛋白等體積混合),如前所述進行蛋白含量分析,每組實驗平行測定3次,結(jié)果如表5所示。由表5可知,相對標準偏差(RSD)小于5%,回收率在92%~96%,表明該方法可以實現(xiàn)樣品較高的回收率。

        表5 加樣回收率測定結(jié)果

        2.2.7 不同樣品中致敏蛋白含量測定

        利用該色譜分析方法分別對樣品3#、4#和5#進行了2種致敏蛋白的含量測定,具體結(jié)果如表6所示。由表6可知,該方法能夠?qū)崿F(xiàn)不同乳品中致敏蛋白含量的檢測。值得注意的是樣品5#(嬰兒配方奶粉)中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的含量較低,說明嬰兒配方奶粉中的致敏蛋白含量已經(jīng)受到控制,不同乳制品中致敏蛋白含量也有所差異,牛乳比嬰幼兒配方奶粉中β-乳球蛋白含量要高,會更容易出現(xiàn)過敏現(xiàn)象。

        表6 樣品測定結(jié)果

        2.3 胰蛋白酶水解

        相比于一些物理化學(xué)降解方法,酶降解是一個溫和有效的過程,研究表明胰蛋白酶可以有效地降解致敏蛋白,首先設(shè)計單因素變量法考察酶降解影響因素(溫度、酶量、水解時間),每組實驗平行測定3次,取數(shù)據(jù)的平均值作為測定結(jié)果,其次進行正交試驗,最后利用可視化方法預(yù)測出最佳的酶解條件。

        2.3.1 單因素變量實驗結(jié)果

        2.3.1.1 溫度對酶解效果的影響

        選取樣品4#作為水解底物,將牛乳按照之前所述進行處理,分成15份作為水解底物,水解底物為1 mL脫脂牛乳。另外,脫脂牛乳保留1份作為原液進行測定。將胰蛋白酶配制成1 g/L的酶溶液,按照高酶量6 000 U/g胰蛋白酶加入到樣品溶液中,按照之前所述方法進行水解,水解時間設(shè)為30 min,溫度梯度設(shè)置為25、35、40、45和50 ℃,最后測得水解底物中剩余致敏蛋白濃度。具體結(jié)果表7所示。由表7可知,胰蛋白酶在一定的酶量和酶解時間下,在40 ℃水解條件下最佳,溫度過高或者過低水解效果均不佳。因此,在40 ℃左右分別取2個溫度作為酶解溫度的最佳區(qū)間(35、40和45 ℃),作為溫度因素的3個水平。

        表7 不同溫度下的酶解結(jié)果

        2.3.1.2 酶量對酶解效果的影響

        根據(jù)溫度實驗的結(jié)果,在40 ℃條件下按照各酶量加到樣品溶液中水解,30 min后測定水解底物中剩余致敏蛋白濃度,具體結(jié)果如表8所示。由表8可知,在一定水解溫度和水解時間條件下,酶量與水解效果成正比,但是當超過6 000 U/g胰蛋白酶時,水解效果下降不再明顯。為了保證牛乳中營養(yǎng)成分的同時降低致敏蛋白的含量,本研究以接近母乳中蛋白含量為標準,使用1 000、1 500和2 000 U/g胰蛋白酶為酶量的3個水平。

        表8 不同酶量下的酶解結(jié)果

        2.3.1.3 水解時間對酶解效果的影響

        根據(jù)溫度、酶量實驗的結(jié)果,在溫度40 ℃、1 000 U/g胰蛋白酶的條件下進行水解,水解時間為10、20、30、40和50 min,最后測得水解底物中剩余致敏蛋白濃度,具體結(jié)果如表9所示。由表9可知,隨著時間不斷延長,降解效率越來越高,同樣為了保證乳制品中乳清蛋白的營養(yǎng)不被完全破壞,保持低濃度的β-乳球蛋白,選擇水解時間為20、30和40 min作為時間因素的3個水平。

        表9 不同時間下的酶解結(jié)果

        2.3.2 多因素變量實驗

        設(shè)計正交試驗,根據(jù)單因素變量的實驗結(jié)果,分別挑選溫度、酶量、水解時間最優(yōu)區(qū)間進行正交試驗,結(jié)果以剩余蛋白濃度為標準,具體結(jié)果見表10和表11。

        表10 正交試驗結(jié)果

        表11 極差分析

        由表10~11結(jié)果確定了正交試驗最優(yōu)處理條件:溫度40 ℃、1 500 U/g胰蛋白酶、水解時間40 min。

        2.3.3 可視化方法優(yōu)化

        表12 可視化優(yōu)化方法的優(yōu)化結(jié)果

        圖3 胰蛋白酶降解工藝降維映射平面圖

        可視化誤差分析如表13所示。由表13可知,可視化優(yōu)化方法可用于預(yù)測最優(yōu)化酶解條件。

        表13 可視化優(yōu)化方法誤差分析

        2.3.4 最優(yōu)酶降解條件

        根據(jù)正交試驗和可視化方法得到的酶解最優(yōu)條件進行實驗,每組進行3次行平行測定,結(jié)果如表14所示。預(yù)測胰蛋白酶水解的最佳條件為溫度45 ℃、2 000 U/g胰蛋白酶、水解30 min。由表14可知,在此條件下水解率已達到較高值,且致敏蛋白在蛋白質(zhì)中比例接近母乳(23%)說明營養(yǎng)沒有被破壞,此條件可作為胰蛋白酶水解的最佳條件。

        表14 最佳條件酶解

        3 結(jié)論

        利用反相高效液相色譜法采用Sepax-C8色譜柱對乳清蛋白中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白含量進行檢測分析,并且評測了該方法的可行性,在該方法下樣品中的α-乳白蛋白和β-乳球蛋白出峰時間短,分離效果好。同時進行了精密度、穩(wěn)定性和回收率實驗,結(jié)果RSD均小于5%,也證實了方法的可行性。利用胰蛋白酶降解致敏蛋白,采用智能可視化優(yōu)化方法預(yù)測最優(yōu)酶解條件,結(jié)果表明在45 ℃下加入2 000 U/g胰蛋白酶水解30 min后,2種致敏蛋白含量占總蛋白的22.7%,大大降低了乳品中的致敏蛋白含量。本次研究可為乳制品的質(zhì)量評價及生產(chǎn)低致敏乳品提供依據(jù)。

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