諸駿杰，孫文閃，周婷婷，董葉箐，鐘寒輝，黃榮博，吳丹虹，徐子健，章 虎

(綠城農(nóng)科檢測(cè)技術(shù)有限公司，浙江 杭州 310051)

草甘膦(glyphosate，GLY)是一種無(wú)選擇性除草劑，因?yàn)榈投?、廉價(jià)、高效等特點(diǎn)廣泛運(yùn)用在全世界各個(gè)農(nóng)業(yè)和非農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，在環(huán)境和生物體內(nèi)不斷富集，通過(guò)食物和水進(jìn)入體內(nèi)，對(duì)人體造成危害[1]。草銨膦(glufosinate,GLU)具有低毒、好吸收、高活性、殺草廣譜、環(huán)境兼容性強(qiáng)等特點(diǎn),成為世界第二大轉(zhuǎn)基因作物耐受除草劑，通過(guò)植物蒸騰作用可以在植物木質(zhì)部之間進(jìn)行傳導(dǎo)，其速效性在百草枯和草甘膦之間[2-3]。隨著草甘膦和草銨膦使用頻率不斷上升，其殘留問(wèn)題越來(lái)越受到公眾的關(guān)注，我國(guó)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中農(nóng)藥最大殘留限量規(guī)定》(GB 2763—2019)規(guī)定油脂中草甘膦和草銨膦限量為0.05 mg/kg，其中草銨膦為臨時(shí)限量。建立簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、可靠、靈敏、快速的植物油中可以同時(shí)測(cè)定草甘膦及其代謝物氨甲基膦酸(aminomethyl phosphonic acid，AMPA)和草銨膦殘留的檢測(cè)方法非常重要。

目前，草銨膦、草甘膦及其代謝物氨甲基膦酸的檢測(cè)方法有氣相色譜法(GC)[4]、離子色譜法(IC)[5-6]液相色譜法(LC)[7]、氣相色譜質(zhì)譜法(GC-MS)[8]、液質(zhì)聯(lián)用法(LC-MS-MS)[9-15]等。由于草銨膦、草甘膦、氨甲基膦酸均為強(qiáng)極性化合物，不溶于大部分有機(jī)溶劑，難揮發(fā)，缺少熒光和發(fā)色基團(tuán)，在常規(guī)反相柱上沒(méi)有保留，難以利用氣相色譜和液相色譜進(jìn)行分離，直接通過(guò)紫外、熒光、質(zhì)譜檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，靈敏度太低，因而需要通過(guò)衍生反應(yīng)來(lái)改變?cè)跉庀嗪鸵合嗌系纳V行為以及提高檢測(cè)器的響應(yīng)值。前處理繁瑣，衍生反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)，離子色譜法雖然不需要衍生，但是靈敏度低，雜質(zhì)干擾嚴(yán)重。

本文中，筆者擬建立一種分散液液萃取非衍生液質(zhì)聯(lián)用測(cè)定植物油中的草銨膦、草甘膦及其代謝物氨甲基膦酸殘留的方法，樣品首先通過(guò)正己烷分散，再用乙腈水液液萃取，通過(guò)氨基色譜柱進(jìn)行分離，質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)測(cè)定，外標(biāo)法定量，以期該法可用于植物油中草銨膦、草甘膦及其代謝物氨甲基膦酸殘留的快速檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

正己烷(色譜純)，德國(guó)CNW科技公司；乙酸銨(質(zhì)譜純)，美國(guó)賽默飛世爾公司；標(biāo)準(zhǔn)品草甘膦(CAS號(hào)：1071-83-6)、氨甲基膦酸(CAS號(hào)：1066-51-9)、草銨膦(CAS號(hào)：77182-82-2)(純度>98%)，德國(guó)Dr Ehrenstofer公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LC30A型超高效液相色譜8050型三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀(配電噴霧離子源)，日本島津公司；ACQUITY UPLC-C18柱(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)、ACQUITY UPLC-T3柱(2.1 mm×100 mm,1.8 μm)，Waters 公司；DikmaPolyamino氨基柱(2.0 mm×150 mm，5 μm)，迪馬科技；ST16R型高速離心機(jī)，美國(guó)賽默飛世爾公司；EUFO-945616型渦旋振蕩器，TALBOYS公司；Milli-Q型超純水儀，美國(guó)密理博公司；BSA224S型電子天平，德國(guó)賽多利斯公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

稱取(0.200 0±0.000 5)g食用油(精確到0.000 1 g)于10 mL聚丙烯離心管中，加入0.5 mL正己烷，2 500 r/min渦旋混合20 s，再加入0.8 mL乙腈-水(體積比1∶ 1)，2 500 r/min渦旋混合30 s，10 000 r/min離心2 min，取下層清液過(guò)0.22 μm混合膜，待上機(jī)測(cè)定。

1.3.2 色譜條件

色譜柱為DikmaPolyamino氨基柱(2.0 mm×150 mm，5 μm)、進(jìn)樣量為10 μL、柱溫為30 ℃、流速為0.2 mL/min；流動(dòng)相為A為乙腈，B為乙酸銨-氨水溶液(5 mmol/L乙酸銨溶液，用氨水調(diào)節(jié)pH到 12)，梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫參數(shù)

1.3.3 質(zhì)譜條件

采用ESI源、負(fù)離子MRM掃描模式進(jìn)行質(zhì)譜條件和離子源參數(shù)優(yōu)化。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

稱取草銨膦、草甘膦、氨甲基膦酸標(biāo)準(zhǔn)品，用純水溶解配制成200 mg/L標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，4 ℃下保存待用?；|(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制：采用空白樣品(山茶油、玉米油、大豆油)經(jīng)分散萃取，用萃取液配制基質(zhì)標(biāo)樣，草銨膦為0.005～0.1 mg/L，草甘膦、氨甲基膦酸為0.01～0.2 mg/L，現(xiàn)用現(xiàn)配。

2 結(jié)果與討論

2.1 實(shí)驗(yàn)條件考察

2.1.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

首先采用針泵流動(dòng)注射連續(xù)進(jìn)樣的方式進(jìn)行質(zhì)譜全掃描檢測(cè)，得到被測(cè)化合物的一級(jí)質(zhì)譜圖，找出每個(gè)化合物對(duì)應(yīng)的母離子。然后進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描，得到相應(yīng)的子離子。每個(gè)化合物找出兩對(duì)特征離子，分別對(duì)碰撞能量和Q1和Q3兩個(gè)四極桿的偏轉(zhuǎn)電壓優(yōu)化，得到草銨膦、草甘膦和氨甲基膦酸的最佳質(zhì)譜參數(shù)，如表2所示。最后對(duì)毛細(xì)管電壓、霧化氣流量、加熱氣流量、Heat Block溫度、DL 管溫度、Interface溫度進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳離子源參數(shù)：毛細(xì)管電壓4.0 kV，霧化氣流量3.0 L/min，加熱氣流量10.0 L/min，Heat Block溫度400 ℃，DL 管溫度250 ℃，Interface溫度300 ℃。

表2 草銨膦、草甘膦、氨甲基膦酸的質(zhì)譜條件參數(shù)

2.1.2 液相條件的優(yōu)化

比較ACQUITY UPLC-C18柱、ACQUITY UPLC-T3柱和DikmaPolyamino氨基柱對(duì)草銨膦、草甘膦、氨甲基膦酸的分離效果，流動(dòng)相采用乙腈-乙酸銨-氨水溶液，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，C18柱和T3柱上沒(méi)有保留，峰型不好，有拖尾現(xiàn)象，因此C18柱和T3柱對(duì)草銨膦、草甘膦、氨甲基膦酸沒(méi)有分離作用。氨基柱在糖類等碳水化合物分析廣泛應(yīng)用，于是用它來(lái)分析，草銨膦、草甘膦、氨甲基膦酸在DikmaPolyamino氨基柱分離效果好，峰型尖銳對(duì)稱。

圖1 草銨膦、草甘膦、氨甲基膦酸在不同色譜柱上的色譜圖

比較乙腈-水、乙腈-乙酸銨溶液、乙腈-乙酸銨-氨水溶液3種流動(dòng)相體系，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，乙腈-乙酸銨-氨水溶液作為流動(dòng)相，草銨膦、草甘膦、氨甲基膦酸的峰型最好。經(jīng)過(guò)優(yōu)化得到最佳的液相條件：DikmaPolyamino氨基色譜柱，流動(dòng)相為pH=12的5 mmol/L乙酸銨-氨水溶液和乙腈梯度洗脫(洗脫程序見表1)。

圖2 草銨膦、草甘膦、氨甲基膦酸在不同流動(dòng)相上的色譜圖

2.1.3 前處理?xiàng)l件優(yōu)化

2.1.3.1 分散劑的選擇

理想的分散劑滿足兩個(gè)條件：①對(duì)樣品具有很好的溶解性，②對(duì)萃取劑和目標(biāo)物不相溶。筆者比較了丙酮、異丙醇和正己烷作為分散劑對(duì)植物油提取效果的影響。結(jié)果顯示，當(dāng)正己烷作為分散劑時(shí)，加入乙腈-水溶液離心后得到明顯的分層(結(jié)果未顯示)。因此，選擇正己烷作為分散劑。在保持萃取劑體積相同的情況下，考察分散劑體積分別為0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9和1.0 mL對(duì)提取效率的影響，結(jié)果如表3所示。

表3 分散劑體積對(duì)提取效率的影響

由表3可知：目標(biāo)物的提取率隨分散劑體積的增加而升高，0.5 mL以后達(dá)到穩(wěn)定，0.9 mL以后略微下降，于是選擇分散劑體積為0.5 mL。

2.1.3.2 萃取劑的選擇

當(dāng)分散劑確定以后，萃取劑對(duì)目標(biāo)物的提取效率起著非常重要的作用，萃取劑既要與目標(biāo)物有較好的溶解性，又要和分散劑不相溶。筆者將乙腈、甲醇和水按一定比例混合作為萃取劑進(jìn)行了比較。結(jié)果表明，當(dāng)使用乙腈-水(體積比1∶ 1)混合溶液作為萃取劑的提取效果最好，這可能是由于混合后溶劑極性的改變和流動(dòng)相相似性共同導(dǎo)致的。因此，最終以乙腈-水(體積比1∶ 1)混合溶液作為萃取劑。當(dāng)萃取劑為乙腈-水(體積比1∶ 1)混合溶液時(shí)，考察萃取劑體積分別為0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9和1.0 mL對(duì)提取效果的影響，結(jié)果如表4所示。由表4可知，隨著萃取劑體積的增加，提取效率不斷增加，當(dāng)萃取劑體積增加到0.8 mL以后，提取率無(wú)明顯提高?？紤]到稀釋倍數(shù)的問(wèn)題，于是選擇萃取劑體積為0.8 mL。

表4 萃取劑體積對(duì)提取效率影響

2.1.3.3 萃取時(shí)間的選擇

萃取時(shí)間對(duì)目標(biāo)化合物的提取效率有著不可忽視的影響，在萃取劑和分散劑保持一定的條件下，考察不同的萃取時(shí)間(10、20、30、40、50和60 s)對(duì)提取率的影響，結(jié)果見表5。由表5可知，當(dāng)萃取時(shí)間在30s以后，提取率達(dá)到穩(wěn)定，所以選擇30 s作為最佳萃取時(shí)間。

表5 萃取時(shí)間對(duì)提取率的影響

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 方法的檢出限、定量限、線性范圍

通過(guò)空白樣品不斷降低添加草銨膦、草甘膦、氨甲基膦酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度來(lái)確定檢出限(LOD)，當(dāng)達(dá)到3倍信噪比(S/N)時(shí)對(duì)應(yīng)的加標(biāo)濃度分別為0.01、0.02和0.02 mg/kg。通過(guò)空白樣品不斷降低添加標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度來(lái)確定定量下限(LOQ)，當(dāng)達(dá)到10倍信噪比(S/N)且回收率大于等于70%時(shí)對(duì)應(yīng)的加標(biāo)量分別為0.02、0.04和0.04 mg/kg。利用玉米油，大豆油和山茶油空白基質(zhì)配制的草銨膦、草甘膦、氨甲基膦酸標(biāo)準(zhǔn)曲線在0.005～0.1、0.01～0.2、0.01～0.2 mg/L范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程和相關(guān)系數(shù)見表6。

表6 不同基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程、相關(guān)系數(shù)

2.2.2 方法的準(zhǔn)確度與精密度

方法的準(zhǔn)確度通過(guò)空白樣品添加回收實(shí)驗(yàn)的回收率來(lái)考察，精密度通過(guò)同一濃度平行添加6次回收率的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)來(lái)獲得，分別以玉米油，大豆油和山茶油為對(duì)象進(jìn)行回收試驗(yàn)，加標(biāo)水平分別為1倍、5倍和10倍定量限，每個(gè)水平平行試驗(yàn)6次，結(jié)果如表7所示。由表7可知：平均回收率為73.2%～89.6%，精密度RSD值為4.86%～9.24%,符合GB/T27404—2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范基本信息食品理化檢測(cè)》中的回收率和精密度的要求。

表7 草銨膦、草甘膦、氨甲基膦酸的回收率和精密度(n=6)

2.3 實(shí)際樣品檢測(cè)

運(yùn)用上述方法對(duì)市場(chǎng)上隨機(jī)采購(gòu)的30份食用植物油進(jìn)行測(cè)定，其中花生油7份，大豆油6份，芝麻油3份，玉米油5份，山茶油6份，葵花油3份。草甘膦和草銨膦檢出樣品分別為3份(2份大豆油和1份山茶油)和1份(山茶油)，含量分別為0.043、0.053、0.106和0.064 mg/kg。與標(biāo)準(zhǔn)方法(GB 23200.108—2018，SN/T 1923—2007)相比，該方法簡(jiǎn)單、快速準(zhǔn)確。

3 結(jié)論

建立了分散液液萃取非衍生-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜快速檢測(cè)植物油脂中草銨膦、草甘膦和氨甲基膦酸的方法，采用正己烷作為分散劑，乙腈-水作為萃取劑，萃取分層后進(jìn)樣氨基色譜柱進(jìn)行分離，MRM監(jiān)測(cè)，基質(zhì)外標(biāo)法定量。該方法前處理簡(jiǎn)單，有機(jī)溶劑消耗量小，樣品無(wú)需使用酸堿試劑調(diào)節(jié)pH，無(wú)需衍生，快速準(zhǔn)確,可用于食用植物油中草銨膦、草甘膦和氨甲基膦酸快速測(cè)定，具有一定的推廣價(jià)值。