呼 和 蔣 飛 姬廣春 侯利民 喬 飛

脊髓栓系綜合征（tethered cord syndrome，TCS）多見于兒童或青少年，處于生長發(fā)育期的患兒往往會呈現(xiàn)進行性加重，嚴(yán)重者可導(dǎo)致腎功能衰竭。 目前多采用脊髓栓系松解術(shù)來防止神經(jīng)損傷進一步惡化，但對于已存在的神經(jīng)損傷基本無治療意義［1］。 因此，重建TCS 患兒的膀胱功能可能對治療兒童TCS 伴神經(jīng)源性膀胱功能障礙具有重要意義。

Channelrhodopsin-2（ChR2）作為一種感光性蛋白質(zhì)，來自于單細胞綠色藻類［2］。 在特定的光譜照射條件下，ChR2可快速形成光電流，使細胞發(fā)生去極化，引發(fā)興奮，從而實現(xiàn)對體內(nèi)神經(jīng)細胞的精準(zhǔn)調(diào)控［3］。 該技術(shù)目前已經(jīng)應(yīng)用于多個生理學(xué)研究領(lǐng)域，但在治療兒童TCS 伴發(fā)神經(jīng)源性膀胱功能障礙方面還未見報道［4］。 本研究通過動物實驗，將重組后的Ad-EGFP-ChR2腺病毒載體精確轉(zhuǎn)染至支配膀胱逼尿肌骶髓中間外側(cè)柱的副交感神經(jīng)核（sacral parasympathetic nucleus，SPN）內(nèi)，給予特定光譜照射刺激活化興奮SPN，模擬排尿中樞的神經(jīng)活動，旨在評估光感基因技術(shù)對修復(fù)TCS 伴神經(jīng)源性膀胱功能的可行性，為兒童TCS 伴神經(jīng)源性膀胱的臨床治療提供實驗理論基礎(chǔ)。

材料與方法

一、實驗材料

（一）實驗動物

實驗動物由中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物所提供，本研究共納入雌性大鼠46 只，體重（60 ±10）g，鼠齡4 周。 常規(guī)飼養(yǎng)1 周，飼養(yǎng)間室溫21℃～25℃，相對濕度40%～60%，供應(yīng)無菌飼料和無菌水并自由攝食、飲水，每日光照8 h，檢疫合格，實驗在倫理委員會動物指導(dǎo)協(xié)議下進行，建模前12 h禁食禁飲。 尿動力學(xué)檢查指標(biāo)（膀胱最大容量、逼尿肌漏點壓、殘余尿量）均無異常。 隨機分為健康對照組（15 只，僅作背部皮膚肌肉切開和縫合）、脊髓栓系有光感基因組（15 只，轉(zhuǎn)染光感基因ChR2）和脊髓栓系無光感基因組（16 只，未轉(zhuǎn)染光感基因ChR2）。

（二）主要試劑和儀器

10%水合氯醛溶液（中國人民解放軍陸軍總醫(yī)院，用于麻醉）；MP-150 生物機能實驗系統(tǒng)（美國泰德科技有限公司，用于尿動力學(xué)測定）；UVP 凝膠成像系統(tǒng)（美國UVP 公司，用于Western blot 檢測）；NGF 酶聯(lián)免疫（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒［中國寶生物工程有限公司，用于尿液中神經(jīng)生長因子（nerve growth factor，NGF）含量的定量分析］；NGFβ 一抗（中國寶生物工程有限公司，用于Western blot 檢測）；辣根過氧化物酶標(biāo)記的鼠抗兔二抗（中國寶生物工程有限公司，用于Western blot 檢測）。

二、實驗方法

（一）動物模型的建立

未成年雌性大鼠麻醉后沿背部腰骶正中打開椎管腔，剪開硬脊膜，顯露脊髓及終絲，將質(zhì)量為5 g的砝碼懸吊在終絲下縱向牽拉，使脊髓牽拉下移，人為造成脊髓組織變性壞死，引起神經(jīng)損害。 為形成永久性脊髓栓系，把下移的脊髓固定在椎管旁的組織上，然后縫合肌層及皮膚，后行尿流動力學(xué)檢測。 采用KEYPOINT 4M/4C 標(biāo)準(zhǔn)型肌電圖儀及多導(dǎo)誘發(fā)電位儀分別對所有動物進行術(shù)前、術(shù)后體感誘發(fā)電位（somatosensory evoked potential，SEP）檢測。 根據(jù)誘發(fā)電位學(xué)規(guī)律，建模后的動物與建模前相比SEP 波幅降低（不超過1/3），潛伏期延長（不超過2.5 ms）可認(rèn)為建模成功［5］。

（二）ChR2基因載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染

腺病毒載體Ad-EGFP-ChR2由中國科學(xué)院北京基因組研究所構(gòu)建。 將構(gòu)建成功的腺病毒載體Ad-EGFP-ChR2轉(zhuǎn)染至支配膀胱逼尿肌的骶髓中間外側(cè)柱內(nèi)的副交感神經(jīng)核，免疫熒光反應(yīng)觀察發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染組陽性細胞的胞體和突起有綠色熒光表達，表明腺病毒載體Ad-EGFP-ChR2轉(zhuǎn)染成功。

（三）藍光刺激

建立脊髓栓系神經(jīng)源性膀胱動物模型后，顯微鏡下用顯微器械切開腰骶段硬膜囊，根據(jù)定位坐標(biāo)值（脊髓正中兩側(cè)0.2 mm，深度0.5 mm）在雙側(cè)SPN 內(nèi)上中下各三點注射0.1 μL 的Ad-EGFP-ChR2腺病毒載體（病毒量為1.0 ×108單位），注射后留針10 min。 選擇合適大小的藍光LED 發(fā)光二極管縫合于切口，光源朝向硬膜囊，距離硬膜囊約2 mm 處將二極管與周圍肌肉筋膜縫合固定，因二極管較椎板減壓范圍大，借助剩余椎板的阻擋作用，從而避免二極管對脊髓的壓迫，可將發(fā)光二極管正負極置于皮下，以便與電源連接。 用電腦程序掌控二極管的發(fā)光頻率和節(jié)律。 每次持續(xù)15 min，每日重復(fù)3 次，照射至2 周（圖1）。

三、觀察指標(biāo)

（一）尿動力學(xué)測定

固定四肢及頭部，大鼠在無麻醉狀態(tài)下切開組織顯露膀胱，將頭皮針穿入膀胱穹窿處當(dāng)作膀胱測壓管，在穿刺處行漿肌層荷包縫合；膀胱測壓導(dǎo)管通過三通管一端與尿動力儀連接，另一端和微量灌注泵連接；生理鹽水灌注膀胱，通過MP-150 生物機能實驗系統(tǒng)觀察尿動力學(xué)變化的各項指標(biāo)（圖2）。

圖1 LED 藍光光源置入 圖2 尿動力學(xué)測定 A.MP150 生理信號分析系統(tǒng) B.BYZ-810 單通道注射泵 C.膀胱穿刺測尿動力Fig.1 LED blue light source placement Fig.2 Measurements of urinary dynamics

（二）神經(jīng)生長因子NGF 的測定

1. 尿中NGF 檢測方法 用離心管采集不同組間動物的尿液2 mL，離心8 min，溫度5℃，6 000 r/min，離心機離心后取上清液置于1.5 mL 凍存管中，-80℃保存。 尿液中NGF 含量通過ELISA 法測定。 NGF 酶聯(lián)免疫試劑盒由中國寶生物工程有限公司提供，具體操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進行，用每組樣本尿液中NGF 含量/尿肌酐值Cr 進行標(biāo)準(zhǔn)化［6］。

2. 膀胱組織NGF 蛋白的檢測 ①組織蛋白的提?。喝?0 mg 膀胱組織剪碎后置于RIPA 組織裂解液中并在冰上勻漿，充分裂解后將其置于5 ℃離心機15 000 r·min-1離心10 min，移去上清液； ②BCA 蛋白定量：檢測蛋白表達分別配制10%分離膠和5.0%的濃縮膠，將上樣樣品與緩沖液等體積混合，100℃加熱8 min 使蛋白變性。 將變性的蛋白用微量進樣器每孔加入10 μL，80 V 恒流電泳，之后在2 mA/m2恒定電流作用下進行轉(zhuǎn)膜。 通過上樣后濃縮膠與分離膠分別采用90 V、120 V 電壓進行電泳，電泳后200 mA 濕轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，將PVDF 膜用5%脫脂牛奶封閉過夜后，一抗NGFβ（1 ∶ 500，兔多克隆IgG） 室溫下放置2 h，清洗PVDF 膜，辣根過氧化物酶標(biāo)記的鼠抗兔二抗（1 ∶ 1 000） 室溫下放置1.5 h，清洗PVDF 膜，進行DBA 顯色反應(yīng)。 用凝膠成像分析系統(tǒng)分析圖像。

四、統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS18.0 軟件包進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以（±s）表示。 三組間計量資料的對比采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-Q 檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、尿動力學(xué)結(jié)果

與健康對照組比較，脊髓栓系無光感基因組膀胱容量減小，順應(yīng)性降低，逼尿肌漏點壓升高，殘余尿量增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。 脊髓栓系有光感基因組與脊髓栓系無光感基因組相比，膀胱最大容量增加，順應(yīng)性升高，逼尿肌漏點壓降低，殘余尿量減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。 脊髓栓系有光感基因組與健康對照組相比，尿動力學(xué)各項指標(biāo)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

二、不同組間尿液NGF、NGF/Cr 值的比較

與健康對照組相比，脊髓栓系無光感基因組NGF 含量、NGF/Cr 值均增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與脊髓栓系無光感基因組相比，脊髓栓系有光感基因組NGF 含量、 NGF/Cr 值均減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；脊髓栓系有光感基因組NGF 含量、NGF/Cr 值與健康對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

三、膀胱組織中NGF 蛋白表達結(jié)果

膀胱組織中NGF 蛋白表達的Western-blot 檢測結(jié)果顯示，脊髓栓系無光感基因組的蛋白表達量高于健康對照組（P＜0.05）；脊髓栓系有光感基因組與脊髓栓系無光感基因組相比，NGF 蛋白表達量降低（P＜0.05）；與健康對照組相比，脊髓栓系有光感基因組NGF 蛋白表達量無顯著性差異（P＞0.05）。見圖3。

表1 不同組間尿動力學(xué)指標(biāo)對比（±s）Table 1 Urodynamic parameters of three groups（±s）

表1 不同組間尿動力學(xué)指標(biāo)對比（±s）Table 1 Urodynamic parameters of three groups（±s）

注 與健康對照組相比：a 表示P ＜0.05，b 表示P ＞0.05；與脊髓栓系無光感基因組相比：c 表示P ＜0.05

組別膀胱最大容量（mL）逼尿肌漏點壓（cmH2O）殘余尿量（mL）順應(yīng)性（mL/ cmH2O）健康對照組1.28 ±0.12 22.67 ±1.25 0.021 ±0.019 0.0568 ±0.0124脊髓栓系無光感基因組0.58 ±0.03a 29.83 ±1.64a 0.342 ±0.028a 0.0021 ±0.0009a 0.0791 ±0.0138bc 脊髓栓系有光感基因組1.96 ±0.11bc 21.99 ±1.17bc 0.039 ±0.016bc

表2 不同組間尿液NGF、NGF/Cr 值的比較（±s）Table 2 Comparison of urine NGF and NGF/Cr values between different groups（±s）

表2 不同組間尿液NGF、NGF/Cr 值的比較（±s）Table 2 Comparison of urine NGF and NGF/Cr values between different groups（±s）

注 與健康對照組相比：a 表示P ＜0.05，b 表示P ＞0.05；與脊髓栓系無光感基因組相比：c 表示P＜0.05

NGF（pg/m）Cr（mmol/d）NGF/Cr健康對照組9.22 ±1.08 13.38 ±0.96 0.69 ±0.08脊髓栓系無光感基因組19.26 ±3.54a 3.81 ±0.23 5.05 ±0.42a脊髓栓系有光感基因組0.86 ±0.13bc 10.82 ±2.27bc 12.39 ±0.45

圖3 不同組間膀胱組織NGF 的表達情況Fig.3 Expression of NGF in bladder tissue between different groups

討 論

近年來對兒童TCS 誘發(fā)的神經(jīng)源性膀胱的治療多采用在間歇式導(dǎo)尿的基礎(chǔ)上聯(lián)合抗膽堿藥物及手術(shù)進行綜合治療的方法，但因無菌操作要求高，易產(chǎn)生耐藥性，術(shù)后并發(fā)癥較多，常不易被患兒及家屬接受。 骶神經(jīng)前根電刺激重建膀胱功能雖已運用于臨床，但尚未取得滿意療效［7］。 因此，探索新的方法治療兒童TCS 誘發(fā)的神經(jīng)源性膀胱功能障礙具有重要意義。

既往研究發(fā)現(xiàn)，將ChR2基因載體轉(zhuǎn)染至哺乳動物細胞后在保持細胞完整性的前提下可安全、穩(wěn)定、持久表達［8］。 Karl［9］成功將ChR2光感基因通過基因轉(zhuǎn)染技術(shù)轉(zhuǎn)入動物細胞內(nèi)，在特定波長的藍光刺激下使細胞興奮。 隨后，該技術(shù)在腦神經(jīng)回路研究方面被大量應(yīng)用。 本研究成功建立脊髓栓系動物模型，將構(gòu)建的腺病毒載體Ad-EGFP-ChR2轉(zhuǎn)染至未成年大鼠骶髓雙側(cè)SPN 內(nèi)。

尿動力學(xué)檢查被認(rèn)為是診斷兒童TCS 伴神經(jīng)源性膀胱臨床類型、評估嚴(yán)重程度的理想方法，進而為臨床治療提供客觀依據(jù)［10］。 有研究表明TCS患兒上尿路損害與逼尿肌順應(yīng)性降低、逼尿肌漏點壓升高、殘余尿量增多的關(guān)系均較為密切［11］。 本研究給予特定藍光照射，脊髓栓系有光感基因組的尿動力學(xué)指標(biāo)均接近于健康對照組，表明ChR2可以通過激活SPN 參與排尿中樞的神經(jīng)活動，進而改善膀胱功能。

在泌尿系統(tǒng)中，NGF 主要分布在膀胱上皮、黏膜下組織、平滑肌和神經(jīng)纖維，而尿液中NGF 主要由尿路上皮細胞和平滑肌細胞形成［12］。 Steers等［13］已通過動物實驗證實NGF 與膀胱功能存在直接的關(guān)系。 Allen 等［14］則通過動物模型證實，當(dāng)膀胱處于過度活動狀態(tài)時，其上皮及平滑肌細胞可釋放大量NGF。 與脊髓栓系無光感基因組相比，脊髓栓系有光感基因組中NGF 的表達量降低且接近于健康對照組。 因此可以認(rèn)為，藍光刺激轉(zhuǎn)染ChR2的SPN 后，會降低膀胱上皮組織NGF 表達。 同時與正常者相比，神經(jīng)源性膀胱患者尿液中NGF、NGF/Cr 水平顯著上升，且與癥狀的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)［15］。 我們通過ELISA 試驗進行不同組間尿液NGF、NGF/Cr 值的比較，發(fā)現(xiàn)脊髓栓系無光感基因組尿液NGF、NGF/Cr 值增加，而經(jīng)過一定藍光照射后，脊髓栓系有光感基因組尿液NGF、NGF/Cr 值降低，神經(jīng)源性膀胱的癥狀減輕。

綜上所述，本研究通過觀察未成年大鼠尿動力學(xué)指標(biāo)、膀胱組織NGF 的表達及尿液中NGF 的含量變化情況，進一步驗證了光感基因技術(shù)修復(fù)TCS伴神經(jīng)源性膀胱的可行性。