榮華 孫曉雪

由于人口老齡化趨勢愈加嚴(yán)重，老年性疾病問題十分突出，阿爾茨海默?。ˋlzheimer's disease，AD）是一種嚴(yán)重危害老年人健康的疾病，它屬于起病隱匿且病程緩慢的中樞神經(jīng)退行性疾病，與人類機體衰老有十分密切的關(guān)系，已成為繼腫瘤及心血管疾病之后危害老年人群健康最為嚴(yán)重的疾病以及造成死亡的原因[1]。現(xiàn)在針對AD 診斷，重要的病理特征表現(xiàn)為細胞外的老年斑及細胞內(nèi)的纖維纏結(jié)，并且在腦組織中積聚大量的Aβ-蛋白，從而破壞神經(jīng)突觸的完整性和可塑性，使突觸丟失及功能喪失[2，3]。癡呆早期明顯的病理表現(xiàn)主要是突觸的丟失，這說明它們之間有很大的關(guān)聯(lián)性，并且突觸發(fā)生損害同時也是記憶出現(xiàn)障礙的基礎(chǔ)[4]。目前為止，醫(yī)學(xué)上對AD 的治療效果并不理想，不僅不能從根本上達到治療疾病的效果，而且副作用較多。

通過現(xiàn)代藥理學(xué)研究得知，中藥石菖蒲有開竅豁痰、醒神益智、抗抑郁等作用，在臨床中被經(jīng)常用于AD、癲癇、腦中風(fēng)等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療[5]。其的主要成分為揮發(fā)油，而β-細辛醚是其中最主要的化學(xué)成分[6]。基于此，我們采用APP/PS1 雙轉(zhuǎn)基因小鼠模型，從突觸可塑性角度來進行研究，探討石菖蒲主要成分β-細辛醚對AD 的作用機制。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑β-細辛醚，天津一方科技有限公司（CAS：00011017-T9K）；鹽酸多奈哌齊（donepezil hydrchloride tablets，DHT）衛(wèi)材（中國）藥業(yè)有限公司（CAS：C14200012042）；PSD-95 一 抗，美 國Cell Signaling Technology 公司（CAS：3409T）。

1.1.1 動物 2月齡APP/PS1 雙轉(zhuǎn)基因小鼠40 只，C57BL/6 小鼠10 只，南京大學(xué)-南京生物醫(yī)藥研究院提供，生產(chǎn)許可證編號：SCK（蘇）2015-0001。

1.1.2 儀器設(shè)備 Stratagene Mx3005P 型實時熒光定量PCR（Real-time PCR）儀（美國Agilent 公司），S1000TM熱循環(huán)儀（美國Bio-Rad 公司），XPE504 型分析天平（瑞士Mettler Toledo 公司），AlphImagerTM圖像分析系統(tǒng)（美國Alphaimager 公司）。

1.2 分組及給藥隨機將轉(zhuǎn)基因小鼠分為模型組、鹽酸多奈哌齊組（0.33mg·kg-1·d-1），β-細辛醚低劑量組（25mg·kg-1·d-1）、高劑量組（50mg·kg-1·d-1），同時選擇C57BL/6 小鼠為空白對照組，與模型組給予等體積的生理鹽水，連續(xù)4 周。

1.2.1 行為學(xué)檢測 當(dāng)給藥周期結(jié)束后，應(yīng)用Morris水迷宮方法對實驗小鼠進行行為測試。直徑為150cm，高60cm 的圓形不銹鋼水池，內(nèi)置高40cm無色有機玻璃平臺。利用水迷宮的中心作為原點，在水池四周側(cè)壁上標(biāo)記東、西、南、北，作為進水點。將玻璃平臺放入水中，注水，池內(nèi)的水溫要求達到（22±1）℃，加入適量奶粉，使水呈乳白色，安全平臺要低于液面臺要求1cm，練習(xí)期間周圍環(huán)境要求保持安靜，參照物不能改變。

1.2.2 定位巡航實驗 實驗時間為期5d，4 次/d，選取東側(cè)作為入水點，自動攝像系統(tǒng)記錄小鼠尋找到水下平臺時間（逃避潛伏期），設(shè)定逃避潛伏期的時間為60s。

1.2.3 空間探索實驗 當(dāng)進行6d 定位航行實驗結(jié)束后，將玻璃平臺從乳白色水面移出，在相同進水點放入小鼠，記錄小鼠在沒有安全平臺的情況下尋找記憶中平臺的次數(shù)，設(shè)定時間為60s 內(nèi)小鼠跨越平臺位置的次數(shù)。

1.2.4 剛果紅染色檢測小鼠海馬CA3 區(qū)Aβ-淀粉酶沉積的變化 配置剛果紅染液：剛果紅0.5g，甲醇溶液80ml。石蠟組織切片脫蠟至水化，剛果紅染液室溫孵育30min，分化液分化數(shù)秒，沖洗，蘇木素復(fù)染2min，清水沖洗后進行梯度脫水，透明，封片，光學(xué)顯微鏡下觀察拍照。

1.2.5 免疫熒光標(biāo)記檢測小鼠海馬CA3 區(qū)PSD-95蛋白表達的變化 將冰凍的腦組織切片置于甲醇溶液中浸泡10min，滴加PBS 清洗液漂洗3 次，高壓修復(fù)2min 后冷卻至室溫，37℃條件下免疫血清孵育20min，滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗工作液，4℃過夜。次日，PBS 溶液沖洗切片后，滴加二抗工作液避光40min，封片，在熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.2.6 RT-PCR 檢測各組小鼠海馬PSD-95mRNA 的表達 給藥結(jié)束后，冰上迅速取出腦組織，快速定位海馬并進行剝離，將海馬組織剪成乳糜狀，按照比例要求，每50mg 海馬組織加入1ml 的TRIzon 試劑，使用移液器將液體吸入到預(yù)先高壓處理過的EP 管中。加入氯仿，每使用1ml 的TRIzon 試劑加入0.2ml的氯仿，劇烈震蕩20s，室溫放置3min。加入DEPC水30μl，使RNA 充分溶解，配制濃度為1%的瓊脂糖凝膠，吸取2μl RNA 樣品，加入1μl 的上樣緩沖液，混勻加入配好的瓊脂糖凝膠中進行電泳，鑒定所提取RNA 的純度及完整性。在冰上配制反應(yīng)體系試劑，按要求設(shè)置擴增條件：95℃ 30s；95℃ 5s；60℃ 31s；共40 個循環(huán)。引物序列如下：上游引物：5'-CACTGACAACCCGCACATC-3'；β-actin：上游引物：5'-TCAGGTCATCACTATCGGCAAT-3'；下游引物：5'-AAAGAAAGGGTGTAAAACGCA -3'。反應(yīng)結(jié)束后，進行數(shù)據(jù)的分析與處理，通過2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，計量資料以±s表示，兩組間用SNK 檢驗，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 β-細辛醚對APP/PS1 雙轉(zhuǎn)基因小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響藥物治療結(jié)束以后，通過水迷宮行為學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)，與空白對照組比較，模型組小鼠逃避潛伏期時間增加，對平臺的跨越次數(shù)減少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，鹽酸多奈哌齊組與β-細辛醚各劑量組小鼠逃避潛伏期時間明顯縮短，對平臺跨越的次數(shù)增多，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 各組小鼠逃避潛伏期和跨越平臺次數(shù)比較（±s）

表1 各組小鼠逃避潛伏期和跨越平臺次數(shù)比較（±s）

注：與空白對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

組別 n 逃避潛伏期（s） 跨越平臺次數(shù)（次）空白對照組 10 9.33±1.59 5.93±0.50模型組 10 56.73±4.15a 1.67±0.31a鹽酸多奈哌齊組 10 26.80±4.06b 4.13±0.12b β-細辛醚低劑量組 10 33.40±4.15b 3.27±0.31b β-細辛醚高劑量組 10 23.80±3.91b 5.07±0.23b

2.2 β-細辛醚對APP/PS1 雙轉(zhuǎn)基因小鼠海馬CA3區(qū)Aβ-淀粉沉積的影響藥物治療結(jié)束以后，應(yīng)用剛果紅染色法檢測每組小鼠海馬CA3 區(qū)Aβ-淀粉樣沉積的變化。結(jié)果顯示，與空白對照相比較，模型組小鼠海馬區(qū)Aβ-淀粉沉積明顯增多，與模型組比較，β-細辛醚高低劑量組均可降低Aβ-淀粉沉積，而高劑量組治療效果要好于低劑量組，且與陽性對照藥物鹽酸多奈哌齊作用相一致。見圖1。

圖1 各組小鼠海馬CA3 區(qū)Aβ-淀粉沉積變化

2.3 各組小鼠海馬CA3 區(qū)PSD-95 蛋白表達的變化給藥結(jié)束后，采用免疫熒光技術(shù)標(biāo)記突觸功能可塑性相關(guān)蛋白PSD-95，檢測β-細辛醚對蛋白的影響。結(jié)果顯示，與空白對照組比較，模型組小鼠海馬CA3 區(qū)的PSD-95 表達量降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；β-細辛醚低劑量組、β-細辛醚高劑量組、鹽酸多奈哌齊組與模型組相比較，表達量相對升高（P＜0.05），高劑量組作用效果好于低劑量組。見表2。

表2 各組小鼠海馬CA3 區(qū)PSD-95 表達（±s）

表2 各組小鼠海馬CA3 區(qū)PSD-95 表達（±s）

注：與空白對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

組別 n PSD-95空白對照組 10 1.00±0.01模型組 10 0.59±0.06a鹽酸多奈哌齊組 10 0.79±0.04b β-細辛醚低劑量組 10 0.70±0.05b β-細辛醚高劑量組 10 0.76±0.05b

2.4 各組小鼠海馬CA3 區(qū)PSD-95mRNA 的表達在結(jié)束4 周給藥治療后，與空白對照組比較，模型組小鼠海馬CA3 區(qū)PSD-95mRNA 表達下調(diào)，有顯著差異（P＜0.05）；與模型組比較，β-細辛醚低劑量、β-細辛醚高劑量、鹽酸多奈哌齊均能夠上調(diào)PSD-95mRNA 的表達，且高劑量組效果好于低劑量組（P＜0.05）。見表3。

表3 各組小鼠海馬區(qū)PSD-95mRNA 的表達（±s）

表3 各組小鼠海馬區(qū)PSD-95mRNA 的表達（±s）

注：與空白對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

組別 n PSD-95mRNA空白對照組 10 0.98±0.45模型組 10 0.45±0.10a鹽酸多奈哌齊組 10 0.73±0.11b β-細辛醚低劑量組 10 0.69±0.05b β-細辛醚高劑量組 10 0.71±0.05b

3 討論

老年癡呆癥在人步入老年期間出現(xiàn)，表現(xiàn)為癡呆癥狀的所有疾病，因此它的發(fā)生與年齡相關(guān)，多在50 歲以后起病。此病發(fā)病的主要臨床特征表現(xiàn)為記憶力減退，以及嚴(yán)重的認(rèn)知障礙，并將會伴有不可逆的行為及社交障礙。隨著病情加重會導(dǎo)致患者失去自主生活能力甚至?xí)韲?yán)重的并發(fā)癥而致死亡[7]。

近年來對AD 的研究，國內(nèi)外研究者提出諸多假說，研發(fā)出多種藥物應(yīng)用于臨床治療，但是到目前為止AD 發(fā)病機制并不十分明確，對于藥物治療效果也是差強人意。許多研究證實，在神經(jīng)系統(tǒng)中，細胞間的聯(lián)系主要是以突觸的傳遞作用為基礎(chǔ)，神經(jīng)元對信號的接受與處理功能需要借助突觸連接來實現(xiàn)，基于此它的損傷與缺失是影響認(rèn)知功能的重要神經(jīng)生物學(xué)因素之一[8，9]。神經(jīng)系統(tǒng)的可塑性在很大程度上是由突觸的形態(tài)結(jié)構(gòu)、數(shù)量以及功能狀態(tài)調(diào)節(jié)等方面決定的。

PSD-95 是突觸后膜骨架蛋白及突觸后致密物質(zhì)的主要成分，穩(wěn)定性非常高，它能夠?qū)⑿盘柗肿?、調(diào)節(jié)分子和靶分子聯(lián)系起來，參與突觸后膜受體的激活及下游信號的傳導(dǎo)，在神經(jīng)元對神經(jīng)傳導(dǎo)信號的應(yīng)答過程中發(fā)揮重要作用[10～12]，同時PSD-95 能夠接受和整合突觸信號并將其傳導(dǎo)給突觸后細胞，作為突觸后膜上的腳手架蛋白能夠維持突觸后膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，因此它在突觸可塑性中有重要作用，而且也成為突觸重建水平的重要檢測標(biāo)志[13]。

中醫(yī)認(rèn)為AD 的病位在腦?！侗静輦湟吩唬骸叭酥浶?，皆在腦中……凡人外見一物，必有一形影留于腦中……今人每記憶往事，必目上瞪而思索之，此即凝神于腦之意也[14]?！敝嗅t(yī)早就已經(jīng)認(rèn)識到腦具有記憶、思維、感知功能，AD 的發(fā)生是由于腦萎縮，大腦功能退化所致?！侗静輦湟吩唬骸袄先私⊥?，腦漸空也?！薄夺t(yī)林改錯》更是認(rèn)同“靈機記性在腦”、“腦氣虛，腦縮小”、“高年無記性者，腦髓漸空[15]”。自古以來石菖蒲作為醒腦開竅類佳品，是應(yīng)用于腦部疾病的中藥方劑中出現(xiàn)頻率非常之高的藥物。近些年來，石菖蒲的化學(xué)成分、藥理研究、臨床應(yīng)用等方面也有較系統(tǒng)的研究。

石菖蒲含揮發(fā)油（0.01%～2.15%）及糖類、機酸、氨基酸等。揮發(fā)油中含34 種成分，主要為β-細辛醚63.2%～81.2%、α-細辛醚3.4%～13.7%，其次為石竹、α-葎草烯、石菖醚、細辛醛等[16]。許多實驗研究表明石菖蒲揮發(fā)油的有效成分有促進學(xué)習(xí)記憶的作用[17]。石菖蒲具有益智健腦、抗抑郁等作用，醫(yī)學(xué)界經(jīng)常用它治療神魂癲癇、健忘、耳聾等神經(jīng)系統(tǒng)疾病[18，19]。

本研究采用APP/PS1 雙轉(zhuǎn)基因小鼠作為研究對象，通過水迷宮實驗來檢測石菖蒲有效成分β-細辛醚對各組小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響。實驗結(jié)果顯示，模型組小鼠尋找跨越安全平臺次數(shù)明顯減少，與此同時逃避潛伏期的時間有所增加，而β-細辛醚組癡呆小鼠這種反應(yīng)遲鈍的行為有所改善，小鼠跨越平臺的次數(shù)明顯增多，逃避潛伏期的時間有一定的縮短，顯著提高小鼠學(xué)習(xí)記憶能力，說明β-細辛醚能夠改善癡呆模型小鼠相似于AD 患者出現(xiàn)的行為學(xué)癥狀。剛果紅染色檢測得出結(jié)果提示，β-細辛醚可以降低小鼠腦中Aβ-淀粉樣沉積，說明β-細辛醚可以緩解Aβ-淀粉酶誘導(dǎo)的突觸可塑性功能障礙，并且能夠在突觸功能維持和改善中發(fā)揮一定的保護作用。

本研究發(fā)現(xiàn)β-細辛醚通過調(diào)節(jié)神經(jīng)突觸可塑性重要蛋白PSD-95 表達的變化，進而進一步研究藥物治療AD 的作用機制。通過免疫熒光結(jié)果可知，與空白對照組比較，模型組小鼠PSD-95 的蛋白表達相對降低，與模型組比較，β-細辛醚高劑量組更能明顯升高轉(zhuǎn)基因小鼠海馬區(qū)PSD-95 的蛋白表達。RT-PCR 檢測結(jié)果顯示，β-細辛醚能夠上調(diào)小鼠海馬區(qū)PSD-95mRNA 的表達，進一步達到穩(wěn)定突觸連接，改善突觸可塑性，恢復(fù)信號相關(guān)傳遞的功能。由此可以推斷，β-細辛醚通過調(diào)節(jié)小鼠神經(jīng)突觸可塑性相關(guān)功能蛋白PSD-95 的變化來發(fā)揮抗AD 的作用，同時本研究也為尋找防治AD的新作用靶點的藥物提供理論研究基礎(chǔ)。