張 敏 涂宗財 王 輝 劉 俊 胡月明

(1. 南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047；2. 江西師范大學(xué)國家淡水魚加工技術(shù)研發(fā)專業(yè)中心，江西 南昌 330022；3. 江西師范大學(xué)江西省淡水魚高值化利用工程技術(shù)研究中心，江西 南昌 330022)

食物過敏是常見的免疫系統(tǒng)疾病，由食物中的主要過敏原引起，包括大豆、牛奶、魚類等，主要癥狀有哮喘、蕁麻疹、腹瀉等，嚴(yán)重時會引起過敏性休克。隨著魚類養(yǎng)殖面積和消費(fèi)量的不斷增加，因食用魚類過敏反應(yīng)也日益嚴(yán)重[1]。在美國，約有0.4%的成人和0.1%的兒童因食用魚類而產(chǎn)生過敏[2]；在摩洛哥，自述食物過敏發(fā)生率中兒童(28.2%)遠(yuǎn)高于成人(16.8%)[3]；在中國，自述因食用魚類過敏的患病率約為0.20%～2.29%，其中約有95%以上魚類過敏患者的IgE抗體會與多種魚類產(chǎn)生交叉反應(yīng)[4]。

魚類的主要過敏原是小清蛋白(parvalbumin，PV)，其是維持細(xì)胞內(nèi)Ca2+交換的酸性蛋白，分子量約為10.5～12.2 kDa，等電點(diǎn)約為3.9～5.5[5]。國內(nèi)外在降低PV致敏性方面也做了大量研究，包括糖基化[6]、磷酸化[7]、發(fā)酵[8]等改性手段，其中糖基化改性是降低其過敏原致敏性較為有效的方法。糖基化是碳水化合物與蛋白質(zhì)中α或ε-氨基共價結(jié)合形成糖蛋白的過程[9]，該反應(yīng)不需催化劑、加熱會產(chǎn)生特殊的色、香、味，常被用于食品加工過程中。李錚[10]對草魚PV進(jìn)行糖基化改性后發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)物的抗原性得到了有效降低；Jongh等[11]研究糖基化對鱈魚PV的IgE結(jié)合力的影響，發(fā)現(xiàn)其IgE結(jié)合力明顯減弱；Zhao等[6]研究發(fā)現(xiàn)重組PV經(jīng)糖基化修飾后其IgG/IgE也顯著下降。

但目前關(guān)于過敏性的檢測都是體外檢測，糖基化蛋白進(jìn)入人體后，需要經(jīng)過胃和腸消化后才能被人體吸收，而蛋白質(zhì)在整個消化過程中，胃蛋白酶和胰蛋白酶會通過酶切作用使蛋白質(zhì)本身的結(jié)構(gòu)被破壞，可能會使消化產(chǎn)物的致敏性發(fā)生改變。阿拉斯加狹鱈具有肉質(zhì)細(xì)嫩、口感細(xì)膩等特點(diǎn)，受到廣大消費(fèi)者的喜愛。然而糖基化鱈魚PV經(jīng)胃腸道消化后致敏性的變化鮮有報道。團(tuán)隊前期研究不同還原糖(葡萄糖、果糖、核糖、乳糖、半乳糖)與PV反應(yīng)后其IgE和IgG結(jié)合能力的變化，發(fā)現(xiàn)核糖與PV反應(yīng)后產(chǎn)物的IgE/IgG結(jié)合能力降低程度最大。因此，試驗(yàn)擬選擇核糖對PV進(jìn)行糖基化改性，采用間接競爭ELISA法研究糖基化鱈魚PV在體外模擬消化過程中致敏性的變化，利用高效液相色譜和光譜學(xué)技術(shù)分析消化產(chǎn)物分子量和結(jié)構(gòu)的變化，揭示糖基化鱈魚PV在消化過程中致敏性與結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律，以期為低致敏性蛋白在人體消化過程中的安全評估提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

阿拉斯加狹鱈PV：純度91.36%，實(shí)驗(yàn)室自制；

魚類過敏患者IgE血清：美國PlasmaLab International公司；

兔抗PV的IgG血清：實(shí)驗(yàn)室自制；

HRP標(biāo)記羊抗人IgE、HRP標(biāo)記羊抗兔IgG抗體：美國Biocheck Inc公司；

D-核糖、4-(2-氨乙基)苯磺酰氟鹽酸鹽：分析純，上海阿拉丁生化科技有限公司；

胃蛋白酶：100 U/mg，北京索萊寶公司；

胰蛋白酶：250 U/mg，北京索萊寶公司；

其他材料均為分析純。

1.1.2 過敏患者血清池

過敏患者血清池由10個鱈魚過敏患者的血清(P1～P10)組成，其基本信息如表1所示。

表1 魚類過敏患者病史

1.1.3 主要儀器設(shè)備

冷凍干燥機(jī)：LGJ-1D-80型，北京亞泰科隆儀器技術(shù)有限公司；

酶標(biāo)儀：Synergy H1型，美國伯騰儀器有限公司；

高速冷凍離心機(jī)：GL-20G-II型，上海安亭科學(xué)儀器廠；

熒光光譜儀：F-7000型，日本Hitachi公司；

高效液相色譜儀：Primaide型，日本Hitachi公司；

垂直電泳儀：MP4型，美國Bio-Rad公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品制備 稱取PV后用超純水溶解并調(diào)整其濃度為5 mg/mL，以核糖∶PV質(zhì)量比1.5∶1.0混勻后凍干。在65%的飽和NaCl溶液下60 ℃反應(yīng)1 h，冰浴終止、透析凍干后得到糖基化樣品，記作PV-Rib。

1.2.2 模擬人體胃腸道消化 參考沙小梅等[12]的方法稍作修改。用0.5 mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)溶液pH至2.0，按酶與樣品質(zhì)量比1∶50加入胃蛋白酶，震蕩酶解1 h后用NaHCO3溶液調(diào)節(jié)pH至7.0，按酶與底物質(zhì)量比1∶25加入胰蛋白酶，分別震蕩酶解1，2 h，用4-(2-氨乙基)苯磺酰氟鹽酸鹽終止反應(yīng)。其中PV和PV-Rib經(jīng)胃消化1 h、胃腸消化2 h、胃腸消化3 h的產(chǎn)物分別記作G-PV-1 h、GI-PV-2 h、GI-PV-3 h、G-PV-Rib-1 h、GI-PV-Rib-2 h和GI-PV-Rib-3 h。

1.2.3 消化率測定 參照Naourez Ktari等[13]的方法，通過測定PV自由氨基含量的變化來反映產(chǎn)物的消化率。

自由氨基的測定參照宋啟東等[14]的方法，消化率的計算公式：

(1)

式中：

DH——消化率，%；

OD0——消化后樣品的吸光值；

OD1——未消化樣品的吸光值；

A——賴氨酸的自由氨基數(shù)，mg/mL；

K——標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率；

MW——賴氨酸的分子量，g/mol；

b——消化液的濃度，mg/mL。

1.2.4 IgE和IgG結(jié)合能力的測定

(1) IgE結(jié)合能力：采用間接競爭ELISA法測定糖基化PV消化后IgE結(jié)合能力的變化，產(chǎn)物的IgE結(jié)合能力用抑制率來表示，抑制率越低則結(jié)合能力越低[15]。在96孔板上加入100 μL 4 μg/mL的抗原，37 ℃孵育1 h；加入250 μL 2%的BSA封閉液，37 ℃孵育2 h；加入50 μL樣品(4 μg/mL)后再加入50 μL IgE一抗(1∶500)，37 ℃孵育1 h；加入100 μL酶標(biāo)二抗(1∶600)，37 ℃孵育1h；加入100 μL TMB顯色液，37 ℃避光孵育15 min；最后加入100 μL 2 mol/L H2SO4終止液，在450 nm/630 nm雙波長下讀取其吸光值。按式(2)計算抑制率。每個樣品做3個平行取平均值。

(2)

式中：

w——抑制率，%；

B——添加競爭性抗原后樣品的吸光值；

B0——不添加競爭性抗原樣品的吸光值。

(2) IgG結(jié)合能力：糖基化PV消化后IgG結(jié)合能力測定方法同IgE結(jié)合能力測定，一抗稀釋度為1∶800，二抗稀釋度為1∶5 000。

1.2.5 分子量測定

(1) SDS-PAGE：采用12%分離膠和5%濃縮膠，1×上樣緩沖液，上樣量為10 μL，超低分子量Marker。初始電壓為80 V進(jìn)入分離膠后調(diào)整為100 V，取下后用考馬斯亮藍(lán)R250染色15 min，脫色至背景清晰。

(2) HPLC：參照GB 31645—2018，將樣品稀釋至1 mg/mL后用0.22 μm濾膜過濾。用5%的B相平衡規(guī)格為4.6 mm×250 mm的凝膠色譜柱，樣品的洗脫條件為進(jìn)樣量10 μL；流速0.5 mL/min；柱溫45 ℃；波長220 nm。利用流動相配制相同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品：細(xì)胞色素C(MW12 384 Da)、抑肽酶(MW6 511.51 Da)、谷胱甘肽(MW612.63 Da)、羥脯氨酸(MW131.13 Da)，過0.22 μm濾膜后上樣。

1.2.6 熒光光譜測定

(1) 內(nèi)源熒光：參照Kim等[16]的方法，用蒸餾水配制1 mg/mL樣品，用熒光光譜儀測定。掃描速率1 200 nm/min，激發(fā)波長295 nm，發(fā)射波長掃描范圍為200～600 nm，狹縫寬度5 nm。

(2) 同步熒光：用蒸餾水配制1 mg/mL樣品，用熒光光譜儀測定。Δλ分別為15，60 nm，其他條件同內(nèi)源熒光測定。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)采用3次平行試驗(yàn)“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示，利用IBM SPSS 21.0和GraphPad Prism 8軟件對數(shù)據(jù)、圖像進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 自由氨基含量

糖基化前后PV消化率的變化如圖1所示。PV-Rib的消化率顯著低于PV，隨著消化時間的延長，PV與PV-Rib的消化率不斷增加，在G-1 h和GI-2 h時增長速率最快，并于GI-3 h時達(dá)到最大。說明經(jīng)糖基化改性后PV的胃和腸消化率均出現(xiàn)下降，可能是胰蛋白酶能對賴氨酸和精氨酸的羧基端肽鍵進(jìn)行特異性水解，而糖基化可通過修飾PV的賴氨酸和精氨酸殘基，使這些殘基無法被胰蛋白酶識別[12]。目前也有研究[17-19]表明經(jīng)糖基化修飾后乳清蛋白、乳球蛋白、酪蛋白的消化性均出現(xiàn)下降，且下降程度與蛋白特性和還原糖種類有關(guān)。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.2 IgE和IgG結(jié)合能力

PV和PV-Rib消化后IgE/IgG結(jié)合能力的變化如圖2所示。PV-Rib的IgE/IgG結(jié)合能力顯著低于PV，在二者的消化產(chǎn)物中也觀察到同樣的變化。在消化過程中PV和PV-Rib的IgE/IgG結(jié)合能力出現(xiàn)明顯下降，其中G-1 h下降趨勢最快，分別降低了42.86%，36.36%和53.42%，30.36%，在GI-2 h時達(dá)到最低并在GI-3 h時略有上升，但遠(yuǎn)低于消化前。由此可見胃蛋白酶對PV和PV-Rib過敏表位的破壞較為明顯，同樣的結(jié)果也在幾種淡水魚小清蛋白的消化產(chǎn)物中被發(fā)現(xiàn)[20]。糖基化能通過掩蓋或破壞蛋白質(zhì)分子上的過敏表位來降低其致敏性[21]，參與胃腸道消化的蛋白酶也可以通過酶切作用破壞蛋白質(zhì)的過敏表位，但隨著消化時間的延長可能會由于蛋白酶的過度酶切使部分過敏表位被暴露，導(dǎo)致產(chǎn)物的致敏性增加。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.3 SDS-PAGE

PV和PV-Rib消化產(chǎn)物的SDS-PAGE如圖3所示，對比泳道1，泳道2的蛋白條帶出現(xiàn)了明顯上移；對比泳道4、6、8，泳道3、5、7的蛋白條帶明顯較多，泳道5～8的蛋白條帶有了明顯的降解；對比泳道1、2，泳道3、4出現(xiàn)了分子量較大的條帶。糖基化反應(yīng)中，PV與核糖發(fā)生共價交聯(lián)后分子量會有一定的增加，表現(xiàn)出PV-Rib蛋白條帶的上移。但在消化過程中，加入的胃蛋白酶未被完全分解，在SDS-PAGE中表現(xiàn)出新的條帶，由于蛋白酶的存在大分子蛋白質(zhì)被降解，隨著消化時間的延長，逐漸被消化成為小分子多肽甚至游離氨基酸，不易在SDS-PAGE中被觀察到，且分子量較小的腸消化產(chǎn)物(<3 kDa)容易在凝膠上浸出，為了明確消化產(chǎn)物的分子量分布進(jìn)行了高效液相色譜試驗(yàn)。

M. Marker 1. PV 2. PV-Rib 3. G-PV-Rib-1 h 4. G-PV-1 h5. GI-PV-Rib-2 h 6. GI-PV-2 h 7. GI-PV-Rib-3 h 8. GI-PV-3 h

圖4 PV和PV-Rib消化產(chǎn)物的高效液相圖譜

2.4 高效液相色譜

以標(biāo)準(zhǔn)品分子量的對數(shù)(lgMW)為橫坐標(biāo)，以保留時間(RT)為縱坐標(biāo)作線性分析，擬合后得到的方程為：RT=-4.252 6 lgMW+28.128(R2=0.994 7，P<0.05)，相關(guān)性良好。PV和PV-Rib消化產(chǎn)物的高效液相圖譜如圖4所示。與PV相比，PV-Rib的出峰時間從11.05 min提前到10.47 min，峰強(qiáng)有所降低；PV和PV-Rib的消化產(chǎn)物在11.05 min和10.47 min處的主峰強(qiáng)度逐漸減弱，出峰時間不斷延長，并產(chǎn)生了一系列新的洗脫峰。說明核糖與PV發(fā)生共價交聯(lián)后產(chǎn)物的分子量增加，出峰時間提前，峰強(qiáng)降低。消化過程中，PV和PV-Rib隨著消化時間的延長不斷被蛋白酶分解，于是出現(xiàn)強(qiáng)度不一的新峰，這也與SDS-PAGE的結(jié)果一致。

PV和PV-Rib經(jīng)消化產(chǎn)物的分子量分布如圖5所示，肽段的含量用肽段組分的面積與所有峰面積的比值來表示，按分子量大小將其分為>9 000，7 000～9 000，5 000～7 000，3 000～5 000，1 000～3 000，500～1 000，< 500 Da 7個范圍。分析發(fā)現(xiàn)PV和PV-Rib經(jīng)胃消化1 h后>9 000 Da的肽段分別降低了40.0%和31.0%，1 000～3 000 Da的肽段分別增加了13.0%和13.5%；經(jīng)胃腸道消化2 h后5 000～9 000 Da肽段基本消失；<500 Da肽段的數(shù)量先增加后降低。這表明分子量>9 000 Da的肽段對胃蛋白酶的抗消化能力較弱，5 000～9 000 Da的肽段對胰蛋白酶的抗消化能力較弱；在胃蛋白酶作用下產(chǎn)生的<500 Da肽段在胰蛋白酶的作用下重新聚合[22]。分子量<3.5 kDa的肽段一般不具有免疫反應(yīng)性，但試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PV和PV-Rib經(jīng)消化后仍保持一定的致敏性，在GI-3 h甚至出現(xiàn)了增加，可能也與<500 Da小分子肽段的重新聚合有關(guān)。糖基化PV被酶解后分子上的抗原表位被破壞，但依舊有部分線性表位存在，隨著小分子肽段的重新聚合，可能又形成了含有某些抗原決定簇的氨基酸序列[23]。

圖5 PV和PV-Rib消化產(chǎn)物的分子量分布

2.5 內(nèi)源熒光

PV和PV-Rib消化產(chǎn)物的內(nèi)源熒光光譜如圖6所示。消化前PV的發(fā)射波長在300 nm附近，PV-Rib的發(fā)射波長出現(xiàn)紅移，消化后PV和PV-Rib在348 nm處有新發(fā)射峰，其強(qiáng)度隨消化時間的延長先降低后升高。有所不同的是，PV消化產(chǎn)物的發(fā)射波長均出現(xiàn)紅移，且消化時間與紅移程度呈正相關(guān)，而PV-Rib只有在新發(fā)射峰處出現(xiàn)了紅移，在300 nm處卻出現(xiàn)藍(lán)移。這些結(jié)果表明糖基化后PV的Tyr殘基所處微環(huán)境的親水性增加，在消化過程中PV與PV-Rib肽鏈的結(jié)構(gòu)展開使內(nèi)部的Trp殘基逐漸被暴露，PV-Rib部分消化產(chǎn)物Tyr殘基的疏水性增加[24]，肽段的重新聚合使二者產(chǎn)物的Trp殘基逐漸被掩埋。說明糖基化PV致敏性下降主要是由于核糖對其抗原表位的修飾作用，而消化可進(jìn)一步破壞其構(gòu)象表位，隨消化時間的延長線性表位也不斷減少，但其仍保持一定致敏性，說明小分子短肽的特殊序列依然會使機(jī)體對蛋白過敏。

圖6 PV和PV-Rib消化產(chǎn)物的內(nèi)源熒光光譜

2.6 同步熒光

PV和PV-Rib消化產(chǎn)物的同步熒光光譜如圖7所示。消化后PV和PV-Rib的Tyr和Trp的熒光強(qiáng)度都出現(xiàn)降低，二者均出現(xiàn)了新的發(fā)射峰，發(fā)射波長也出現(xiàn)了紅移；隨著消化時間的延長，Tyr的熒光強(qiáng)度逐漸降低，Trp的熒光強(qiáng)度先增加后降低。消化過程中，PV和PV-Rib的消化產(chǎn)物中Tyr和Trp的微環(huán)境發(fā)生了變化，并產(chǎn)生了從Tyr到Trp殘基的能量轉(zhuǎn)移[25]，可能是在消化過程中蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的展開使Tyr和Phe的貢獻(xiàn)減少[26]；PV和PV-Rib分子中的Tyr殘基對胃腸道的消化更為敏感，可能與氨基酸的極性有關(guān)[27-28]。這些結(jié)果也與分子量、致敏性和內(nèi)源熒光的研究結(jié)果一致，表明糖基化和消化都能顯著改變PV的構(gòu)象，通過修飾和破壞其抗原表位來降低PV的致敏性，也進(jìn)一步說明了糖基化結(jié)合胃腸道消化是降低鱈魚PV致敏性較為有效的方法。

圖7 PV和PV-Rib消化產(chǎn)物的同步熒光光譜

3 結(jié)論

糖基化鱈魚小清蛋白經(jīng)體外模擬消化后發(fā)現(xiàn)，胃消化1 h后產(chǎn)物的IgE和IgG結(jié)合能力降低速率最快，胃腸消化2 h時最低，3 h略有增加，消化性也出現(xiàn)降低；胃蛋白酶酶解產(chǎn)生的分子量<500 Da的肽段在胰蛋白酶的作用下會重新聚集；產(chǎn)物均產(chǎn)生了新的發(fā)射峰和紅移，發(fā)射峰的熒光強(qiáng)度呈先降低后增加趨勢。這表明糖基化改性結(jié)合體外模擬消化可有效降低鱈魚小清蛋白的致敏性。但消化吸收過程中蛋白質(zhì)的過敏表位會發(fā)生顯著變化以及消化產(chǎn)物會引起機(jī)體在致敏與激發(fā)階段的免疫系統(tǒng)變化還需要進(jìn)一步研究。