于 靖 楊錫洪,2 梁 晨 郁東興 解萬翠,2,

(1. 青島科技大學(xué)海洋科學(xué)與生物工程學(xué)院，山東 青島 266042；2. 山東省生物化學(xué)工程重點實驗室，山東 青島 266042；3. 青島智科檢驗檢測有限公司，山東 青島 266002；4. 尚好科技有限公司，山東 青島 266002)

傳統(tǒng)發(fā)酵型海鮮調(diào)味品如魚露、蝦醬等是由低值魚蝦蟹貝藻等經(jīng)由鹽漬、發(fā)酵等工藝加工制成[1]，味道鮮美，呈味成分豐富多樣，富含多種呈味氨基酸如甘氨酸、谷氨酸、精氨酸和天門冬氨酸等，以及多肽、低聚糖和?；撬岬榷喾N保健性成分[2]，具有很大的發(fā)展前景及開發(fā)價值。但傳統(tǒng)發(fā)酵過程中過高的鹽度和自然溫度導(dǎo)致發(fā)酵周期長、產(chǎn)量低、成本高、不利于規(guī)?；a(chǎn)等弊端，因此，一些現(xiàn)代速釀技術(shù)如低鹽保溫工藝、外加酶法與外加曲法等成為近年來研究的重點方向。雖然速釀技術(shù)能顯著縮短發(fā)酵進程，減少產(chǎn)物的含鹽量和腥臭味，但快速發(fā)酵的產(chǎn)品風(fēng)味難以與傳統(tǒng)工藝媲美。因此，在縮短發(fā)酵周期的基礎(chǔ)上盡可能模擬傳統(tǒng)產(chǎn)品風(fēng)味，是當(dāng)前海鮮調(diào)味品速釀技術(shù)研究的熱點問題。

傳統(tǒng)發(fā)酵海鮮調(diào)味料的風(fēng)味主要來源于微生物的發(fā)酵，通過微生物間的作用使最初的原料轉(zhuǎn)化為發(fā)酵過程中的蛋白質(zhì)、脂肪等物質(zhì)，在一系列復(fù)雜化學(xué)反應(yīng)中豐富產(chǎn)品風(fēng)味。隨著從各類海鮮調(diào)味品中分離出越來越多的微生物，研究者們發(fā)現(xiàn)海鮮調(diào)味品的速釀技術(shù)可以通過一些性能優(yōu)良的嗜鹽菌株進行改良。Saithong等[3]在自然發(fā)酵的魚制品中分離到2種乳酸菌，能夠顯著縮短發(fā)酵周期，Yossan等[4]研究發(fā)現(xiàn)，在發(fā)酵魚醬油中篩選出的巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)，能夠產(chǎn)生堿性蛋白酶，促進風(fēng)味物質(zhì)前體氨基酸的轉(zhuǎn)化，從而豐富產(chǎn)品醇香鮮美的口感。可見，嗜鹽微生物分泌的蛋白酶、肽酶、堿性磷酸酶等不僅能夠促進原料底物進行分解及生物轉(zhuǎn)化，顯著縮短發(fā)酵周期，還能將肽和寡肽轉(zhuǎn)化為前體氨基酸從而形成海鮮調(diào)味品特有的風(fēng)味物質(zhì)，有利于海鮮調(diào)味品鮮美醇香氣味的形成。文章擬介紹嗜鹽微生物在海鮮調(diào)味快速發(fā)酵及風(fēng)味形成中的應(yīng)用，從氨基酸代謝和基因調(diào)控層面闡明嗜鹽菌對速釀產(chǎn)品風(fēng)味影響機理，以期為海鮮調(diào)味品現(xiàn)代化加工技術(shù)提供新的指導(dǎo)思路。

1 傳統(tǒng)海鮮調(diào)味品的發(fā)酵風(fēng)味特征

常見的海鮮調(diào)味品包括魚醬、蝦醬、蟹醬、魚露、蝦油、蠔油等，以海洋資源為原料，利用自身的酶或微生物通過一定的周期自然發(fā)酵而成。海鮮調(diào)味品發(fā)酵過程中，微生物能夠利用其產(chǎn)生的胞內(nèi)及胞外酶類加速原料底物的分解和生物轉(zhuǎn)化，同時產(chǎn)生多肽、呈味氨基酸等多種利于良好風(fēng)味形成的成分，以及各種揮發(fā)性和非揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)共同組成的復(fù)雜化合物體系。

1.1 感官特征及特征性風(fēng)味化合物

水產(chǎn)調(diào)味品品質(zhì)的重要決定因素是其風(fēng)味，明確風(fēng)味物質(zhì)的組成對調(diào)控與保持產(chǎn)品風(fēng)味十分必要。在海鮮調(diào)味品發(fā)酵過程中，微生物與酶之間會在原料組分中相互作用，通過小分子物質(zhì)的形成進而左右成品的風(fēng)味，因此發(fā)酵工藝與產(chǎn)地不同而引起的揮發(fā)性物質(zhì)組成差異使其形成了各自的風(fēng)味特征。

醇類是海鮮調(diào)味品中主要揮發(fā)性物質(zhì)之一，主要由多不飽和脂肪酸經(jīng)脂肪酸氧化酶作用衍生而來[5]，是海鮮調(diào)味品植物香、肉香味和溫和油脂味的主要來源[6]。趙洪雷等[7]在探究不同產(chǎn)地蝦醬風(fēng)味差異時發(fā)現(xiàn)，作為亞油酸降解產(chǎn)物的1-辛烯-3-醇，呈現(xiàn)草香味和蘑菇香氣，苯乙醇呈蜂蜜香和微略的玫瑰香。由不飽和脂肪酸氧化產(chǎn)生的醛類物質(zhì)，閾值較低，因此在發(fā)酵水產(chǎn)調(diào)味品風(fēng)味特征中發(fā)揮重要作用[8]，主要產(chǎn)生油燒味，但其中苯甲醛和苯乙醛具有堅果香、水果香和令人愉悅的風(fēng)信子香等獨特香氣[9]，3-甲硫基丙醛具有肉香和馬鈴薯香。酮類的香氣閾值遠高于其同分異構(gòu)體的醛類物質(zhì)，由于其具有獨特的花香和果香味，對海鮮調(diào)味品風(fēng)味有一定增強作用[10]。李瑩等[11]在分析傳統(tǒng)錦州白蝦蝦醬揮發(fā)性物質(zhì)時發(fā)現(xiàn)，2-壬酮呈有焦糖香和脂肪味，3-辛酮呈有水果香和略微的薰衣草氣味，香葉基丙酮呈現(xiàn)蠟味、木香味和果香味。含硫類化合物能夠賦予產(chǎn)品堅果香、果蔬香、烘烤香和肉類香氣，二甲基二硫與二甲基三硫主要具有洋蔥香等蔬菜香氣，是海鮮發(fā)酵調(diào)味料的特征風(fēng)味物質(zhì)。由脂肪氧化產(chǎn)物參與美拉德反應(yīng)得到的吡嗪類物質(zhì)，主要呈現(xiàn)堅果香和烘烤香味，Hou等[12]發(fā)現(xiàn)，吡嗪類既是醬類產(chǎn)品的特征性風(fēng)味物質(zhì)，也是鮮蝦肉中主要的風(fēng)味物質(zhì)，可以賦予蝦醬產(chǎn)品濃厚的醬香味和鮮味。

傳統(tǒng)海鮮調(diào)味品開放式的自然發(fā)酵難以準確控制產(chǎn)品品質(zhì)和風(fēng)味，這是影響產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定的主要障礙，而現(xiàn)代發(fā)酵工藝得到的產(chǎn)品又往往存在風(fēng)味不足的缺陷。因此，為實現(xiàn)產(chǎn)品質(zhì)量和風(fēng)味的穩(wěn)定控制，海鮮調(diào)味品的速釀工藝還需要與微生物的發(fā)酵作用結(jié)合。

1.2 嗜鹽微生物對海鮮調(diào)味品特征風(fēng)味的影響

由傳統(tǒng)海鮮調(diào)味品中分離的微生物，主要是一些嗜溫及嗜鹽的細菌，在發(fā)酵過程中對原料的分解和風(fēng)味物質(zhì)的形成發(fā)揮著關(guān)鍵作用。如表1所示，它們所產(chǎn)生的蛋白酶、肽酶和堿性磷酸酶等能夠與原料自身所產(chǎn)酶類協(xié)同作用，加快原料底物分解，充分利用原料中的蛋白質(zhì)、脂肪等物質(zhì)，促進海鮮調(diào)味品中重要營養(yǎng)和風(fēng)味物質(zhì)的形成[22]。

表1 不同海鮮調(diào)味品中嗜鹽微生物及其所產(chǎn)的酶

海鮮調(diào)味品中的嗜鹽菌所分泌的胞內(nèi)及胞外酶類不僅能夠適應(yīng)發(fā)酵過程中高溫高鹽特點，還能夠與原料自身內(nèi)源酶和微生物協(xié)同作用加快原料底物分解，大大縮短發(fā)酵周期[23]。Sinsuwan等[24]研究發(fā)現(xiàn)，存在于魚醬油中的嗜鹽枝芽孢桿菌(Virgibacillussp.) SK37，在高鹽溶液中產(chǎn)生的胞外蛋白酶仍有水解活性。Akolkar等[25]探究了鹽桿菌(Halobacteriumsp.) SP1在加速魚醬油發(fā)酵進程中的作用，最終發(fā)現(xiàn)微生物菌群間之間產(chǎn)生了累加效應(yīng)，含有鹽桿菌的SP1(1)樣品組在發(fā)酵中期，蛋白酶活性和α-氨基含量均較高，可見，鹽桿菌SP1能夠作為理想發(fā)酵劑縮短魚醬油的發(fā)酵周期。

嗜鹽微生物能夠充分利用原料中的蛋白質(zhì)、脂肪等物質(zhì)，將其降解為形成風(fēng)味前體物質(zhì)的寡肽、低聚肽及脂肪酸等，促進海鮮調(diào)味品特征風(fēng)味中低分子揮發(fā)性酸和呈味氨基酸等重要營養(yǎng)和風(fēng)味物質(zhì)的形成[26]，構(gòu)成海鮮調(diào)味品獨特的口感和風(fēng)味。Beddows等[27]在研究細菌對發(fā)酵魚醬油風(fēng)味影響時發(fā)現(xiàn)，魚醬油中的氨基酸經(jīng)由細菌的代謝作用能夠衍生形成多種呈味氨基酸如丙酸、丁酸等，使產(chǎn)品形成獨特的奶酪香氣。Udomsil等[28]發(fā)現(xiàn)嗜鹽微生物分泌的內(nèi)源酶活性對發(fā)酵型海鮮調(diào)味品的風(fēng)味形成有重要作用，從魚醬油中篩選到的嗜鹽四聯(lián)球菌MRC5-5-2和MS33，因其胞內(nèi)氨基肽酶活性較高，可以產(chǎn)生促進產(chǎn)品肉味和杏仁味形成的苯甲醛和2-甲基丙醇。Udomsil等[29]在進行魚醬油速釀發(fā)酵時，將篩選到的葡萄球菌(S.piscifermentans) CMC5-3-1作為功能性發(fā)酵劑，結(jié)果表明試驗組中能夠產(chǎn)生更多具有黑巧克力香氣的2-甲基丙醛。

通過嗜鹽微生物的代謝作用和生物轉(zhuǎn)化還能夠有效減少海鮮調(diào)味品發(fā)酵過程中不良風(fēng)味的產(chǎn)生。向軍等[30]發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)氨基肽酶的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌(B.methylotrophicus)能夠?qū)⒖辔峨陌被说氖杷被崆谐欣跍p輕發(fā)酵產(chǎn)品中的苦味。段旭昌等[31]研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌發(fā)酵可以使苦味氨基酸轉(zhuǎn)化，改善甲魚酶解液的整體風(fēng)味，其中呈苦味的Asp、Cys、Val、Ile、Lys和Arg含量在發(fā)酵后期明顯減少，而呈微苦味的Phe和甜味的Ala含量略微增加。Fukami等[32]研究發(fā)現(xiàn)，在魚醬油發(fā)酵進程中添加木葡萄球菌能夠減少產(chǎn)品中的魚腥臭味和腐敗酸味，顯著提升產(chǎn)品風(fēng)味品質(zhì)。利用嗜鹽微生物代謝作用提高海鮮調(diào)味品中特征風(fēng)味物質(zhì)的含量，有利于改良速釀工藝中產(chǎn)品風(fēng)味不足的缺陷。

2 傳統(tǒng)發(fā)酵海鮮調(diào)味品嗜鹽菌代謝及風(fēng)味形成機制

微生物代謝作為海鮮調(diào)味品揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)形成的主要途徑，是指導(dǎo)傳統(tǒng)海鮮調(diào)味品速釀發(fā)酵技術(shù)并提升風(fēng)味品質(zhì)的突破點。其中不同種類的嗜鹽微生物其代謝通路和基因特征不同，在海鮮調(diào)味品的原料分解和風(fēng)味形成過程中均發(fā)揮積極貢獻。

2.1 氨基酸代謝模式及途徑

蛋白質(zhì)分解釋放出足夠的氨基酸對海鮮調(diào)味品形成完整的風(fēng)味是必不可少的，蛋氨酸和半胱氨酸等氨基酸是發(fā)酵食品中風(fēng)味物質(zhì)的主要來源[33]。研究[34]發(fā)現(xiàn)，亮氨酸是具有調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)代謝作用的主要支鏈氨基酸，由亮氨酸通過酮酸和醛轉(zhuǎn)化為乙醇的途徑為Ehrlich途徑。支鏈醛類物質(zhì)是發(fā)酵食品中的重要風(fēng)味化合物，其中3-甲基丁醛和2-甲基丁醛是醬油中最重要的氣味劑之一，具有麥芽樣或巧克力樣的強烈香氣，主要由微生物的Ehrlich途徑和支鏈氨基酸的生物合成途徑產(chǎn)生[35]。如圖1所示，3-甲基丁醛是亮氨酸分解代謝的中間體，亮氨酸與酮酸之間的氨基轉(zhuǎn)移由亮氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶催化，通過對應(yīng)的α-酮酸進一步被羥基異氰酸脫氫酶(PanE)降解為羥基酸，被α-酮酸脫羧酶(KivD)分解成醛、醇和酸等風(fēng)味相關(guān)物質(zhì)[36]。在支鏈氨基酸代謝途徑中，α-酮酸是關(guān)鍵節(jié)點物質(zhì)[37]，因此，提高氨基酸濃度和轉(zhuǎn)氨酶活性能有效地增加α-酮酸含量，促進海鮮調(diào)味品發(fā)酵過程中特殊風(fēng)味物質(zhì)的形成。

圖1 亮氨酸代謝產(chǎn)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)

由于多數(shù)細菌轉(zhuǎn)氨酶活性較低，很難通過添加外源支鏈氨基酸來提高α-酮酸的生成量，進而抑制了揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量的增加。而野生嗜鹽菌株通常生活在氨基酸含量低的環(huán)境中，它們依賴于自身氨基酸的生物合成，因此具有更多的氨基酸轉(zhuǎn)化酶，為食品原料中蛋白質(zhì)的降解提供了良好途徑。Udomsil[38]從發(fā)酵魚醬油中篩選到7株乳酸菌，均具有較高的胞內(nèi)氨基轉(zhuǎn)化酶活性，促進了亮氨酸、精氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸、和谷氨酸等呈味底物的分解轉(zhuǎn)化，進而豐富魚醬油產(chǎn)品的特征風(fēng)味。將嗜鹽微生物用于海鮮調(diào)味品發(fā)酵進程，不僅能夠增加各種呈味氨基酸的含量，還能提高由氨基酸衍生出的風(fēng)味化合物水平。

2.2 基于基因組學(xué)的代謝調(diào)控

編碼氨基酸轉(zhuǎn)化酶的基因受到許多特定機制的調(diào)控，包括對酶及其合成的生物化學(xué)控制，以及在轉(zhuǎn)錄水平上運作的調(diào)節(jié)因子[39]。其中轉(zhuǎn)氨酶基因(araT、bcaT、kivD、ytjE、panE)等的表達受全局調(diào)控因子CodY調(diào)控[40]。CodY在氨基酸降解、寡肽轉(zhuǎn)運、胞外蛋白酶和支鏈氨基酸的生物合成等氮代謝方面具有重要的調(diào)控作用，能夠通過改變轉(zhuǎn)錄速率調(diào)控靶基因的表達水平[41]。CodY基因的表達與胞內(nèi)纈氨酸、異亮氨酸等支鏈氨基酸的水平有關(guān)，轉(zhuǎn)氨酶基因表達水平在纈氨酸、異亮氨酸饑餓脅迫情況下能增強數(shù)倍。亮氨酸代謝產(chǎn)物3-甲基丁醛在異亮氨酸饑餓脅迫條件下的生成量比非饑餓培養(yǎng)條件增高了2倍。Yvon等[42]經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)亮氨酸、芳香族氨基酸和蛋氨酸轉(zhuǎn)氨酶具有重疊的底物特性，將乳酸球菌屬中的支鏈氨基轉(zhuǎn)移酶敲除會導(dǎo)致亮氨酸轉(zhuǎn)氨作用大大減少。此外，環(huán)境因素也能影響氨基酸代謝情況, 例如在酸脅迫條件下，作為乳酸菌代謝產(chǎn)物的支鏈醛含量有所增加。

嗜鹽菌不僅能通過改變碳、氮代謝來應(yīng)對高酸、高鹽等脅迫環(huán)境，還可以通過CodY調(diào)控自然感受相關(guān)基因，使菌體對外源DNA的攝入量得以提高，從而獲取有助于應(yīng)對脅迫環(huán)境的基因，增強菌株的生長能力。通過研究CodY調(diào)控對細菌的碳、氮代謝和自然感受態(tài)相關(guān)基因的影響，能夠獲得基因優(yōu)化改良的嗜鹽菌株，用于海鮮調(diào)味品的發(fā)酵生產(chǎn)工業(yè)。

Satomi等[43]在研究魚醬油風(fēng)味時發(fā)現(xiàn)，嗜鹽四聯(lián)球菌(Tetragenococcushalophilus)的質(zhì)粒上含有hdcA基因，可以通過編碼組氨酸脫羧酶將組氨酸轉(zhuǎn)化為組胺，進而調(diào)節(jié)產(chǎn)品風(fēng)味。Higuchi等[44]發(fā)現(xiàn)含有天冬氨酸脫羧酶的嗜鹽菌可通過其質(zhì)粒上的aspD編碼的脫羧作用，將天冬氨酸轉(zhuǎn)化為丙氨酸，使酸性氨基酸的含量減少，甜味氨基酸的含量增加，從而使口感變得溫和。Wakinaka等[45]用含溴甲酚紫的天冬氨酸指示劑從發(fā)酵魚類食品中分離出嗜鹽四球菌(Tetragenococcushalophilus)，并證實其攜帶天冬氨酸脫羧酶基因(aspD)，將此菌株作為魚露發(fā)酵劑可以實現(xiàn)天冬氨酸向丙氨酸的轉(zhuǎn)化，從而得到口感更加柔和的魚露產(chǎn)品，同時阻止了生物胺在魚露產(chǎn)品中的積累。因此，通過選定或敲除嗜鹽微生物上的特定基因，可以調(diào)控氨基酸代謝產(chǎn)物，在減少生物胺積累的前提下提升海鮮調(diào)味品風(fēng)味品質(zhì)，為在發(fā)酵食品工業(yè)中利用基因工程改造技術(shù)獲得適當(dāng)菌株奠定了基礎(chǔ)。

3 嗜鹽微生物對生物胺等的影響

生物胺是存在于魚醬油、蝦醬等發(fā)酵產(chǎn)品中的堿性含氮化合物，能與亞硝酸鹽反應(yīng)生成亞硝胺等致癌物質(zhì)[46]，過多的攝入可能導(dǎo)致人體中毒。部分嗜鹽菌含有內(nèi)源氨基氧化酶，能夠通過氧化脫氨基作用將生物胺降解同時產(chǎn)生醛類和氨類等風(fēng)味物質(zhì)，從而降低海鮮調(diào)味產(chǎn)品中生物胺的含量，提升產(chǎn)品的營養(yǎng)和保健功效。

姜維[47]從傳統(tǒng)發(fā)酵的魚醬油中分離到了汕頭鹽單胞菌(Halomonasshantousisnov.)，研究發(fā)現(xiàn)此菌株能在自身不積累生物胺的前提下將生物胺高效降解，將其作為功能發(fā)酵劑用于魚醬油的發(fā)酵，能顯著降低產(chǎn)品中腐胺、組胺、尸胺和酪胺含量。Zaman等[48]從魚醬油中分離到了解淀粉芽孢桿菌FS05和肉葡萄球菌FS19，發(fā)現(xiàn)這兩種菌株均具有氨基氧化酶活性，能夠顯著降低魚醬油發(fā)酵后期的組胺含量。

海鮮調(diào)味品中的嗜鹽菌作為功能性發(fā)酵劑能夠顯著減少發(fā)酵過程中生物胺的積累，提高產(chǎn)品品質(zhì)功效，有利于適應(yīng)和促進中國食品工業(yè)的發(fā)展。

4 結(jié)束語

微生物發(fā)酵法的應(yīng)用是海鮮調(diào)味品健康生產(chǎn)的重要發(fā)展趨勢，應(yīng)用嗜鹽微生物中氨基酸轉(zhuǎn)化酶調(diào)節(jié)原料底物的分解代謝，以及利用基因改造的嗜鹽菌株調(diào)控代謝產(chǎn)物，能夠在顯著縮短發(fā)酵周期的同時有效模擬發(fā)酵產(chǎn)品的傳統(tǒng)風(fēng)味。繼續(xù)探究嗜鹽菌的具體代謝機制以及外源氨基酸對產(chǎn)品品質(zhì)及特征風(fēng)味影響從而改進生產(chǎn)工藝，有望在保持海鮮調(diào)味品傳統(tǒng)風(fēng)味的基礎(chǔ)上，實現(xiàn)加工生產(chǎn)效率和產(chǎn)品品質(zhì)的不斷提升。