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        牡丹籽粕醬油發(fā)酵工藝優(yōu)化及抗氧化活性研究

        2020-07-26 08:58:30于泓鵬吳克剛劉曉麗
        食品與機(jī)械 2020年6期
        關(guān)鍵詞:能力

        胡 伊 于泓鵬 吳克剛 劉曉麗

        (廣東工業(yè)大學(xué)輕工化工學(xué)院, 廣東 廣州 510000)

        牡丹籽中含有7%~8%的油脂、9.9%的淀粉、20.35%的蛋白質(zhì)和多種生物活性物質(zhì),尤其是不飽和脂肪酸含量較高[1]。2011年,國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)發(fā)布《關(guān)于批準(zhǔn)元寶楓籽油和牡丹籽油作為新資源食品的公告》,將牡丹籽列為新資源食品[2]。牡丹籽粕是牡丹籽經(jīng)壓榨取油后的一種副產(chǎn)品,年產(chǎn)量達(dá)2.25萬(wàn)t[3],但大部分都被廢棄。牡丹籽粕不僅含有豐富的蛋白質(zhì)、8種必需氨基酸、不飽和脂肪酸和亞麻酸[4],還含有多糖、多酚、VE、植物甾醇、黃酮等抗氧化活性成分[5],可開(kāi)發(fā)成食品、藥品等。牡丹籽粕中富有微生物生長(zhǎng)代謝的碳源,可作為微生物培養(yǎng)基物的來(lái)源,生產(chǎn)相關(guān)發(fā)酵產(chǎn)品。宋王婷等[6]利用牡丹籽粕和白酒曲研制開(kāi)發(fā)出一種具有特殊風(fēng)味的牡丹籽酒。李杰[7]采用牡丹籽粕或辣木籽粕為主要原料制成一種具有抗氧化、降血壓等功能的牡丹辣木醬油。利用牡丹籽粕釀造醬油,即以牡丹籽粕全替代大豆或豆粕,并輔以面粉和麩皮經(jīng)制曲和發(fā)酵而成的一種新型液態(tài)調(diào)味品,不僅營(yíng)養(yǎng)豐富,還具有典型的醬油風(fēng)味和獨(dú)特的香氣及滋味。目前,相關(guān)的研究主要集中在釀造工藝條件的優(yōu)化上,對(duì)其品質(zhì)分析和功能性的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

        試驗(yàn)擬以提取油脂后的牡丹籽粕為原料,優(yōu)化其醬油發(fā)酵工藝,并研究牡丹籽粕醬油的抗氧化活性,旨在為提高牡丹籽粕的資源利用和精深化發(fā)展提供依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 材料與儀器

        1.1.1 材料與試劑

        牡丹籽粕大曲:牡丹籽粕與麥麩以8∶2的比例制得,自制;

        醬油品牌S1、醬油品牌S2:市售;

        氫氧化鈉、甲醛、無(wú)水乙醇、濃硫酸、鹽酸、冰乙酸、六水三氯化鐵、硫酸亞鐵、無(wú)水醋酸鈉:分析純,天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司;

        1,1-二苯基-2-苦肼基(DPPH)、6-羥基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸(Trolox)、2,2’-聯(lián)氨-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺鹽(ABTS)、2,4,6-三吡啶基三嗪(TPTZ):分析純,上海麥克林生化科技有限公司。

        1.1.2 儀器與設(shè)備

        生化培養(yǎng)箱:LRH型,上海恒科學(xué)儀器有限公司;

        pH計(jì):PHS-3C型,上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司;

        集熱式恒溫加熱磁力攪拌器:DF-101S型,鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司;

        恒溫振蕩器:SHA-BA型,常州澳華儀器有限公司;

        酶標(biāo)儀:FC型,美國(guó)賽默飛世爾科技公司。

        1.2 試驗(yàn)方法

        1.2.1 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

        (1) 發(fā)酵溫度:準(zhǔn)確稱取300 g成曲分裝于3個(gè)錐形瓶中,按料液比1∶1.5 (g/mL)加入11%鹽水,恒溫發(fā)酵20 d,考察發(fā)酵溫度(30,35,40,45,50 ℃)對(duì)牡丹籽粕醬油氨基態(tài)氮和可溶性無(wú)鹽固形物的影響。

        (2) 發(fā)酵時(shí)間:稱取300 g成曲分裝于3個(gè)錐形瓶中,按料液比1∶1.5 (g/mL)加入11%鹽水,45 ℃培養(yǎng)箱中恒溫發(fā)酵,考察發(fā)酵時(shí)間(15,20,25,30,35 d)對(duì)牡丹籽粕醬油氨基態(tài)氮和可溶性無(wú)鹽固形物的影響。

        (3) 鹽水濃度:稱取300 g成曲分裝于3個(gè)錐形瓶中,按料液比1∶1.5 (g/mL)加入鹽水,45 ℃恒溫發(fā)酵20 d,考察鹽水濃度(7%,9%,11%,13%,15%)對(duì)牡丹籽粕醬油氨基態(tài)氮和可溶性無(wú)鹽固形物的影響。

        1.3.2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,以發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、鹽水濃度為自變量,以氨基態(tài)氮含量為評(píng)價(jià)指標(biāo),根據(jù)Box-Benheken中心組合設(shè)計(jì)原理,設(shè)計(jì)三因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化醬油發(fā)酵工藝條件。

        1.3.3 滅菌工藝對(duì)牡丹籽粕醬油抗氧化能力的影響 取10 mL牡丹籽粕生醬油按表1進(jìn)行滅菌,測(cè)定滅菌后醬油的DPPH·清除能力、ABTS+·清除能力及鐵離子還原力,并與兩種市售醬油進(jìn)行比較。以生醬油為對(duì)照。

        1.3 指標(biāo)測(cè)定

        1.3.1 氨基態(tài)氮 按GB 18186—2000執(zhí)行。

        表1 滅菌工藝

        1.3.2 可溶性無(wú)鹽固形物 按GB 18186—2000執(zhí)行。

        1.3.3 DPPH·清除能力 參照Brand-Williams等[8]的方法。用無(wú)水乙醇配制濃度為0.20 mmol/L的DPPH醇溶液和6.25 g/L的Trolox溶液。將醬油稀釋10倍,取2 mL待測(cè)液加至2 mL 0.2 mmol/L的DPPH溶液中,混勻,室溫避光反應(yīng)60 min,測(cè)定517 nm處吸光度值。取2 mL一系列梯度的Trolox 標(biāo)準(zhǔn)溶液,加至2 mL 0.2 mmol/L的DPPH溶液中,混勻,室溫避光反應(yīng)60 min,測(cè)定517 nm處吸光度值。按式(1)計(jì)算DPPH·清除率。

        (1)

        式中:

        SCR——DPPH·清除率,%;

        Ac——對(duì)照溶液吸光度值;

        As——樣品溶液吸光度值;

        Ab——空白吸光度值。

        1.3.4 ABTS+·清除能力 參照Siddhuraju[9]的方法。配置0.625 g/L的Trolox母液、ABTS儲(chǔ)備液、ABTS工作液(用20 mmol/L、pH 4.5醋酸緩沖溶液按適當(dāng)比例稀釋ABTS儲(chǔ)備液,使A734 nm為(0.7±0.02),以此得到ABTS+工作液)。將醬油稀釋10倍,取樣品提取液500 μL加至5 mL ABTS+·工作液中,混勻,避光反應(yīng)6 min,測(cè)定734 nm處吸光值。將500 μL 50%的乙醇代替樣品做空白對(duì)照。取500 μL一系列梯度的Trolox標(biāo)準(zhǔn)溶液,加至5 mL ABTS+·工作液中,混勻,避光反應(yīng)6 min,測(cè)定734 nm處吸光值。按式(2)計(jì)算ABTS+·清除率。

        (2)

        式中:

        C——ABTS+·清除率,%;

        A1——樣品溶液吸光度值;

        A0——空白對(duì)照溶液吸光度值。

        1.3.5 鐵離子還原力 參照Benzie等[10]的方法。將0.3 mol/L 醋酸—醋酸鈉緩沖液(pH 3.6)、0.01 mol/L TPTZ溶液、0.02 mol/L FeCl3溶液按體積比10∶1∶1混勻,配制6.25 g/L FeSO4標(biāo)準(zhǔn)溶液。將醬油稀釋10倍,取樣品提取液200 μL加至2.8 mL Fe3+-TPTZ試劑中,混勻,37 ℃水浴60 min,測(cè)定593 nm處吸光值,用去離子水代替樣品提取液作空白對(duì)照。以FeSO4·7H2O為標(biāo)準(zhǔn)品繪制曲線。

        1.4 數(shù)據(jù)處理

        所有試驗(yàn)重復(fù)3次取平均值,采用Origin 2017軟件繪圖,采用Design-expert 8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì),標(biāo)準(zhǔn)曲線采用Excel作圖。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 單因素試驗(yàn)

        由圖1可知,牡丹籽粕醬油中氨基態(tài)氮含量隨發(fā)酵溫度的升高先增加后降低,當(dāng)發(fā)酵溫度為45 ℃時(shí)達(dá)最大值。研究表明低溫下肽酶的作用時(shí)間大于高溫,說(shuō)明低溫有利于酶活的保存[11],高溫下蛋白酶活力會(huì)降低甚至失活[12],同時(shí)高溫促進(jìn)了氨基酸和戊糖之間的美拉德反應(yīng),消耗了氨基酸[13]。氨基態(tài)氮含量隨發(fā)酵時(shí)間的增加而減少,是由于發(fā)酵后期酶活力下降,基本不生成氨基態(tài)氮,同時(shí)酵母菌與耐鹽乳酸菌繁殖以及美拉德反應(yīng)會(huì)消耗部分氨基態(tài)氮[14];當(dāng)發(fā)酵15 d時(shí),可溶性無(wú)鹽固形物含量為9.34 g/100 mL,達(dá)不到低鹽固態(tài)發(fā)酵醬油的標(biāo)準(zhǔn)(≥10 g/100 mL),故選擇最佳發(fā)酵時(shí)間為20 d。氨基態(tài)氮含量隨鹽水濃度的增加先上升后下降,當(dāng)鹽水濃度為11%時(shí)達(dá)最大值,氨基態(tài)氮含量下降是因?yàn)槭雏}含量增加,酶活力受抑制,降低了對(duì)蛋白質(zhì)的分解能力[15]。綜上,牡丹籽粕低鹽固態(tài)發(fā)酵醬油的最適溫度為45 ℃、發(fā)酵時(shí)間為20 d、最適鹽水濃度為11%。

        圖1 各因素對(duì)牡丹籽粕醬油氨基態(tài)氮和可溶性無(wú)鹽固形物含量的影響

        2.2 響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)

        2.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果分析 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果,以氨基態(tài)氮含量為響應(yīng)值,根據(jù)Box-Benhnken中心組合原理進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì),試驗(yàn)因素水平表見(jiàn)表2,試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表3。

        表2 試驗(yàn)因素水平表

        表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

        利用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合,得到以牡丹籽粕醬油氨基態(tài)氮含量(Y)為響應(yīng)值的二次多項(xiàng)回歸方程:

        Y=0.60+0.030A+0.018B-0.030C-0.015AB+0.010AC+0.000BC-0.024A2-0.059B2-0.029C2。

        (3)

        為檢驗(yàn)回歸方程中各因素對(duì)牡丹籽粕醬油氨基態(tài)氮含量的影響程度及有效性,對(duì)回歸方程進(jìn)行方差分析,結(jié)果見(jiàn)表4。

        表4 回歸模型方差分析?

        2.2.2 試驗(yàn)因素間的交互作用 由圖2可知,發(fā)酵溫度與鹽水濃度之間的交互作用顯著,其次依次為發(fā)酵溫度與發(fā)酵時(shí)間、鹽水濃度與發(fā)酵時(shí)間之間的相互作用。通過(guò)響應(yīng)面的陡峭程度可以看出,發(fā)酵溫度影響最大,發(fā)酵時(shí)間的影響大于鹽水濃度,與方差分析結(jié)果一致。

        圖2 各因素交互作用對(duì)牡丹籽粕醬油氨基態(tài)氮含量的影響

        2.2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 根據(jù)所建立的模型得到最佳發(fā)酵工藝參數(shù)為發(fā)酵溫度45.42 ℃、鹽水濃度12.02%、發(fā)酵時(shí)間17.86 d,此時(shí)醬油的實(shí)測(cè)氨基態(tài)氮含量預(yù)測(cè)值為0.623 g/100 mL。為檢驗(yàn)響應(yīng)面結(jié)果的可靠性,對(duì)最優(yōu)工藝參數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)(n=3),根據(jù)實(shí)際操作情況,將驗(yàn)證條件修正為發(fā)酵溫度45.5 ℃、鹽水濃度12%、發(fā)酵時(shí)間18 d,此時(shí)醬油的實(shí)測(cè)氨基態(tài)氮含量為0.616 g/100 mL,與預(yù)測(cè)值基本一致,證明用所建模型預(yù)測(cè)牡丹籽粕醬油氨基態(tài)氮含量是準(zhǔn)確可行的。

        2.3 抗氧化活性

        2.3.1 DPPH·清除能力 由圖3可知,不同滅菌工藝的牡丹籽粕醬油的DPPH·清除能力不同。經(jīng)滅菌處理后的牡丹籽粕醬油的DPPH·清除能力高于牡丹籽粕生醬油,可能是滅菌過(guò)程中生成了一些抗氧化物質(zhì),如多肽、氨基酸、類黑精和醛酮類風(fēng)味物質(zhì)[17]。牡丹籽粕生醬油的DPPH·清除能力高于市售品牌大豆醬油S2,與市售品牌大豆醬油S1的清除能力一致,且經(jīng)滅菌后的牡丹籽粕醬油DPPH·清除能力高于市售的兩種大豆醬油。表明牡丹籽粕醬油具有很強(qiáng)的DPPH·清除能力。

        圖3 醬油DPPH·清除能力

        2.3.2 鐵離子還原力 由圖4可知,滅菌工藝對(duì)牡丹籽粕醬油還原力有一定影響,高溫高壓滅菌條件下牡丹籽粕醬油還原力較生醬油的提高了85.6%。恒溫水浴、煮沸滅菌、巴氏滅菌條件下,牡丹籽粕醬油還原力較生醬油分別降低了10.8%,0.3%,3.0%,且這3種滅菌處理前后的還原力差異不明顯,說(shuō)明高溫高壓滅菌對(duì)牡丹籽粕醬油鐵離子還原力有提高作用。高溫高壓滅菌工藝下的牡丹籽粕醬油(FRAP值為1.30 mmol/L)的抗氧化能力高于市售品牌醬油S1的,表明高溫高壓滅菌條件下的牡丹籽粕醬油抗氧化能力較強(qiáng)。

        圖4 醬油的鐵離子還原力

        2.3.3 ABTS+·清除能力 由圖5可知,醬油對(duì)ABTS+·有一定的清除能力。高溫高壓滅菌的牡丹籽粕醬油的ABTS+·清除率(26.41%)最強(qiáng),高于牡丹籽粕生醬油和市售品牌醬油S1。另一方面,高溫高壓滅菌的牡丹籽粕醬油的TEAC值為79.90 mmol Trolox/mL,抗壞血酸的為283.48 mmol Trolox/mg,表明3 μL醬油樣品的ABTS+·清除能力相當(dāng)于1 μg抗壞血酸的,說(shuō)明牡丹籽粕醬油具有較強(qiáng)的抗氧化能力。

        圖5 醬油的ABTS+·清除能力

        3 結(jié)論

        試驗(yàn)表明,牡丹籽粕醬油的最佳發(fā)酵工藝條件為發(fā)酵溫度45.5 ℃、發(fā)酵時(shí)間18 d、鹽水濃度12%,此時(shí)牡丹籽粕醬油氨基態(tài)氮含量為0.616 g/100 mL。體外抗氧化活性表明,經(jīng)高溫高壓滅菌的牡丹籽粕醬油的DPPH·清除能力、鐵離子還原力及ABTS+·清除能力都高于牡丹籽粕生醬油,且高溫高壓滅菌的牡丹籽粕醬油的DPPH·清除能力高于兩種市售大豆醬油S1、S2,表明高溫高壓滅菌下的牡丹籽粕醬油具有較好的抗氧化能力。試驗(yàn)僅涉及牡丹籽粕低鹽固態(tài)發(fā)酵醬油的抗氧化性,并未研究其具體的抗氧化物質(zhì)。因此,分離鑒別牡丹籽粕醬油具體的以及特有的抗氧化物質(zhì)是后續(xù)研究的重點(diǎn)。

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