侯凱榮 妥彥峰 牟光慶

(大連工業(yè)大學食品學院，遼寧 大連 116034)

豆乳中含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，如大豆蛋白及不飽和脂肪酸等，對人體健康有益[1]。利用乳酸菌發(fā)酵豆乳，可將大豆中的異黃酮、蛋白質(zhì)等物質(zhì)進行適當生物轉(zhuǎn)化，更利于人體吸收，具有增加免疫力、抗氧化等作用[2-3]。

唐宇等[4]研究發(fā)現(xiàn)干酪乳桿菌16發(fā)酵豆乳具有一定的抗氧化功能，主要是由于糖苷型大豆異黃酮轉(zhuǎn)變?yōu)檐赵痛蠖巩慄S酮導致其抗氧化能力發(fā)生改變。徐寅等[5]發(fā)現(xiàn)發(fā)酵后豆乳的抗氧化能力較發(fā)酵前增強。Dajanta等[6]對發(fā)酵豆類進行研究發(fā)現(xiàn)，總酚含量與其抗氧化能力相關(guān)。孫曉琦等[7]發(fā)現(xiàn)乳桿菌發(fā)酵黃漿水可顯著提高其抗氧化能力，且與總酚含量呈正相關(guān)。李彤等[8]采用植物乳桿菌發(fā)酵復合豆乳時，其游離氨基酸含量上升，且總抗氧化能力較發(fā)酵前有所增加。

在前期研究基礎上，試驗擬以總酚、游離氨基酸含量為指標，對L.casei16發(fā)酵豆乳工藝條件進行優(yōu)化，并測定優(yōu)化后發(fā)酵豆乳的總還原力和羥自由基清除能力，旨在為深入開發(fā)具有良好抗氧化功能特性的發(fā)酵豆乳提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料與試劑

大豆：市售；

沒食子酸、鄰苯二甲醛、鄰二氮菲：分析純，上海阿拉丁生化科技有限公司；

MRS培養(yǎng)基：生物試劑，青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；

硫酸亞鐵、三氯化鐵：分析純，北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司；

β-巰基乙醇、三氯乙酸、四硼酸鈉、丙酮、過氧化氫、鐵氰化鉀：分析純，天津市大茂化學廠；

福林酚：分子生物學級，大連美侖生物有限公司。

1.1.2 儀器與設備

物性儀：TA-XT plus型，英國超技公司；

全自動家用豆?jié){機：DJ11B型，九陽股份有限公司；

生化培養(yǎng)箱：FQC型，上海一恒科學儀器有限公司；

超凈工作臺：SWCJ1D2D型，蘇凈集團蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；

酶標儀：1510型，美國Thermo Fisher Scientific 公司；

精密pH計：S210型，梅特勒—托利多儀器有限公司；

離心機：5804型，德國艾本德有限公司。

1.1.3 試驗菌株

L.casei16：保藏號CCTCC M2018557，大連工業(yè)大學食品學院大連益生菌功能特性研究重點實驗室提供，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心。

1.2 試驗方法

1.2.1 工藝流程

大豆→浸泡→磨漿→冷卻→接菌→發(fā)酵→冷藏→取樣→測定

1.2.2 操作要點

(1) 室溫下，按干豆與水重量比為1∶2泡發(fā)黃豆12 h，按干豆與水重量比為1∶4進行制漿，采用雙層濾布對豆?jié){進行過濾，于高壓蒸汽滅菌鍋中105 ℃滅菌15 min。

(2) 菌種活化采用MRS液體培養(yǎng)基，以2%接種量將L.casei16連續(xù)活化3代(37 ℃，18 h)用于豆?jié){發(fā)酵。

1.2.3 單因素試驗

(1) 發(fā)酵時間對發(fā)酵豆乳總酚、游離氨基酸含量的影響：豆乳滅菌處理后冷卻至室溫，以2%接種量接種L.casei16，37 ℃培養(yǎng)箱中分別發(fā)酵6，12，24 h，4 ℃條件下冷藏6 h。

(2) 冷藏時間對發(fā)酵豆乳總酚、游離氨基酸含量的影響：豆乳滅菌處理后冷卻至室溫，以2%接種量接種L.casei16，37 ℃培養(yǎng)箱中發(fā)酵24 h，4 ℃條件下分別冷藏6，12，24 h。

(3) 發(fā)酵溫度對發(fā)酵豆乳總酚、游離氨基酸含量的影響：豆乳滅菌處理后冷卻至室溫，以2%接種量接種L.casei16，分別于37，40，43 ℃培養(yǎng)箱中發(fā)酵24 h，4 ℃ 條件下冷藏6 h。

1.2.4 正交試驗設計 在單因素試驗基礎上，以發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、冷藏時間為試驗因素，以總酚和游離氨基酸含量為評價標準，采用L9(33)正交試驗進行L.casei16發(fā)酵豆乳工藝條件優(yōu)化。

1.2.5 物性指標檢測 參照華曉曼等[9]的方法略作修改，利用物性儀進行硬度、稠度、內(nèi)聚性、黏度指數(shù)測定。探頭A/BE、測試速度1.00 mm/s、返回高度30.00 mm、測試距離15.00 mm、觸發(fā)力5.00 g。

1.2.6 pH測定 采用pH計法。

1.2.7 總酚含量測定 參照王振帥等[10]的方法略作修改，取10 g發(fā)酵豆乳，加入10 mL 50% 丙酮，40 ℃振蕩4 h，調(diào)節(jié)pH至4.5，1 500 r/min離心10 min，取上清液100 μL稀釋至1 mL，分別加入福林酚0.5 mL，搖勻，加入12% Na2CO3溶液1 mL，用水稀釋至12.5 mL，搖勻，避光反應2 h，測定765 nm處吸光值，以沒食子酸為標準品繪制標準曲線，其線性回歸方程為y=5.105 1x+0.009 7，R2=0.996 9。

1.2.8 游離氨基酸測定 參照Xing等[11]的方法略作修改，取10 g發(fā)酵豆乳于50 mL離心管中，調(diào)節(jié)pH至4.5，靜置20 min，4 ℃、3 000 r/min離心30 min。取50 μL上清液加入1 mL鄰苯二甲醛試劑，室溫反應2 min，測定340 nm處吸光度，以亮氨酸為標準物繪制標準曲線，其線性回歸方程為y=1.294 7x+0.007 7，R2=0.996 8。

1.2.9 抗氧化活性測定

(1) 總還原能力：參照文獻[12]。

(2) 羥自由基清除能力：參照文獻[13]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗均為3次重復，采用SPSS 2.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，并采用Orgin 9.0軟件繪圖，字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 發(fā)酵時間對發(fā)酵豆乳質(zhì)構(gòu)、pH、總酚和游離氨基酸含量的影響 由表1可知，物性指標均隨發(fā)酵時間的延長而升高；pH值隨發(fā)酵時間的延長而顯著下降(P<0.05)。pH值的降低會導致發(fā)酵豆乳中的大豆球蛋白聚集凝結(jié)[2]，使分子間作用力不斷加強，黏度、硬度增加[14]。隨著發(fā)酵時間的延長，發(fā)酵豆乳中總酚、游離氨基酸含量均發(fā)生顯著變化(P<0.05)，當發(fā)酵時間為24 h時，發(fā)酵豆乳中總酚、游離氨基酸含量達最大值，分別為15.56 mg/100 mL 和1.41 mg/mL。這是由于隨著發(fā)酵時間的延長，發(fā)酵豆乳中蛋白質(zhì)被L.casei16產(chǎn)生的酶逐漸水解，因此游離氨基酸含量較發(fā)酵前升高[15]。而且L.casei16將豆乳中復雜的大分子酚類物質(zhì)轉(zhuǎn)化為小分子酚類物質(zhì)，釋放出更多的酚羥基，故總酚含量較發(fā)酵前有所增加，與張琪等[16]的結(jié)果一致。

表1 不同發(fā)酵時間下發(fā)酵豆乳的性能指標

2.1.2 冷藏時間對發(fā)酵豆乳質(zhì)構(gòu)、pH、總酚和游離氨基酸含量的影響 由表2可知，發(fā)酵豆乳冷藏12 h與冷藏24 h的硬度無顯著性差異；當冷藏時間為24 h時，發(fā)酵豆乳的稠度、內(nèi)聚性和黏度指數(shù)均顯著高于(P<0.05)其他冷藏條件下的。發(fā)酵豆乳的pH值隨冷藏時間的延長無顯著性變化，這是由于低溫條件下，發(fā)酵豆乳中L.casei16生長速度降低，乳酸生成速度降低，發(fā)酵豆乳pH值呈相對穩(wěn)定的狀態(tài)[2]。當冷藏時間為12 h時，發(fā)酵豆乳中總酚含量最高，為14.53 mg/100 mL，與耿彪等[17]的結(jié)論一致。后期發(fā)酵豆乳中總酚含量下降可能是由于發(fā)酵豆乳中總酚發(fā)生氧化所致[18]。發(fā)酵豆乳中游離氨基酸含量隨冷藏時間的延長先降低后升高，可能是冷藏12 h后，發(fā)酵豆乳中發(fā)生了其他化學變化，從而使游離氨基酸含量升高[19]。

表2 不同冷藏時間下發(fā)酵豆乳的性能指標

表3 不同發(fā)酵溫度下發(fā)酵豆乳的性能指標

2.1.3 發(fā)酵溫度對發(fā)酵豆乳質(zhì)構(gòu)、pH、總酚和游離氨基酸含量的影響 由表3可知，當發(fā)酵溫度為37 ℃時，發(fā)酵豆乳硬度、稠度、黏度指數(shù)均達最高值。當發(fā)酵溫度為30，37 ℃ 時，發(fā)酵豆乳pH值較低，發(fā)酵豆乳中的大豆球蛋白不斷聚集凝結(jié)，進而導致硬度、稠度、內(nèi)聚性、黏度指數(shù)發(fā)生變化，可能是此時發(fā)酵豆乳中L.casei16生長狀態(tài)良好[2]，產(chǎn)酸能力較強，導致pH值較低。當發(fā)酵溫度為43 ℃時，發(fā)酵豆乳中L.casei16的生長、產(chǎn)酸能力下降，體系中pH偏高。

由表3還可知，當發(fā)酵溫度為43 ℃時，發(fā)酵豆乳中總酚含量顯著增高(P<0.05)，可能是由于發(fā)酵溫度的升高導致發(fā)酵豆乳中分子滲透、擴散、溶解速度加快，并且高溫條件可以弱化或破壞細胞壁的完整性，使酚類物質(zhì)更容易從發(fā)酵豆乳中轉(zhuǎn)移至溶劑中，二者共同作用下導致了發(fā)酵豆乳中總酚含量的增加[20]；發(fā)酵豆乳中游離氨基酸含量隨發(fā)酵溫度的升高而顯著升高。發(fā)酵過程中，Lactobacillus主要是由胞內(nèi)肽酶(乳內(nèi)肽酶、氨基肽酶等)降解寡肽從而產(chǎn)生游離氨基酸[21]。當發(fā)酵溫度為43 ℃ 時，發(fā)酵豆乳中游離氨基酸含量最高，為1.04 mg/mL。劉璐[22]研究發(fā)現(xiàn)，鼠李糖乳桿菌1.0386的胞壁蛋白酶、氨肽酶的最適溫度分別為40，45 ℃。推測發(fā)酵溫度為43 ℃下游離氨基酸含量升高的原因可能是L.casei16發(fā)酵所產(chǎn)生的酶在43 ℃時保持良好活性。

2.2 正交試驗

在單因素試驗基礎上，以總酚、游離氨基酸含量為考察指標，對發(fā)酵時間、冷藏時間、發(fā)酵溫度進行正交試驗以確定最優(yōu)的發(fā)酵條件。試驗因素水平見表4，結(jié)果與分析見表5。

表4 因素水平表

由表5可知，總酚含量的最優(yōu)方案為A3B1C2，即發(fā)酵溫度37 ℃，發(fā)酵時間24 h，冷藏時間6 h。游離氨基酸含量的最優(yōu)方案為A3B3C2，即發(fā)酵溫度37 ℃，發(fā)酵24 h，冷藏24 h。由表6可知，各因素對總酚、游離氨基酸含量的影響不顯著(P>0.05)。

綜合考慮上述兩個正交試驗結(jié)果的差異，如表7所示，方案A3B3C2的總酚含量高于方案A3B1C2，但差異不顯著(P>0.05)，結(jié)合實際生產(chǎn)需求，確定最佳的發(fā)酵條件為A3B1C2，即發(fā)酵時間24 h，冷藏時間6 h，發(fā)酵溫度37 ℃，此條件下發(fā)酵豆乳的總酚含量為13.94 mg/100 mL，游離氨基酸含量為1.33 mg/mL。陳佩等[2]發(fā)現(xiàn)，經(jīng)24 h發(fā)酵后，L.caseiCCFM0412發(fā)酵豆乳中游離氨基酸含量上升，但低于試驗結(jié)果，說明通過試驗條件優(yōu)化后，提高了發(fā)酵豆乳中游離氨基酸含量。

表5 正交試驗結(jié)果及分析

表6 正交試驗方差分析

表7 發(fā)酵豆乳優(yōu)化方案驗證實驗

2.3 抗氧化能力比較

由表8可知，與未發(fā)酵豆乳相比，采用L.casei16發(fā)酵的未優(yōu)化組和優(yōu)化組豆乳總還原力分別為0.28，0.31，羥自由基清除能力分別為72.35%，79.43%，顯著高于未發(fā)酵豆乳的(P<0.05)；優(yōu)化后的發(fā)酵豆乳總還原能力和羥自由基清除能力得到顯著提高(P<0.05)。Suo等[23]發(fā)現(xiàn)發(fā)酵乳桿菌Zhao發(fā)酵豆乳的羥自由基清除能力為55.1%，保加利亞乳桿菌發(fā)酵豆乳羥自由基清除能力為31.7%，均低于試驗結(jié)果。

表8 抗氧化能力比較

3 結(jié)論

試驗表明，發(fā)酵豆乳的最優(yōu)工藝條件為L.casei16以2%接種量接種于豆乳，37 ℃發(fā)酵24 h，4 ℃冷藏6 h；該條件下發(fā)酵豆乳的總酚含量為13.94 mg/100 mL，游離氨基酸含量為1.33 mg/mL；優(yōu)化條件下發(fā)酵豆乳的總還原能力為0.31，羥自由基清除能力為79.43%。后續(xù)將對L.casei16發(fā)酵豆乳的抗氧化機制進行研究。