曲金萍，陳金玉，張坤生，任云霞

（天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300134）

雞肉是一種物美價(jià)廉的肉制品，更是人們?nèi)粘Ｉ钪胁豢苫蛉钡氖称?。相?duì)于豬肉和牛羊肉來說，雞肉具有“一高三低”的優(yōu)勢(shì)，即高蛋白、低脂肪、低熱量、低膽固醇[1]。近年來我國(guó)雞肉產(chǎn)量占肉類總產(chǎn)量的比重持續(xù)增高，但從世界范圍來看，我國(guó)肉雞行業(yè)仍存在較大的發(fā)展空間[2]。雞肉中的肌原纖維蛋白是一類具有重要生物學(xué)功能特性的鹽溶性結(jié)構(gòu)蛋白群，其約占總蛋白含量的50%～55%，主要由肌球蛋白、肌動(dòng)蛋白、肌動(dòng)球蛋白等組成[3]。其作用除了參與肌肉的收縮、影響肌肉的嫩度還與肌肉食品的流變學(xué)等特性有著密切的關(guān)系[4]。

水解是利用化學(xué)法或生物法將大分子蛋白質(zhì)降解成大小不同的多肽分子以提高蛋白適口性和貯藏穩(wěn)定性的一種手段[5]。有研究表明，雞肉蛋白經(jīng)過酶水解制備的多肽可以有效地改善雞肉在人體的消化吸收率和總利用率等[6]；還有研究表明通過酶解動(dòng)物蛋白得到了抗氧化活性較好的多肽，Rajapakse等[7]通過酶解大魷魚肉制備了具有清除自由基活性的肽，其氨基酸序列為Asn-Ala-Asp-Phe-Gly-Leu-Asn-Gly-Leu-Glu-Gly-Leu-Ala和Asn-Gly-Leu-Glu-Gly-Leu-Lys，且它們的抗氧化活性高于2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚；Hattori及Jeom等[8-9]酶解沙丁魚蛋白、酪蛋白和不溶性彈性蛋白制備了抗氧化活性肽。

本文通過對(duì)肌原纖維蛋白酶解，利用響應(yīng)面法以抗氧化活性為指標(biāo)，進(jìn)行抗氧化肽的制備，通過DPPH自由基清除能力、還原能力的測(cè)定、ABTS+自由基清除能力以及氧自由基吸收能力（oxygen radical absorption capacity，ORAC）的測(cè)定等對(duì)篩選結(jié)果進(jìn)行鑒定，進(jìn)而確定抗氧化活性最高的水解條件；最后通過傅里葉紅外光譜法對(duì)得到的多肽進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)的鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雞胸肉：天津市紅橋區(qū)華潤(rùn)萬家超市西青道店；牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA）、DPPH：Sigma試劑公司；胃蛋白酶（>3 000 U/mg）、胰蛋白酶（250 U/mg）、堿性蛋白酶（200 U/mg）、ABTS、2，2'-偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽[2，2′-Azobis（2-methylpropionamidine）dihydrochloride，AAPH]、6-羥基-2，5，7，8-四甲基色烷-2-羧酸（Trolox）：上海麥克林生化科技有限公司；以上化學(xué)試劑均為分析純。

電子天平（A2004A）：上海精天儀器有限公司；高速組織勻漿機(jī)（PT 2100）：寶創(chuàng)科技股份有限公司；高效離心機(jī)（Avanti J-E）：美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司；比例光束分光光度計(jì)（U-5100）：日立高新技術(shù)公司；實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)（EL20）：梅特勒-托利多儀器有限公司；傅里葉紅外光譜儀（Nicolet）：美國(guó)尼高力儀器公司；酶標(biāo)儀（Spark-10M）：帝肯上海貿(mào)易有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 預(yù)處理及（myofibrillar protein，MP）提取

參照Peak等[10]和Zhang等[11]的方法并改進(jìn)，雞胸肉剔除可見的脂肪結(jié)締組織，用刀斬碎成肉糜，加入4倍體積的蛋白提取液（0.1 mol/L NaCl、0.002 mol/L MgCl2、0.001 mol/L EDTA·2Na、0.1 mol/L NaH2PO4/Na2HPO4pH=7.0），均質(zhì) 25s，高速冷凍離心（5000r/min、15min、4 ℃），棄上清液留沉淀，再加入蛋白提取液重復(fù)上述操作兩次得粗蛋白，將所得粗蛋白與4倍體積的0.1 mol/L NaCl溶液混合，用均質(zhì)機(jī)高速勻漿20 s，高速冷凍離心（5 000 r/min、15 min、4℃），棄上清液留沉淀，再加入上述NaCl溶液重復(fù)上述操作兩次，最后所得膏狀沉淀即為雞胸肉MP，提取的MP保存于4℃，并于24 h內(nèi)用完。

1.2.2 抗氧化肽制備工藝流程

稱取肌原纖維蛋白10 g→溶于100 mL 0.5 mol/L NaCl溶液，勻漿30 s→調(diào)節(jié)pH值→加入一定量酶→恒溫水浴鍋酶解→沸水浴滅酶→冷卻至室溫25℃→8 000 r/min 4℃離心15 min→取上清液→真空冷凍干燥→-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 水解酶的選擇

分別采用胃蛋白酶、胰蛋白酶和堿性蛋白酶對(duì)提取的肌原纖維蛋白進(jìn)行酶解，調(diào)節(jié)酶解條件至各酶的最適條件，以抗氧化活性為檢測(cè)指標(biāo)篩選最適用酶。

1.3 單因素試驗(yàn)

1.3.1 pH值對(duì)酶解產(chǎn)物抗氧化活性的影響

采取控制變量法進(jìn)行單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)。以1.2.3中篩選的最適酶進(jìn)行水解，加酶量為酶∶底物1∶50（質(zhì)量比），調(diào)節(jié)反應(yīng)體系pH值分別為2、2.25、2.5、2.75、3，各反應(yīng)體系的水解溫度為最適酶所需溫度，水解時(shí)間為4 h，對(duì)所得的多肽進(jìn)行抗氧化活性分析。

1.3.2 溫度對(duì)酶解產(chǎn)物抗氧化活性的影響

以1.3.1中篩選的最佳pH值酶解條件下，分別調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的溫度為20、30、37.5、45、50℃，對(duì)各反應(yīng)體系進(jìn)行4 h的酶解，對(duì)所得的多肽進(jìn)行抗氧化活性分析。

1.3.3 水解時(shí)間對(duì)酶解產(chǎn)物抗氧化活性的影響

以1.3.1和1.3.2中篩選的最優(yōu)條件對(duì)酶解體系進(jìn)行水解時(shí)間的篩選，分別調(diào)節(jié)水解體系水解時(shí)間為1、2、2.5、3、3.5、4 h，對(duì)所得的多肽進(jìn)行抗氧化活性分析。

1.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)原理，以肌原纖維蛋白酶解多肽的抗氧化活性IC50值為響應(yīng)指標(biāo)，選取pH值、水解溫度和水解時(shí)間為響應(yīng)因子，進(jìn)行三因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，確定抗氧化肽制備的最佳工藝條件。試驗(yàn)因素水平表見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平編碼表Table 1 Factors and levels of response surface experiment

1.5 抗氧化能力的測(cè)定

1.5.1 DPPH自由基清除能力

參考Zheng等[12]的方法并稍作修改以測(cè)定DPPH自由基清除能力，取2 mL 0.2 mol/L DPPH乙醇溶液與2 mL樣品待測(cè)液，混勻避光反應(yīng)30 min后在517 nm處測(cè)吸光度值?？瞻捉M選用乙醇代替DPPH乙醇溶液；對(duì)照組為無水乙醇代替樣品與DPPH乙醇溶液反應(yīng)。計(jì)算公式如下：

式中：A1為試驗(yàn)組的吸光度；A2為空白組的吸光度；A3為對(duì)照組的吸光度。

1.5.2 還原能力的測(cè)定

取待測(cè)樣品溶液，加入2.5 mL pH6.6濃度0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖液和3.0 mL 1%（質(zhì)量比）鐵氰化鉀溶液，50℃水浴20 min，加入2.5 mL 10%（質(zhì)量比）三氯乙酸溶液，3 500 r/min離心10 min，取上清3 mL，再加入蒸餾水3 mL混合后加入0.5 mL 0.1%（質(zhì)量比）的FeCl3溶液，混勻室溫25℃靜置15 min，以等量去離子水代替樣品溶液調(diào)零，在700nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度A[13]。

1.5.3 ABTS+自由基清除能力

采用Wang等[14]的方法測(cè)定樣品清除ABTS+自由基的能力。將10 mL的7 mmol/L ABTS溶液與176 μL的140 mmol/L過硫酸鉀溶液在室溫25℃下避光反應(yīng)16 h，形成ABTS+自由基儲(chǔ)備液，室溫25℃避光保存。使用前用無水乙醇稀釋成在室溫25℃、734 nm波長(zhǎng)下的吸光度值為0.70±0.05的工作液。分別取不同濃度的樣品0.2 mL于試管中，加入3.8 mL的ABTS工作液，室溫25℃避光反應(yīng)6 min后，立即于734 nm處測(cè)定吸光值。清除率計(jì)算公式為：

式中：A0、AI、AJ分別表示未加樣品的 ABTS 溶液吸光值、樣品與ABTS溶液反應(yīng)后的吸光值和樣品自身的吸光值。

1.5.4 氧自由基吸收能力（ORAC）的測(cè)定

參考Huang等[15]的方法，配置濃度為75 mmol/L的磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）1L，備用。取熒光素鈉80 mg，用磷酸鹽緩沖液定容到50 mL，作為母液。取其1 mL，繼續(xù)用磷酸鹽緩沖液定容到50 mL，終濃度為8×10-5mmol/L。取414 mg的AAPH，用磷酸鹽緩沖液定容到10 mL，終濃度為153 mmol/L，需現(xiàn)配現(xiàn)用，避光保存。制備 100、50、25、12.5、6.25 μmol/L 的 Trolox 標(biāo)準(zhǔn)液。待測(cè)樣品的濃度為 10、25、50、100、200 μg/mL。取50 μL 的待測(cè)液、100 μL 的熒光素鈉溶液和 50 μL 的AAPH溶液，放置于四面不透光，僅底部透光的96孔板中。在37℃、485 nm激發(fā)波長(zhǎng)、530 nm發(fā)射波長(zhǎng)條件下，每隔3 min檢測(cè)一次熒光強(qiáng)度減弱的情況，共持續(xù)120 min，繪制出時(shí)間和熒光強(qiáng)度變化的曲線。熒光衰退曲線下的凈面積（area under curve，AUC）采用近似積分法計(jì)算，如下：

式中：空白組以蒸餾水代替樣品；f0和fi分別代表0 min和i min時(shí)的熒光強(qiáng)度。

1.6 二級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定

根據(jù)史曉霞等[16]的方法用紅外光譜儀測(cè)定樣品的二級(jí)結(jié)構(gòu)，具體操作如下：凍干樣品與光譜純KBr按質(zhì)量比范圍為1∶50～1∶200置于瑪瑙研缽中研磨混合成細(xì)粉，混合均勻后于壓模器加壓制成近透明的圓形晶片，然后打開EZ OMNIC軟件進(jìn)行掃描，參數(shù)掃描波長(zhǎng)范圍為 400 cm-1～4 000 cm-1、分辨率 0.09 cm-1、掃描16次。將采集后的樣品譜圖在EZ OMNIC軟件中傅里葉去卷積后經(jīng)Peakfit V4.12軟件進(jìn)行二階求導(dǎo)，經(jīng)多次曲線擬合后使殘差值最小，確定各子峰與二級(jí)結(jié)構(gòu)的對(duì)應(yīng)關(guān)系后（酰胺Ⅰ帶中：波數(shù)范圍1 610 cm-1～1 640 cm-1為特征 β-折疊；1 640 cm-1～1 650 cm-1為特征無規(guī)則卷曲；1 650 cm-1～1 658 cm-1為特征 α-螺旋的含量，1 660 cm-1～1 700 cm-1為特征β-轉(zhuǎn)角[17-18]），可根據(jù)其積分面積計(jì)算各二級(jí)結(jié)構(gòu)的相對(duì)百分含量。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

所有試驗(yàn)均重復(fù)3次，采用Excel 2007對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)計(jì)算平均值及標(biāo)準(zhǔn)差，Origin 9.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行繪圖，采用SPSS（p<0.05）比較平均值之間的差異性并進(jìn)行差異性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 水解酶的選擇

不同酶水解產(chǎn)物的抗氧化活性見圖1。

圖1 不同酶水解產(chǎn)物的抗氧化活性Fig.1 Antioxidant activity of the corresponding products of each enzyme hydrolysis

IC50值表示清除50%自由基所需要的樣品濃度，試驗(yàn)中采取DPPH自由基清除率計(jì)算IC50值。由圖1可見，胃蛋白酶的水解產(chǎn)物IC50值最低，其值為8.69 mg/mL；堿性蛋白酶的IC50值最高為17.73 mg/mL。IC50值越低說明其自由基清除能力越好，越高則相反。胃蛋白酶的DPPH自由基清除能力要優(yōu)于另外兩種酶，可能的原因是每種酶的切割位點(diǎn)不同，導(dǎo)致水解后產(chǎn)生多肽的氨基酸序列不同。胃蛋白酶作用于肽鍵兩端是芳香族氨基酸的肽鍵[6]，使產(chǎn)生的多肽兩端帶有芳香族氨基酸，可能這種芳香族氨基酸在抗氧化方面具有明顯的優(yōu)勢(shì)。

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 pH值的確定

不同pH值水解產(chǎn)物的抗氧化活性見圖2。

圖2 不同pH值對(duì)水解產(chǎn)物抗氧化活性的影響Fig.2 Effect of different pH value on antioxidant activity of hydrolysate

由圖2可以看出，當(dāng)pH值為2.5時(shí)肌原纖維蛋白水解物的IC50值最低，為4.981 mg/mL，即pH值為2.5時(shí)清除50%DPPH所需的樣品濃度最低，說明其抗氧化活性最好。反應(yīng)pH值由2升至3.5時(shí)出現(xiàn)了先增大后降低而后又升高的趨勢(shì)?？赡艿脑蚴窃趐H值從2到2.25的過程中，還未達(dá)到胃蛋白酶的最適pH值使其不能最大限度水解，致使反應(yīng)產(chǎn)物的抗氧化活性較低；而pH2.5時(shí)反應(yīng)產(chǎn)物具有最高的抗氧化活性，可能是胃蛋白酶在該pH值時(shí)的活性最高，從而使酶解反應(yīng)進(jìn)行較順利；在pH值高于2.5以后，由于反應(yīng)體系酸度不夠使酶的活性受到影響導(dǎo)致反應(yīng)不能完全進(jìn)行從而影響產(chǎn)物的抗氧化活性。pH值的改變會(huì)使酶和底物的解離狀態(tài)以及酶的活性中心的構(gòu)象受到影響，影響最終水解產(chǎn)物的抗氧化活性[19]。

2.2.2 溫度的確定

不同溫度水解產(chǎn)物的抗氧化活性見圖3。

圖3 不同溫度對(duì)水解產(chǎn)物抗氧化活性的影響Fig.3 Effect of different temperature on antioxidant activity of hydrolysate

溫度對(duì)于酶解反應(yīng)也是一個(gè)比較重要的因素，可以直接影響反應(yīng)能否順利進(jìn)行。由圖3可以看出，水解產(chǎn)物的IC50值隨著溫度升高的過程中呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢(shì)，這表明水解產(chǎn)物的DPPH自由基清除能力先升高后降低，即產(chǎn)物的抗氧化活性先升高后降低。這可能是因?yàn)?0℃是胃蛋白酶的最適酶解溫度（IC50值為7.044 mg/mL），在該值時(shí)胃蛋白酶可以發(fā)揮最大的活力，從而使水解反應(yīng)較完全進(jìn)行，使底物最大限度的酶解，在20℃～30℃過程中，體系溫度逐漸靠近胃蛋白酶的最適溫度，從而使酶能最大限度的發(fā)揮活力；在30℃以后的升溫過程中由于溫度升高使酶的活力受到影響，不能更好的與底物反應(yīng)，導(dǎo)致產(chǎn)物的抗氧化活性受到影響[20]。

2.2.3 時(shí)間的確定

不同時(shí)間水解產(chǎn)物的抗氧化活性見圖4。

圖4 不同時(shí)間對(duì)水解產(chǎn)物抗氧化活性的影響Fig.4 Effect of different time on antioxidant activity of hydrolysate

由圖4可知，在水解時(shí)間為2.5 h時(shí)反應(yīng)產(chǎn)物的IC50值最低為13.095 mg/mL，說明水解2.5 h的反應(yīng)產(chǎn)物抗氧化活性最好。在時(shí)間為2 h～4 h的過程中，IC50值表現(xiàn)出先降低后升高的趨勢(shì)，這可能是因?yàn)樵?.5 h之前，由于時(shí)間較短反應(yīng)還沒有完全完成，部分底物未被完全分解，水解度較低，大量的還原性多肽端點(diǎn)未被水解出，導(dǎo)致酶解反應(yīng)初期抗氧化活性較低；而2.5 h之后，由于前期酶解反應(yīng)的順利進(jìn)行使大量的產(chǎn)物生成，產(chǎn)物的累積會(huì)抑制酶的活力，水解時(shí)間過長(zhǎng)導(dǎo)致原本產(chǎn)生的某些抗氧化能力強(qiáng)的多肽被進(jìn)一步水解成更小的肽片段，甚至?xí)獬梢恍┯坞x氨基酸，從而導(dǎo)致產(chǎn)物抗氧化能力降低[20-21]。

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

雞胸肉肌原纖維蛋白的酶解工藝優(yōu)化根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)了17組試驗(yàn)，5組為中心點(diǎn)重復(fù)試驗(yàn)。本試驗(yàn)以IC50值作為響應(yīng)值，利用Design-Expert 8.0.6.1軟件對(duì)IC50值Y進(jìn)行多元回歸擬合。得到二次多項(xiàng)式擬合方程為：Y=10.96+3.82X1-3.26X2-0.34X3-2.85X1X2-0.48X1X3-0.6X2X3+2.11X12+1.41X22-1.58X32。

響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

回歸模型的顯著性檢驗(yàn)和方差分析見表3。

由表3可知，該模型的F值為13.29，p＜0.01，表明模型顯著。失擬項(xiàng)的F值為4.41，p=0.092 9>0.05，故失擬項(xiàng)不顯著，模型選擇合適。回歸模型系數(shù)R2=0.944 7，矯正決定系數(shù)R2Adj=0.873 6，說明回歸方程可以較好地描述各因素與響應(yīng)值之間的真實(shí)關(guān)系，可以通過該回歸方程確定雞胸肉MP酶解的最佳工藝條件。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of the response surface experiments

表3 回歸模型方差分析表Table 3 Analysis of variance for the fitted quadratic response surface regression model

方差分析表明，pH值和溫度對(duì)肌原纖維蛋白酶解產(chǎn)物抗氧化活性的影響極顯著，時(shí)間對(duì)酶解產(chǎn)物抗氧化活性的影響不顯著，根據(jù)各變量顯著性檢驗(yàn)p值的大小，可以看出肌原纖維蛋白酶解的各因素按影響大小排序依次為pH值>溫度>時(shí)間。

根據(jù)回歸方程做出三維曲面圖及等高線圖，如圖5、圖 6、圖 7 所示。

圖5 pH值和溫度的響應(yīng)面和等高線圖Fig.5 Responsive surfaces and contour of the combined effects of pH value and temperature

圖6 pH值和時(shí)間的響應(yīng)面和等高線圖Fig.6 Responsive surfaces and contour of the combined effects of pH value and time

圖7 溫度和時(shí)間的響應(yīng)面和等高線圖Fig.7 Responsive surfaces and contour of the combined effects of temperature and time

在響應(yīng)曲面圖上可以根據(jù)圖的坡度來反映各酶解因素對(duì)IC50值的影響大小。三維曲面的傾斜程度越大說明該因素對(duì)指標(biāo)的影響越顯著，反之傾斜度越小則說明對(duì)指標(biāo)的影響越不顯著[22]。由圖5、圖6、圖7可以看出，較時(shí)間因素而言，pH值和溫度的坡度較陡，說明pH值和溫度對(duì)IC50值的影響較大，而時(shí)間對(duì)IC50的影響較小，這與前面的回歸方程結(jié)果相吻合。

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 DPPH自由基清除能力、ABTS+自由基清除能力和還原能力

DPPH自由基清除能力、ABTS+自由基清除能力和還原能力如圖8所示。

圖8 抗氧化活性Fig.8 Antioxidant activity

由圖8可以看出，在響應(yīng)面最優(yōu)組合的條件下，樣品的DPPH自由基清除能力最高可以達(dá)到84.76%，說明清除DPPH自由基效果很好；而還原能力方面最高濃度的樣品的吸光度達(dá)到0.537，即樣品的還原能力也較好；在ABTS+自由基清除率方面，樣品濃度最高時(shí)ABTS+自由基清除率達(dá)到62.17%，通過以上3種試驗(yàn)結(jié)果說明在最優(yōu)組合條件下肌原纖維蛋白水解物的抗氧化活性較好。這也與響應(yīng)面設(shè)計(jì)結(jié)果相吻合。

2.4.2 氧自由基吸收能力測(cè)定

不同Trolox濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖9。

不同濃度樣品的熒光衰減曲線如圖10。

圖9 不同濃度Trolox的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.9 Standard curve line of different concentrations of Trolox

圖10 不同濃度樣品的熒光衰減曲線Fig.10 Fluorescence decay curves of samples at different concentrations

研究表明ORAC法對(duì)抗氧化性的測(cè)定特異性較高，且靈敏度、重現(xiàn)性都較好，抗氧化劑作用下的熒光衰減曲線面積與無抗氧化劑（有AAPH）時(shí)的熒光衰減曲線下面積之差，即為抗氧化劑的保護(hù)面積[23]。圖9是不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品Trolox的凈AUC隨時(shí)間的變化，從圖9可以看出，該線趨勢(shì)較好，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.010 1x+0.661 7，相關(guān)系數(shù)R2=0.992 5，可以較好地反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品熒光強(qiáng)度隨濃度的變化。圖10是不同濃度的樣品熒光強(qiáng)度隨時(shí)間衰減的變化，從圖中可以看出，樣品濃度越大，其曲線下面積越大，熒光強(qiáng)度衰減的越慢。說明樣品的濃度越大，越可以減弱自由基AAPH對(duì)熒光素鈉的攻擊從而保護(hù)熒光強(qiáng)度不易減小，即樣品濃度越大其抗氧化能力越好[24]。

2.5 抗氧化肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

抗氧化肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析如圖11所示。

在肌原纖維蛋白水解物的紅外光譜中1 600 cm-1～1700cm-1的掃描波長(zhǎng)范圍內(nèi)為一寬峰，其中1620cm-1～1 700 cm-1的范圍為酰胺I譜帶位置。經(jīng)過去卷積處理后，酰胺I譜帶可以分出15個(gè)峰，再對(duì)光譜進(jìn)行二階求導(dǎo)、高斯曲線進(jìn)行譜帶擬合，對(duì)峰位、峰高、半峰寬等進(jìn)行曲線擬合，可以確定每個(gè)峰的面積，進(jìn)而求得每種結(jié)構(gòu)的百分比。每個(gè)峰信息如表4所示。

圖11 水解產(chǎn)物的紅外光譜掃描曲線Fig.11 Infrared spectrum scan curve of hydrolysate

表4 MP水解物酰胺I帶峰的位置和相對(duì)強(qiáng)度Table 4 Peak positions and relative intensities of the amide I component bands of MP hydrolysate

續(xù)表4 MP水解物酰胺I帶峰的位置和相對(duì)強(qiáng)度Continue table 4 Peak positions and relative intensities of the amide I component bands of MP hydrolysate

本試驗(yàn)采用Peakfit軟件對(duì)樣品紅外譜圖進(jìn)行分析，通過分峰處理以及曲線擬合等操作，最終結(jié)果顯示MP水解物的二級(jí)結(jié)構(gòu)分別為α-螺旋占15.36%，β-折疊占20.22%，β-轉(zhuǎn)角占39.03%，無規(guī)卷曲占25.39%。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)以雞胸肉為原料，對(duì)雞胸肉中提取的肌原纖維蛋白進(jìn)行酶解，通過篩選水解產(chǎn)物的抗氧化活性從而確定最優(yōu)酶為胃蛋白酶；研究不同提取條件對(duì)水解產(chǎn)物抗氧化活性的影響，在單因素的基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，最終確定的最優(yōu)提取條件為pH2.5、溫度35℃、水解時(shí)間3 h，該提取條件下DPPH自由基清除率的IC50值為6.674 mg/mL，ABTS+自由基清除率的IC50值為313.276 μg/mL，還原能力樣品的最大吸光度為0.537，ORAC試驗(yàn)顯示樣品的抗氧化能力隨樣品濃度的增大而增大，且具有較強(qiáng)的抗氧化能力；通過紅外光譜可知，MP水解物的出峰位置與蛋白肽的特征峰位置相吻合。因此，本試驗(yàn)以抗氧化活性為指標(biāo)，通過響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化制備MP抗氧化肽具有一定的可行性，可以為進(jìn)一步研究MP抗氧化肽的其他抗氧化活性提供一定的理論依據(jù)。