陳靜，郝俊光，蔡秋杏，戴梓茹，李桂英，袁燕萍，徐新鳳

（1.北部灣大學(xué)食品工程學(xué)院，廣西欽州535000；2.欽州市特色果蔬發(fā)酵重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西欽州535000；3.石河子質(zhì)量與計(jì)量檢測(cè)所，新疆石河子832000）

葡萄酒以新鮮葡萄或葡萄汁為原料，經(jīng)全部發(fā)酵或部分發(fā)酵制成含有一定酒精度的發(fā)酵酒[1]。葡萄酒的營(yíng)養(yǎng)成分很多，其中包含豐富的碳水化合物、維生素、氨基酸、果膠，以及蘋果酸、酒石酸、檸檬酸等物質(zhì)，還含有鉀、鈣、鎂、磷、鋅、硒等微量元素[2]。葡萄酒不但營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，同時(shí)還具有極高的醫(yī)療保健價(jià)值。近年研究表明葡萄酒中花色苷具有降血脂、抗變異、延緩衰老、改善視覺等作用[3]。葡萄酒中的白藜蘆醇具有降低膽固醇和甘油三脂、降低血脂、防治心血管疾病及癌癥等作用[4]。因此，除了作為平常的飲用需求外，廣大消費(fèi)者購(gòu)買葡萄酒更具有養(yǎng)生需求。

廣西地區(qū)葡萄資源豐富，葡萄酒釀造產(chǎn)量不斷增加。但由于原材料葡萄和加工工藝會(huì)對(duì)葡萄酒的質(zhì)量有影響（如葡萄的品種、質(zhì)量與種植環(huán)境等），因而存在一定的安全風(fēng)險(xiǎn)，尤其是在釀造過程易產(chǎn)生甲醇及雜醇油等安全危害因子[5]。

通過對(duì)廣西本地產(chǎn)的巨峰葡萄在釀造過程中進(jìn)行跟蹤檢測(cè)葡萄酒中甲醇、異戊醇、異丁醇含量的變化以及總酸、總糖、單寧、酒精度理化指標(biāo)，從而研究葡萄釀造過程中不同果膠酶添加量及不同溫度下對(duì)葡萄酒中甲醇、異戊醇、異丁醇及理化指標(biāo)總酸、總糖、單寧、酒精度等的影響。從而為巨峰葡萄酒發(fā)酵過程甲醇和雜醇油的控制因素提供了一些參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

巨峰葡萄：欽州本地超市；白砂糖：北部灣大學(xué)文科地超市；帝伯仕果膠酶（酶活力＞50 U/mg）：南寧東南恒華道生物科技有限公司；帝伯仕18度酵母：煙臺(tái)良緣酒業(yè)有限公司；焦亞硫酸鉀：煙臺(tái)帝伯仕自釀機(jī)有限公司。

試劑甲醇（99．8%）、異丁醇（99．8%）、異戊醇（99．8%）、乙醇（99．8%）、叔戊醇（99．8%）：均為色譜純，天津光復(fù)精細(xì)化工研究所；氫氧化鈉（分析純）：天津化學(xué)試劑有限公司；福林酚（生物技術(shù)級(jí)）：上海麥克林生化科技有限公司；酒石酸鉀鈉（分析純）：天津市大茂化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

安捷倫（Agilent）7890B配氫火焰檢測(cè)器氣相色譜儀：美國(guó)安捷倫科技有限公司；色譜柱（聚乙二醇石英毛細(xì)管柱，柱長(zhǎng) 60 m，內(nèi)徑 0.25 mm，膜厚 0.25 μm）：上海碧真儀器有限公司；UV1800紫外分光光度計(jì)：島津儀器（蘇州）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程

葡萄→預(yù)處理（清洗、晾干、除梗）→擠碎（加入不同含量的果膠酶）→接種酵母發(fā)酵→主發(fā)酵→后發(fā)酵→澄清→成品葡萄酒

1.3.2 樣品處理

將樣品分為A、B試驗(yàn)組，均將葡萄汁初始糖度調(diào)至 24 °Brix。

A組為果膠酶添加量使用研究：分別稱巨峰葡萄2 kg，除梗破碎，加入到3 L發(fā)酵罐中。分別將濃度為150 mg/kg的焦亞硫酸鉀、0.2 g/kg的酵母加入發(fā)酵罐中，攪拌均勻。再分別將濃度為0、100、150、200 mg/kg的果膠酶加到每個(gè)樣品中，攪拌均勻，置于24℃恒溫箱下進(jìn)行10 d的主發(fā)酵，主發(fā)酵結(jié)束、過濾、靜置于16℃恒溫箱進(jìn)行后發(fā)酵。

B組為發(fā)酵溫度的研究：分別稱取巨峰葡萄1kg，除梗破碎，加入到2 L發(fā)酵罐中。分別將濃度為150 mg/kg的焦亞硫酸鉀、0.2 g/kg的酵母、150 mg/kg果膠酶加入發(fā)酵罐中，攪拌均勻，分別置于24、28、30℃、恒溫箱下進(jìn)行10 d的主發(fā)酵，主發(fā)酵結(jié)束、過濾、靜置于16℃恒溫箱進(jìn)行后發(fā)酵。

1.3.3 理化指標(biāo)的測(cè)定

酒精度：酒精度計(jì)法，蒸餾測(cè)定；總糖：直接滴定法：采用2.5 g/L的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定；總酸：直接滴定法：采用0.05 mol/L氫氧化鈉滴定；以上方法均參照GB/T15038-2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[6]。單寧：參照NY/T1600-2008《水果、蔬菜及其制品中單寧含量的測(cè)定分光光度法》[7]。

1.3.4 甲醇及主要雜醇油含量的測(cè)定

參照GB5009.266-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中甲醇的測(cè)定》[8]，將發(fā)酵醪液過濾，量取50 mL濾液倒入500 mL圓底燒瓶中，并加入50 mL蒸餾水，并開啟冷卻水，加入幾粒沸石，連接冷凝管，用50 mL容量瓶作為接收器（外加冰?。?，并開啟冷卻水，緩慢加熱蒸餾，收集蒸餾液50 mL，混勻；吸取10.0 mL蒸餾后的溶液于試管中，加入0.10 mL叔戊醇標(biāo)準(zhǔn)溶液，混勻，備用。

1.3.5 氣相色譜條件

色譜柱：島津氣相色譜柱毛細(xì)管柱（60 m×0.25mm×0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度：250℃；程序升溫：初溫 40℃，保持1 min，以4.0℃/min升到130℃，以20℃/min升到200℃，保持5 min；載氣流量：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：1.0 μL；分流比：20.1[8]。

1.3.6 標(biāo)準(zhǔn)品的配制

標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液的配制：用電子天平準(zhǔn)確稱取各0.5 g（精確至0.001 g）甲醇、異丁醇、異戊醇至于100 mL的容量瓶，分別用40%的無(wú)水乙醇定容，混勻，配制濃度為5 000 mg/L。準(zhǔn)確稱取2.0 g（精確至0.001 g）叔戊醇，用40%的無(wú)水乙醇定容，混勻，備用。

從標(biāo)準(zhǔn)品溶液中分別吸取 0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL甲醇、異丁醇、異戊醇至25 mL的容量瓶，用40%的無(wú)水乙醇定容至刻度，依次配制成濃度梯度為100、200、400、800、1 000 mg/L 的混標(biāo)溶液。分別吸取10.0 mL的混標(biāo)溶液于5個(gè)試管中，加入0.1 mL的叔戊醇，混勻，備用[9]。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)的處理是通過制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線及安捷倫的7890B的OpenLab工作站軟件獲得結(jié)果。各種試驗(yàn)的試驗(yàn)數(shù)據(jù)均經(jīng)過3次重復(fù)試驗(yàn)獲得，采用平均值表示；采用WPS 2019軟件進(jìn)行圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 果膠酶的添加量對(duì)葡萄酒發(fā)酵過程中理化指標(biāo)的變化影響

2.1.1 果膠酶的添加量對(duì)葡萄酒發(fā)酵過程中總酸含量的變化影響

在巨峰葡萄發(fā)酵初期添加不同的果膠酶含量，依照GB/T15038-2006中總酸方法的檢測(cè)結(jié)果見表1。

表1 巨峰葡萄發(fā)酵過程中總酸的含量變化Table 1 Changes of total acid content in Jufeng grape during fermentation g/L

從表1可以看出，添加不同量的果膠酶對(duì)葡萄酒中的總酸基本沒有影響。在發(fā)酵過程中，總酸含量一直不斷下降，發(fā)酵到第10天，總酸下降速率變慢，后期逐漸趨于穩(wěn)定。在發(fā)酵過程中酸類物質(zhì)不斷地快速分解，導(dǎo)致總酸快速降低，到后期酸類物質(zhì)分解速率緩慢，總酸下降速率變小并趨于穩(wěn)定的趨勢(shì)。

2.1.2 果膠酶的添加量對(duì)葡萄酒中發(fā)酵過程中總糖含量的變化影響

巨峰葡萄發(fā)酵中添加不同的果膠酶含量，按照總糖方法的檢測(cè)結(jié)果見表2。

表2 巨峰葡萄發(fā)酵過程中總糖的含量變化影響Table 2 Effect of total sugar content on fermentation of Jufeng grape g/L

總糖減少主要經(jīng)酵母菌代謝轉(zhuǎn)化成能量和醇類物質(zhì)，醇類物質(zhì)產(chǎn)生的種類和數(shù)量直接影響葡萄酒的品質(zhì)[10]。由表2可知，添加不同量的果膠酶，對(duì)葡萄酒中總糖的含量幾乎沒有影響。葡萄酒在發(fā)酵的前6 d，總糖的下降速度很快，說(shuō)明該時(shí)期，酵母菌生長(zhǎng)繁殖旺盛[11]，需要大量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，因此分解糖類，從而導(dǎo)致總糖量快速下降，發(fā)酵到第8天含糖量降到很低，隨后總糖含量降低十分緩慢，并逐漸趨于穩(wěn)定。這是因?yàn)楹笃跔I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)變少，酒精抑制作用導(dǎo)致酵母菌大量死亡，發(fā)酵作用降低[12]，因此總糖含量下降趨勢(shì)變慢，發(fā)酵到第20天，兩種葡萄酒的總糖含量均小于2.0 g/L，符合國(guó)家干紅葡萄酒總糖含量標(biāo)準(zhǔn)之內(nèi)（≤4.0 g/L）[13]干型葡萄酒。

2.1.3 果膠酶的添加量對(duì)葡萄酒發(fā)酵過程中的酒精度的變化影響

巨峰葡萄發(fā)酵過程中添加不同的果膠酶含量，按照酒精度的檢測(cè)方法的檢測(cè)結(jié)果見表3。

表3 巨峰葡萄發(fā)酵過程中酒精度的變化影響Table 3 Effect of alcohol degree on fermentation of Jufeng grape %vol

由表3可以看出，添加不同量的果膠酶，葡萄酒中的酒精度基本沒有影響。葡萄酒在發(fā)酵過程中酒精度均呈快速上升后逐漸趨于平穩(wěn)。從表3知，第2天到第8天是發(fā)酵最激烈的時(shí)期，在這個(gè)階段酒精度的產(chǎn)生和總糖下降的速度呈現(xiàn)出一定的一致性，隨后酒精度逐漸趨于平穩(wěn)。

2.1.4 果膠酶的添加量對(duì)葡萄酒發(fā)酵過程中單寧含量的變化影響

葡萄發(fā)酵過程中添加不同的果膠酶含量，按照單寧的檢測(cè)方法的檢測(cè)結(jié)果見表4。

表4 巨峰葡萄發(fā)酵過程中單寧含量的變化影響Table 4 Effect of tannin content on fermentation of Jufeng grape mg/L

葡萄酒釀制過程中添加果膠酶，有利于增強(qiáng)多酚物質(zhì)的浸提，從而使單寧含量的增加[14]。由表4可知，添加果膠酶，對(duì)葡萄酒中單寧含量有明顯的影響，并隨著果膠酶添加量的增加而增加。在一定濃度果膠酶范圍內(nèi)，隨著果膠酶濃度的增大，果膠酶對(duì)葡萄表皮果膠的分解作用增大，分解釋放到果肉中，使果肉中單寧的含量不斷提高[15]。因此，果膠酶濃度越大，對(duì)葡萄品質(zhì)影響越大，而葡萄酒在發(fā)酵的過程中單寧的含量均呈快速上升再緩慢增加，最后逐漸降低的變化趨勢(shì)，此結(jié)果與楊穎瓊等[16]的研究山葡萄發(fā)酵過程中單寧含量變化趨勢(shì)相似。

2.2 果膠酶的添加量對(duì)葡萄酒發(fā)酵過程中的甲醇及主要雜醇油含量的變化影響

2.2.1 果膠酶添加量與甲醇變化的關(guān)系

果膠酶的添加量對(duì)巨峰葡萄酒發(fā)酵過程中甲醇含量的變化影響圖見圖1。

從圖1可知，4組添加了不同量果膠酶的巨峰葡萄酒在發(fā)酵過程中甲醇含量均從0開始快速增加，發(fā)酵到第14天含量達(dá)到峰值，隨果膠酶添加量由0～200 mg/kg，甲醇含量依次為 165.23、243.98、252.35、272.54 mg/L，發(fā)酵終止時(shí)甲醇含量依次為145.28、224.74、232.82、242.45 mg/L，甲醇含量均在國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)范圍之內(nèi)。與對(duì)照組相比（145.28 mg/L），甲醇依次增加了79.46、87.54、97.17 mg/L。

圖1 果膠酶的添加量對(duì)巨峰葡萄酒發(fā)酵過程中甲醇含量的變化影響Fig.1 Effect of pectinase addition on methanol content in Jufeng wine during fermentation

巨峰葡萄酒中甲醇的含量隨著果膠酶添加量的增加而增加，而隨著發(fā)酵時(shí)間的推進(jìn)甲醇含量均呈先上升后緩慢下降的趨勢(shì)。由于葡萄酒在發(fā)酵過程中原料的果膠不斷大量酶解，生成甲醇的含量不斷增加，而隨著果膠的大量分解代謝，甲醇生成的速率變低，導(dǎo)致甲醇含量下降。

2.2.2 果膠酶添加量與雜醇油變化的關(guān)系

果膠酶的添加量對(duì)巨峰葡萄酒發(fā)酵過程中雜醇油含量的變化影響見圖2。

圖2 果膠酶的添加量對(duì)巨峰葡萄酒發(fā)酵過程中雜醇油含量的變化影響Fig.2 Effect of pectinase addition on fusel oil content in Jufeng wine during fermentation

從圖2可以看出，4組添加了不同量的果膠酶時(shí)的巨峰葡萄酒在發(fā)酵初期沒有雜醇油的產(chǎn)生，到第2 d雜醇油含量從0開始逐漸增加，發(fā)酵到第8天含量達(dá)到峰值，隨果膠酶添加量的增加，雜醇油含量依為224.09、259.47、245.65、238.02 mg/L，發(fā)酵終止時(shí)雜醇油含量依次下降到 188.34、241.05、223.88、214.18 mg/L，與對(duì)照組比較（188.34 mg/L），雜醇油含量依次增加了52.71、35.54、25.84 mg/L。

添加果膠酶對(duì)巨峰葡萄酒中雜醇油的含量有影響，雜醇油的含量不隨著果膠酶添加量增加而增加，反而下降，但隨著發(fā)酵的進(jìn)行雜醇油含量呈上升后緩慢下降的趨勢(shì)。由于雜醇油產(chǎn)生的機(jī)理與甲醇不同，雜醇油主要是伴隨著酒精發(fā)酵過程產(chǎn)生的,主要由兩條代謝途徑產(chǎn)生降解代謝路徑和合成代謝路徑；雜醇油α氨基氮源充足時(shí)，酵母以氨基酸為基質(zhì)進(jìn)行降解代謝路徑，從而產(chǎn)生雜醇油；當(dāng)發(fā)酵液中可利用的α氨基氮源缺乏時(shí)，酵母以糖為基質(zhì)進(jìn)行合成代謝路徑，從而產(chǎn)生雜醇油[17]。

2.3 不同發(fā)酵溫度下葡萄酒發(fā)酵過程中甲醇及主要雜醇油含量的變化

2.3.1 溫度對(duì)甲醇含量的影響

分別選取24、28、30℃進(jìn)行主發(fā)酵，溫度與甲醇的關(guān)系圖見圖3。

圖3 溫度對(duì)巨峰葡萄酒發(fā)酵過甲醇含量的變化影響Fig.3 Effect of temperature on methanol content in Jufeng wine during fermentation

從圖3可以看出，3組不同發(fā)酵溫度下巨峰葡萄酒中的甲醇含量均從0開始快速增加，發(fā)酵到第14天時(shí)，甲醇含量達(dá)到峰值，隨溫度的升高甲醇含量依次為 252.98、276.5、291.03 mg/L，發(fā)酵終止時(shí)甲醇含量依次減到232.82、254.5、267.5 mg/L，含量均在國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)范圍。與對(duì)照組相比（232.82 mg/L），甲醇含量依次增加了 21.68、34.68 mg/L。

溫度對(duì)葡萄酒中甲醇含量有影響，甲醇含量隨著溫度的升高而逐漸增加，并隨著發(fā)酵時(shí)間的推進(jìn)甲醇含量均呈先上升后下降的變化規(guī)律。溫度升高，甲醇含量逐漸增加，這是因?yàn)闇囟壬呤辜柞ッ富钚栽鰪?qiáng)[18-19]，在一定溫度范圍內(nèi)果膠酶、纖維素酶、蛋白酶等多種酶活性隨著溫度的升高而逐漸增大，從而使果膠物質(zhì)徹底分解，致使甲醇生成量增多。

2.3.2 溫度對(duì)雜醇油含量的影響

分別選取24、28、30℃進(jìn)行主發(fā)酵，溫度與雜醇油的關(guān)系圖見圖4。

圖4 溫度對(duì)巨峰葡萄酒發(fā)酵過程雜醇油含量的變化影響Fig.4 Effect of temperature on fusel oil content in Jufeng wine during fermentation

觀察圖4中3組不同溫度下發(fā)酵的巨峰葡萄酒，前2 d無(wú)雜醇油產(chǎn)生，而隨著發(fā)酵的進(jìn)行在第8天雜醇油含量達(dá)到峰值，隨著溫度升高雜醇油含量依次為245.65、210.91、200.66 mg/L，發(fā)酵終止時(shí)雜醇油依次降到223.88、173.42、169.81mg/L，與對(duì)照相比（223.88mg/L），雜醇油含量依次降低了50.46、54.07 mg/L。

從圖4可以看出，巨峰葡萄酒中雜醇油的含量并不隨著溫度的升高而增加，相反其含量甚至降低，這與曾朝珍等[20]研究結(jié)果相似,但隨著發(fā)酵的進(jìn)行雜醇油含量呈上升后緩慢下降的趨勢(shì)。

3 結(jié)論

本研究主要針對(duì)巨峰葡萄酒發(fā)酵過程中甲醇雜醇油的變化規(guī)律，研究發(fā)酵溫度和果膠酶添加量對(duì)巨峰葡萄酒發(fā)酵過程中甲醇及雜醇油含量的影響及一些理化指標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果。試驗(yàn)研究表明：

1）果膠酶添加量對(duì)葡萄酒發(fā)酵過程中的總酸、總糖及酒精度等指標(biāo)幾乎沒有影響，但對(duì)單寧影響較大，其含量并隨著添加量的增加而增加。自釀葡萄酒在發(fā)酵過程中總酸、總糖含量隨發(fā)酵時(shí)的推進(jìn)間先快速下降后趨于平穩(wěn)，而酒精度呈快速上升后趨于平穩(wěn)，而單寧的含量隨發(fā)酵時(shí)間均呈先快速上升后緩慢增加最后下降的趨勢(shì)。

2）添加果膠酶釀造葡萄酒時(shí)，有害物質(zhì)甲醇和雜醇油的含量均有所增加。甲醇增加量與果膠酶添加量成正比，與對(duì)照組相比，果膠酶添加到200 mg/kg時(shí)甲醇含量接近為對(duì)照組的2倍，但其含量均小于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)400 mg/L。而雜醇油增加量并未隨果膠酶添加量的增加而增加，相反其含量降低，但與對(duì)照組相比，其含量明顯有所增加。

3）葡萄酒在發(fā)酵過程中甲醇含量隨著發(fā)酵溫度的升高而逐漸增加，而雜醇油含量隨溫度升高而逐漸降低。所檢測(cè)的巨峰葡萄酒的各項(xiàng)指標(biāo)均符合相關(guān)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，無(wú)安全隱患。