鄭雨婷，王睿，張寧寧

（福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建福州350002）

膠原蛋白是動物結(jié)締組織中的主要成分，含量約占動物總蛋白的25%～30%[1]。膠原蛋白種類十分豐富，目前研究發(fā)現(xiàn)有至少29種膠原蛋白，主要的膠原蛋白類型為Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅴ型和Ⅺ型，其中Ⅰ型膠原蛋白最為常見[2]，主要來源于水產(chǎn)品，約占所有膠原蛋白的90%[3]。膠原蛋白分子量約為300 kDa，由3條肽鏈相互纏繞形成三螺旋結(jié)構(gòu)[4]，每條鏈由1 000個(gè)氨基酸殘基組成，鏈的長度為300nm。膠原蛋白含有18種氨基酸，氨基酸序列的基本單位為Gly-X-Y，它也是膠原蛋白中重復(fù)最多的氨基酸序列，其中X、Y多為脯氨酸（proline，Pro）和羥脯氨酸（hydroxyproline，Hyp）[5]。且羥脯氨酸為膠原蛋白的特征氨基酸[6]。

除上述膠原蛋白共同的結(jié)構(gòu)以及主要的氨基酸組成，水產(chǎn)源膠原蛋白還具有它自身的特點(diǎn)。水產(chǎn)動物來源的膠原蛋白主要類型為I型（魚類和軟體動物）和V型（蝦、蟹和海蜇等）[7]。在具體的氨基酸含量分布上，水產(chǎn)源膠原蛋白的羥脯氨酸含量低于陸生動物來源的膠原蛋白，但蛋氨酸含量高于陸生動物膠原蛋白。較低的羥脯氨酸含量也使水產(chǎn)源膠原蛋白的熱變性溫度低于一般的哺乳動物膠原蛋白，熱穩(wěn)定性較差。Wang等[8]分別從西班牙鯖魚的皮膚和骨骼中提取得到酸溶性膠原蛋白和胃蛋白酶溶性膠原蛋白并對其進(jìn)行變性溫度的研究，結(jié)果4種膠原蛋白的變性溫度均遠(yuǎn)低于哺乳動物和熱帶魚類膠原蛋白。Kimura等[9]則認(rèn)為水產(chǎn)動物膠原蛋白的熱變性溫度與動物間的種屬差異無關(guān)，與水產(chǎn)動物棲息環(huán)境的最高溫度大致相同。Zhuang等[10]對海參斑魚皮膚膠原蛋白熱變性溫度的研究結(jié)果進(jìn)一步證明了膠原蛋白的熱穩(wěn)定性與魚類生長的環(huán)境溫度和體溫有關(guān)。另外水產(chǎn)膠原蛋白在中性鹽以及酸溶液中的溶解性較好，這一性質(zhì)有利于制備可溶性膠原蛋白溶液[11]。

1 水產(chǎn)膠原蛋白提取方法

傳統(tǒng)提取膠原蛋白的主要原料為豬、牛等畜禽的皮、骨等加工廢棄物。近年來由于禽流感等畜類疾病以及某些宗教信仰的限制[12-13]，陸生動物來源的膠原蛋白提取受到影響，而水產(chǎn)生物則不存在上述因素限制，且各功能特性均優(yōu)于陸生動物。因此人們開始關(guān)注用水產(chǎn)生物作為提取膠原蛋白的原料[14]。

1.1 酸法

酸法提取膠原蛋白的基本原理為利用一定濃度的酸溶液在一定條件下改變蛋白質(zhì)所處的外在環(huán)境，使得分子間鹽鍵被破壞，纖維膨脹及溶解，從而將膠原蛋白與其他成分分離。常用處理劑為乳酸、鹽酸、檸檬酸、乙酸、醋酸等[15]，提取出的膠原蛋白常為酸溶性膠原蛋白（acid soluble collagen，ASC）。Minh等[16]成功地利用醋酸從日本和越南的蜥魚、竹莢魚，以及來自日本的鯔魚、飛魚和黃背海鯛中提取出酸溶性膠原蛋白，并鑒定其為I型膠原蛋白。Hamda等[17]利用酸法和酶法在流蘇沙丁魚廢料中提取得到酸溶性膠原蛋白和胃蛋白酶溶性膠原蛋白，二者均表現(xiàn)出與商業(yè)膠原蛋白相似的性質(zhì)，可作為良好的膠原蛋白產(chǎn)品應(yīng)用于各行業(yè)。

1.2 酶法

酶法提取是指利用蛋白酶對原料進(jìn)一步水解，所得產(chǎn)物為酶溶性膠原蛋白（pepsin soluble collagen，PSC）。酶處理可通過水解膠原纖維蛋白的末端肽，提高膠原蛋白的產(chǎn)率，且在水解過程中不破壞膠原蛋白的三股螺旋結(jié)構(gòu)，從而較好的保持其特性。常用的蛋白酶主要有動物蛋白酶，如胰蛋白酶和胃蛋白酶；植物蛋白酶，如木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶；以及微生物蛋白酶，如堿性蛋白酶和中性蛋白酶等。其中應(yīng)用最廣泛的是胃蛋白酶[18-19]。Iswariya等[20]利用胃蛋白酶從海洋河豚魚皮中提取出了性質(zhì)穩(wěn)定且具有生物活性的胃蛋白酶溶性膠原蛋白，提取率達(dá)到了56.6%（干重）。

1.3 堿法

堿法提取即利用一定濃度的堿在一定的外界條件下提取膠原蛋白，常用的處理劑為石灰、氫氧化鈉、碳酸鈉等。溫慧芳等[21]利用堿法從鮰魚皮中提取得到典型的Ⅰ型膠原蛋白多肽。但由于堿法提取膠原蛋白得率較低，且出于安全性考慮，一般情況下不單獨(dú)使用堿法提取膠原蛋白，而是利用堿法配合酸法對膠原蛋白進(jìn)行提取。

1.4 熱水法

熱水法是將原料經(jīng)過除雜蛋白等前處理后，在一定條件下用熱水直接浸提已變性的膠原蛋白或膠原蛋白水解物，常用的溫度有100℃沸水浴、60℃～70℃、40℃～45℃[22]。黃雯[23]通過響應(yīng)面法對熱水抽提斑點(diǎn)叉尾魚皮膠原蛋白的工藝進(jìn)行了優(yōu)化，最終將膠原蛋白得率提高到16.98%。

1.5 鹽法

鹽法提取是利用各種不同的鹽在不同的濃度條件下提取鹽溶性膠原蛋白的方法，常用的處理劑有酸-三羥甲基胺基甲烷（Tris-HCl）、氯化鈉、檸檬酸鹽等[24]，提取后得到的膠原蛋白為鹽溶性膠原蛋白。溫慧芳等[25]分別利用鹽法、酸法、酶法、堿法、熱水法提取鮰魚皮膠原蛋白，并對不同方法所得膠原蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行比較，其中鹽法提取得到的膠原蛋白產(chǎn)物為膠原蛋白多肽。

1.6 其他用于輔助/優(yōu)化膠原蛋白提取的方法

單一的提取方法難以滿足工業(yè)生產(chǎn)的需要，因此更多的采用多種方法復(fù)合或利用超聲波等技術(shù)對膠原蛋白的提取方法進(jìn)行優(yōu)化。陳麗麗等[26]利用乙酸和胃蛋白酶對鰻魚骨膠原蛋白進(jìn)行酸法加酶法復(fù)合提取，對鰻魚骨膠原蛋白提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，最終膠原蛋白提取率達(dá)到80.80%。另有研究者利用超聲波的手段來輔助提取膠原蛋白，從而實(shí)現(xiàn)膠原蛋白提取工藝的優(yōu)化[27-28]。膠原蛋白提取方法及其優(yōu)缺點(diǎn)見表1。

表1 膠原蛋白提取方法及其優(yōu)缺點(diǎn)Table 1 The extraction methods of collagen and its advantages and disadvantages

續(xù)表1 膠原蛋白提取方法及其優(yōu)缺點(diǎn)Contimue table 1 The extraction methods of collagen and its advantages and disadvantages

2 水產(chǎn)膠原蛋白與光老化

2.1 皮膚老化與光老化

皮膚老化是由基因和環(huán)境因素共同造成，其中由基因引起的老化稱為內(nèi)源性老化，環(huán)境因素所造成的老化稱為外源性老化。外源性老化中最主要的一種為光老化，是由于紫外線反復(fù)照射所引起的一系列功能退化性變化[30]。造成皮膚老化和光老化的分子機(jī)制主要包括氧化、DNA損傷、炎癥反應(yīng)、抗氧化劑產(chǎn)生減少以及基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）的生成。光老化對皮膚的影響主要表現(xiàn)在皮膚松弛、暗黃、皺紋、色素沉著等，嚴(yán)重者甚至可導(dǎo)致皮膚的惡性腫瘤[31]。

2.2 膠原蛋白與皮膚光老化

膠原蛋白是一種生物活性大分子，除一般蛋白質(zhì)的營養(yǎng)作用外，還具有一些特殊的生理功能，如抗氧化活性、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（angiotensin converting enzyme，ACE）抑制活性、抗癌活性、抑菌活性[32]、皮膚抗皺紋、金屬離子螯合活性、免疫調(diào)節(jié)活性、增加骨密度[33]等。膠原蛋白在動物體的各組織和器官中起著功能性作用，如組織形成、成熟、細(xì)胞間信息的傳遞等，另外與關(guān)節(jié)潤滑、傷口愈合、鈣化作用和衰老等也有密切的關(guān)系。這些特殊的生理功能以及良好的生物相容性、可生物降解性、低抗原性等使得膠原蛋白在食品、醫(yī)療、美容等行業(yè)應(yīng)用廣泛。近幾年來，膠原蛋白對皮膚的改善作用，尤其是對光老化皮膚的改善作用引起了廣泛關(guān)注。以下簡要介紹幾種水產(chǎn)來源的膠原蛋白對光老化皮膚起改善作用的途徑。

2.2.1 抗氧化活性

皮膚暴露于紫外線中，導(dǎo)致真皮纖維原細(xì)胞的氧化壓力增強(qiáng)，產(chǎn)生活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）等自由基，影響膠原蛋白等皮膚中主要蛋白質(zhì)的合成，從而使皮膚產(chǎn)生皺紋等一系列衰老的現(xiàn)象。膠原蛋白具有良好的抗氧化活性，可通過清除自由基改善受損皮膚[34]，對光老化皮膚也有一定的保護(hù)作用。Zhang等[35]通過研究證明攝入抗氧化膠原蛋白肽能夠減輕紫外線照射引起的皮膚成分異常改變。另外，膠原蛋白的抗氧化特性能夠有效減緩由紫外線引起的體內(nèi)抗氧化指標(biāo)的異常變化[36]。Hou等[37]對鱈魚皮膠原蛋白的研究表明，膠原蛋白肽可通過增強(qiáng)超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD），谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px），過氧化氫酶（catalase，CAT） 的活性以及增加谷胱甘肽（glutathione，GSH）和羥脯氨酸（hydroxyproline，HYP）含量、降低丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量，達(dá)到減少皮膚光損傷的目的，且鱈魚皮膠原蛋白多肽可以保護(hù)皮膚中的肌原纖維。

2.2.2 抑制黑色素合成

皮膚光老化的表征之一即為黑色素沉著，酪氨酸酶是機(jī)體內(nèi)合成黑色素的關(guān)鍵因素[38]。研究表明膠原蛋白可通過抑制酪氨酸酶活力來減少黑色素合成。肖楓對不同相對分子質(zhì)量組分的黃河鯉魚鱗明膠消化產(chǎn)物進(jìn)行研究，證明了魚鱗明膠肽能夠抑制酪氨酸酶的二酚酶活性[39]；王靜鳳等[40]通過小鼠B16黑素瘤細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，證明不同分子量的魷魚皮膠原蛋白肽都具有降低小鼠B16黑素瘤細(xì)胞黑素含量、酪氨酸酶活性及抑制酪氨酸酶基因表達(dá)的作用。

2.2.3 保持皮膚水分

長期的紫外線照射引起皮膚保水能力下降，水分急劇流失，進(jìn)而導(dǎo)致皮膚干燥，甚至因皮膚老化而產(chǎn)生皺紋。膠原蛋白可抑制皮膚水分散失，甚至增加皮膚水分含量，從而改善皮膚受損。孔惠等[41]通過體外實(shí)驗(yàn)以及皮膚測試結(jié)果表明，鮭魚皮膠原蛋白肽可以提高皮膚水分含量和降低經(jīng)表皮失水率。初鑫等[42]通過動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，喂食中、高劑量的膠原蛋白肽飲料可顯著抑制由光老化引起的皮膚水分散失。Song等[43]研究了源于鰱魚皮的膠原蛋白水解物（collagen hydrolysates，CHs）對小鼠光老化的影響，其中證明了每千克體重?cái)z入50、100、200 mg的CHs可使皮膚水分含量呈劑量依賴性增加。

2.2.4 促進(jìn)膠原蛋白合成

紫外線輻射會導(dǎo)致皮膚膠原蛋白含量下降，使得皮膚失去彈性和光澤。有研究表明，可以通過外界攝取膠原蛋白肽促進(jìn)皮膚的膠原蛋白合成。韓鳳杰等[44]通過對小鼠投喂和涂抹膠原蛋白肽的動物實(shí)驗(yàn)證明比目魚皮膚膠原蛋白寡肽能都促進(jìn)皮膚膠原合成。Jian等[45]通過組織學(xué)分析表明，水母膠原蛋白和水母膠原蛋白水解物可修復(fù)內(nèi)源性膠原蛋白和彈性蛋白纖維，并可維持I型與III型膠原的天然比例，而這可能是保護(hù)皮膚免受紫外線損傷的關(guān)鍵機(jī)制之一。

2.2.5 抑制炎癥反應(yīng)

長期的紫外線照射會導(dǎo)致皮膚產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，引起皮膚紅斑、水腫和增生反應(yīng)等炎癥癥狀。有報(bào)道說明由紫外線輻射引起的皮膚炎癥是光老化或腫瘤的前期征兆[46]。有研究證明羥脯氨酸對于炎癥反應(yīng)有一定的抵抗效果[47]，羥脯氨酸則主要存在于膠原蛋白中。Chen等[48]研究發(fā)現(xiàn)，口服膠原蛋白水解物可通過抑制內(nèi)源性抗氧化酶活性的消耗，抑制核因子-κB（nuclear factor-κb，NF-κB）的表達(dá)以及 NF-κB 介導(dǎo)的促炎細(xì)胞因子的表達(dá)來抑制紫外線照射對皮膚的損傷。

3 展望

隨著現(xiàn)代食品工業(yè)的不斷進(jìn)步，膠原蛋白的提取、分離和純化技術(shù)的不斷研究，以及其功能機(jī)理的深入研究，膠原蛋白將會被越來越多的應(yīng)用到各種保健食品的開發(fā)中，作為人們抵抗皮膚衰老的選擇之一。因此，如何從原材料中獲得高得率、高純度并且在人體內(nèi)能夠發(fā)揮相應(yīng)生理功能的膠原蛋白具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。