姚亞林，鄭若欣，程鐵轅，鄧杰，任志強，衛(wèi)春會，黃治國，*

（1.四川輕化工大學(xué)釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點實驗室，四川宜賓644000；2.四川國檢檢測有限責(zé)任公司，四川瀘州646000；3.宜賓海關(guān)，四川宜賓644000）

中國白酒發(fā)酵是多菌復(fù)合的開放式固態(tài)發(fā)酵，其本質(zhì)就是多種微生物通過復(fù)雜的代謝活動及相互作用形成了白酒獨特的風(fēng)味物質(zhì)[1-2]。窖泥是酒體生香功能微生物的繁殖載體，而濃香型白酒生產(chǎn)與窖泥中的微生物密切相關(guān)[3]。目前，對窖泥微生物的研究熱點主要在細(xì)菌，而窖泥中的放線菌卻較少報道。

放線菌，是一類具有分枝狀菌絲體的高（G+C）含量的革蘭氏陽性菌，其次生代謝產(chǎn)物豐富[4]。當(dāng)前對放線菌研究報道主要著重于抗生素[5-7]等方面，而對于窖泥中放線菌在釀造過程中的發(fā)酵特性研究較少，大部分針對放線菌的分類培養(yǎng)[8-10]和窖泥中放線菌的群落分布[11-13]進行研究。李東等[14]發(fā)現(xiàn)放線菌中鏈霉菌產(chǎn)生土味素對白酒的酒質(zhì)有一定影響，初步探索了放線菌對濃香型白酒生產(chǎn)可能的影響；裴樂樂等[15]過熒光定量PCR方法定量檢測窖泥中放線菌的原始Copies數(shù)，發(fā)現(xiàn)放線菌對窖泥質(zhì)量的影響可能受窖池中多種生物和非生物因素的影響；王濤等[16]通過從釀造環(huán)境中分離的123株放線菌的揮發(fā)性產(chǎn)物分析，發(fā)現(xiàn)其能夠產(chǎn)生一些酯類、醇類等重要的濃香型白酒的呈香成分。研究文獻表明[17]，濃香型白酒窖泥中存在大量放線菌，值得繼續(xù)研究。

本試驗以濃香型白酒窖泥中分離的3株放線菌為試驗對象，探究其發(fā)酵特性，進行小型固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酒試驗，最后通過綜合分析酒醅的一系列理化指標(biāo)和揮發(fā)性成分特征，分析該3株放線菌對白酒釀造可能產(chǎn)生的影響，以期為窖泥中放線菌后續(xù)的研究提供指導(dǎo)和經(jīng)驗。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

白色鏈霉菌（Streptomyces albus）A1、桑氏鏈霉菌（Streptomyces sampsonii）A2、魯?shù)劓溍咕⊿treptomyces rutgersensis）A3：濃香型白酒窖泥中分離的3株放線菌，在實驗室用液體石蠟保藏于4℃。

空氣芽孢桿菌（Bacillus aerius）：共酵實驗菌，丁酸菌，來源于四川輕化工大學(xué)釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點實驗室。

1.1.2 原料

大曲：宜賓六尺巷酒業(yè)有限公司；高梁、糠殼：市售。

1.1.3 主要設(shè)備

SW-ZJ-2D超凈工作臺：蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司；PR205740RCN 生化培養(yǎng)箱、MaxQ400 搖床、Pi－Co21臺式高速離心機：Thermo Scientific科技公司；MX-S混勻儀：大龍興創(chuàng)實驗儀器（北京）有限公司；LS-I201微生物培養(yǎng)箱、LS-O610干燥箱：LabServ賽默飛世爾科技公司；Super Alcomat，Gibertini Elettronica SRL酒精濃度計：上海點將精密儀器公司；5975B-7890A氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀：安捷倫科技中國有限公司；50 μm/30 μm DVAB/CAR/PDMS 固相微萃取頭：美國Supelco公司。

1.1.4 主要試劑

葡萄糖、硝酸鉀、氯化鈉、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、硫酸亞鐵、醋酸鈉、可溶性淀粉（分析純）：成都市科龍化工試劑廠；蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、麥芽汁浸粉、瓊脂：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；丁酸鈉，生物試劑（分析純）：上海朝瑞生物科技有限公司；L-半胱氨酸鹽酸鹽（食品級）：河南喜萊客化工有限分司；乙酸丁酯（色譜純）：美國Sigma公司。

1.1.5 培養(yǎng)基

高氏Ⅰ號培養(yǎng)基、酵母膏-麥芽膏（YEME）培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、麥芽汁培養(yǎng)基；強化梭菌培養(yǎng)基：參考文獻[18-19]方法配制。

固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基：麩皮50 g，100 mL復(fù)合無機鹽溶液（氯化鈉0.5%，硝酸鉀1%，磷酸氫二鉀0.5%，硫酸鎂0.5%，硫酸亞鐵0.01%，氫氧化鈉0.8%）。配制3份，裝入250 mL三角瓶，手搖振蕩混勻，潤料1 h后121℃，滅菌20 min。滅菌后及時打散。

1.2 試驗方法

1.2.1 產(chǎn)酶特性研究

1.2.1.1 菌種液制備

在無菌條件下，分別將3株放線菌接種于裝有100mL高氏Ⅰ號液體培養(yǎng)基的三角瓶中，然后于28℃，150 r/min，搖床培養(yǎng)。A1、A2、A3 培養(yǎng) 7 d。

1.2.1.2 麩曲制作

在無菌條件下，各加入30 mL菌種液于固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，手搖振蕩混勻，28℃恒溫培養(yǎng)7 d，每天振勻打散一次。

1.2.1.3 酶活力測定

糖化酶活力、蛋白酶活力、酯化酶活力測定方法同《釀酒分析與檢測》[18]。

1.2.2 共酵試驗

1.2.2.1 菌株單獨培養(yǎng)

將放線菌菌株于高氏1號培養(yǎng)基中，28℃，120r/min，培養(yǎng)3 d。50 mL強化梭菌培養(yǎng)基于藍蓋瓶中培養(yǎng)丁酸菌，密封瓶蓋，30℃，50 r/min培養(yǎng)3 d。

1.2.2.2 共培養(yǎng)

將菌株A1、A2、A3的發(fā)酵液分別混合至丁酸菌液中，每瓶加50 mL。旋緊瓶蓋，30℃，50 r/min培養(yǎng)10 d。

1.2.2.3 丁酸含量測定

利用乙醚萃取發(fā)酵液中的有機酸[20]。取20 mL發(fā)酵液加入帶蓋試管中，每管加3 mL乙醚，旋渦振蕩5 min，靜置10 h。然后轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，5 000 r/min離心10 min。吸取1.5 mL乙醚萃取液，加入10 μL 20 mg/mL的乙酸丁酯內(nèi)標(biāo)進行半定量。使用氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用儀測定，進樣量1 μL。

氣相色譜條件[20]：毛細(xì)管色譜柱為J&W 122-7062，規(guī)格為 60.0 m×250 μm×0.25 μm；手動分流進樣，分流比為12∶1；進樣口溫度250℃；起始溫度：60℃，維持2 min，然后以5℃/min升溫至200℃，維持1 min，再以20℃/min升溫至250℃，維持2 min；以He為載氣，流量為1 mL/min。

質(zhì)譜條件[20]：電離方式EI，電子能量70 eV，離子源溫度230℃，四極桿溫度100℃，恒壓10 Pa，全掃描。

1.2.3 固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酒試驗

以大曲為主要糖化發(fā)酵劑，添加放線菌菌液進行小型模擬固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酒試驗。

1.2.3.1 釀酒操作流程

使用2 L陶壇模擬釀酒發(fā)酵容器，參照濃香型大曲酒的配料參數(shù)準(zhǔn)備原料[21]，高粱、大曲與糠殼的質(zhì)量配比為 5∶1∶1。

將密封好的陶壇置于陰涼處自然發(fā)酵。發(fā)酵45 d后，取出緩慢蒸餾，測定酒醅理化指標(biāo)和酒醅揮發(fā)性成分。

1.2.3.2 理化指標(biāo)測定

酒醅的酸度、還原糖含量、淀粉含量及酒精度測定同文獻[18-19]方法操作。

1.2.3.3 酒醅揮發(fā)性成分分析

采用頂空固相微萃取法（headspace solid-phase microextraction，HS-SPME）提取高粱固態(tài)醅的揮發(fā)性成分。稱取高粱醅5.0 g/瓶，并加入5 μL 20 mg/mL的乙酸丁酯標(biāo)品進行半定量分析。于60℃恒溫條件下平衡20 min，萃取40 min，進樣通過氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（gas hromatography-mass spectrometer，GC-MS）分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理及分析

每組試驗重復(fù)3次，試驗結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。使用SPSS軟件對數(shù)據(jù)進行分析，同時采用Excel對數(shù)據(jù)進行編輯繪圖。

2 結(jié)果分析與討論

2.1 3株放線菌的糖化酶活力、蛋白酶活力和酯化酶活力比較

糖化酶是淀粉質(zhì)原料被轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵性糖的重要的酶，糖化酶活力越高，越能提高對發(fā)酵原料的利用率，一般濃香型大曲的糖化酶活力為600 U/g～700 U/g左右[22]。本試驗比較研究了3株放線菌的糖化酶活力，結(jié)果如圖1所示。

圖1 3株放線菌的糖化酶活力比較Fig.1 Comparison of glucoamylase activity of three strains of actinomycetes

A1、A2 的糖化酶活力分別為 （774.2±13.6）、（661.8±10.2）U/g。可見放線菌菌株 A1、A2具有較高的產(chǎn)糖化酶的能力；而A3的糖化酶活力相比A1、A2差異顯著（P＜0.05），對原料的利用率較差。

蛋白酶在白酒釀造的環(huán)境中，將原料蛋白質(zhì)分解成氨基酸，而氨基酸是許多香味物質(zhì)的前體物質(zhì)，既可在微生物或酶作用下生成高級醇，也可與還原糖結(jié)合發(fā)生美拉德反應(yīng)生成各種含氮有機物，有利于白酒的風(fēng)味形成[21]。本試驗比較研究了3株菌的蛋白酶活力，結(jié)果如圖2所示。

A1、A2的蛋白酶活力都達到100 U/g以上，且A2的蛋白酶活力顯著高于A1（P＜0.05），而A3蛋白酶活未檢出。與周敬波的研究結(jié)果[23]相比，此2株菌蛋白酶活力相對較低，可能是選用的試驗菌株不同。

酯化酶活力是評價大曲生香能力的重要指標(biāo)。酯化力越高，表明在白酒釀造中能夠生成更多的酯類化合物。本試驗比較研究了3株菌的酯化酶活力，結(jié)果如圖3所示。

圖2 2株放線菌的蛋白酶活力比較Fig.2 Comparison of protease activity between two strains of actinomycetes

圖3 3株放線菌的酯化酶活力比較Fig.3 Comparison of esterification enzyme activity of three strains of actinomycetes

A2麩曲的酯化力為（26.0±0.8）mg/（g·100 h），顯著高于 A1、A3的酯化力（P＜0.05）；表明 A2菌株制作的麩曲更有利于白酒生香。

2.2 3株放線菌與丁酸菌共酵產(chǎn)酸結(jié)果比較

丁酸是丁酸乙酯的前體物質(zhì)，窖內(nèi)的丁酸可以與乙醇酯化生成丁酸乙酯（白酒中四大酯之一），丁酸含量的增加能夠提高白酒中丁酸乙酯的含量；同時丁酸也是己酸合成的中間產(chǎn)物[24]。

本試驗比較研究了3株放線菌與丁酸菌共酵后的丁酸產(chǎn)量，對共酵培養(yǎng)液中的丁酸含量利用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀以乙酸丁酯為內(nèi)標(biāo)，半定量測定，結(jié)果如圖4所示。

由圖4可知，在添加放線菌菌液后，試驗組的丁酸含量都超過1 000 mg/L，并且A1、A2、A3試驗組丁酸含量都顯著高于對照組（P＜0.05），說明放線菌的共培養(yǎng)可以促進丁酸菌產(chǎn)酸。

2.3 添加放線菌液的固態(tài)發(fā)酵結(jié)果分析

2.3.1 酒醅酒精含量分析

不同試驗組酒醅酒精含量測定結(jié)果見圖5。

圖4 對照組與試驗組共酵液的丁酸含量比較Fig.4 Comparison of butyric acid content between control group and experimental group

圖5 對照組與試驗組的酒精含量比較Fig.5 Comparison of alcohol content between control group and experimental group

由圖5可知，試驗組的酒精度均顯著低于對照組（P＜0.05），試驗組酒精度的下降可能是由于放線菌的抑菌作用，而使酵母菌產(chǎn)酒精代謝受到抑制，酒精含量明顯降低，這與杜海[25]的研究結(jié)果一致。杜海發(fā)現(xiàn)，同一釀造環(huán)境中，鏈霉菌的生長代謝對釀造功能微生物有不同程度的抑制作用，如對釀酒酵母、異常畢赤酵母等具有明顯抑制作用。即鏈霉菌對產(chǎn)酒有一定的抑制作用。而與劉鴻[26]研究結(jié)果有所區(qū)別，可能是選用的試驗菌株和菌液添加量不同導(dǎo)致的。

2.3.2 酒醅酸度分析

多種有機酸是白酒中重要呈香呈味物質(zhì)及前體物質(zhì)，酸類物質(zhì)的增加有利于提高酯類含量，但酸度過高也會有不利的影響[27]。本試驗研究了添加放線菌對酒醅酸度的影響，試驗測得的酸度為總酸度，反映的是窖（壇）內(nèi)發(fā)酵產(chǎn)生有機酸的情況。結(jié)果如圖6所示。

由圖6可知，3個試驗組的酒醅酸度都顯著高于對照組（P<0.05），且各試驗組均差異顯著。結(jié)合酸度與酒精度分析發(fā)現(xiàn)，兩者對應(yīng)試驗組的酸度和酒精度含量呈相反狀態(tài)，表明產(chǎn)酒精代謝途徑被抑制，但可能變相促進了酸的形成。這與共酵結(jié)果相似，說明添加放線菌可能能夠提高共酵菌株產(chǎn)酸能力。

圖6 對照組與試驗組的酸度比較Fig.6 Comparison of acidity between control group and experimental group

2.3.3 酒醅還原糖與淀粉含量分析

對照組與試驗組的還原糖含量比較見圖7；對照組與試驗組的淀粉含量比較見圖8。

圖7 對照組與試驗組的還原糖含量比較Fig.7 Comparison of reducing sugar content between control group and experimental group

圖8 對照組與試驗組的淀粉含量比較Fig.8 Comparison of starch content between control group and experimental group

在發(fā)酵過程中，原料中的淀粉首先被大曲中的或微生物產(chǎn)生的糖化酶水解成可發(fā)酵性糖，可發(fā)酵性糖再被微生物利用，生長代謝產(chǎn)生醇、酸、醛、酯等物質(zhì)。由圖7和圖8可知：各組試驗還原糖差異不顯著（P＞0.05），A2 組淀粉含量較對照組差異顯著（P＜0.05），而其他3組的淀粉含量差異不顯著。對于這一現(xiàn)象，結(jié)合酒精度和酸度分析：A2的酶活較強，能夠更多地降解淀粉生成可發(fā)酵性糖；放線菌鏈霉菌屬有一定的抑制產(chǎn)酒的作用[25]，使得實驗組產(chǎn)酒率降低；在抑制產(chǎn)酒的基礎(chǔ)上，可發(fā)酵性糖被酸代謝途徑轉(zhuǎn)化成大量的酸類物質(zhì)，同時在酯化酶作用下酸醇酯化，消耗酸與醇生成各種酯類物質(zhì)。

2.3.4 酒醅揮發(fā)性產(chǎn)物分析

通過固相微萃取提取酒醅中的揮發(fā)性成分，并用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀進行檢測，以乙酸丁酯為內(nèi)標(biāo)進行半定量測定揮發(fā)性成分含量，檢測結(jié)果見表1。

表1 酒醅揮發(fā)性成分種類與含量Table 1 The species and content of volatile components in fermented grains

續(xù)表1 酒醅揮發(fā)性成分種類與含量Continue table 1 The species and content of volatile components in fermented grains

由表1可知，添加了放線菌液的酒醅揮發(fā)性成分種類都多于未添加菌液的對照組：A1組＞A2組＞A3組＞對照組。

總酯是衡量濃香型大曲酒基酒質(zhì)量的重要指標(biāo)，主要是由己酸乙酯、乙酸乙酯、乳酸乙酯構(gòu)成，其中己酸乙酯是主體香味成分[28]?？梢钥闯鎏砑臃啪€菌后乙酸乙酯、乳酸乙酯、己酸乙酯含量都顯著高于對照組（P＜0.05），A2 組更為明顯，其乙酸乙酯、乳酸乙酯、己酸乙酯含量分別為115.2、5.4、2.4 mg/100 g，這可能是由于添加放線菌后窖內(nèi)酸度的增加或者是放線菌產(chǎn)生的酯化酶的作用使得酯類物質(zhì)含量增加。并且A2組的總酯含量最高，對白酒的香味貢獻更加明顯。

3-羥基-2-丁酮與2，3-丁二醇是白酒中重要的風(fēng)味成分，是體現(xiàn)濃香型基酒品質(zhì)的重要指標(biāo)。3-羥基-2-丁酮與2，3-丁二醇的含量越高，會使得白酒更加醇厚、香甜。此外，高含這兩種成分的基酒可以用作調(diào)味酒[29]。試驗組中兩種成分的含量都顯著高于對照組（P＜0.05）。且各組試驗均未檢出土味素，可能是由于后期壇內(nèi)空氣被消耗，酸度升高而使放線菌的生長受到抑制，未進入后期的次級代謝過程[14]。

對照組與試驗組的乙酸乙酯與總酯含量比較見圖9。

對照組與試驗組的乳酸乙酯和己酸乙酯含量比較見圖10。

對照組與試驗組的3-羥基-2-丁酮含量和2，3-丁二醇含量比較見圖11。

圖9 對照組與試驗組的乙酸乙酯與總酯含量比較Fig.9 Comparison of ethyl acetate and total ester content between control group and experimental group

圖10 對照組與試驗組的乳酸乙酯和己酸乙酯含量比較Fig.10 Comparison of ethyl lactic acid and ethyl caproate between control group and experimental group

圖11 對照組與試驗組的3-羥基-2-丁酮含量和2，3-丁二醇含量比較Fig.11 Comparison of 3-hydroxyl-2-butanone content and 2，3-butanediol content between the control group and the experimental group

3 小結(jié)

對3株放線菌的產(chǎn)酶能力進行研究，結(jié)果表明，窖泥中的放線菌具備一定產(chǎn)釀酒相關(guān)酶的能力。白色鏈霉菌A1、桑氏鏈霉菌A2的麩曲糖化酶活力分別為（774.2±13.6）、（661.8±10.2）U/g，蛋白酶活力分別達到了（129.1±2.3）、（146.3±1.6）U/g，表明白色鏈霉菌和桑氏鏈霉菌有較強的淀粉水解和蛋白質(zhì)分解能力，應(yīng)用于生產(chǎn)可能能夠提高原料的利用率[23]。桑氏鏈霉菌的麩曲酯化酶活力達到（26.0±0.8）mg/（g·100 h），產(chǎn)酯化酶能力顯著高于其他菌株，在生產(chǎn)中可能可以提高基酒的酯類含量。

共酵試驗發(fā)現(xiàn)，放線菌能顯著促進丁酸菌產(chǎn)酸（P＜0.05），對于調(diào)節(jié)窖內(nèi)酸度以及提供酒體香味前體物質(zhì)有重要作用。通過固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酒試驗綜合考察3株放線菌對白酒釀造的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)添加放線菌菌種液的試驗組酒醅揮發(fā)物成分高于未添加菌種的酒醅，酸類和酯類等香味成分更為豐富，如3-羥基-2-丁酮與2，3-丁二醇的含量都顯著大于對照組（P＞0.05）；試驗組酒精含量顯著低于對照組（P＜0.05），但試驗組酸度更高，并且總酯、乙酸乙酯、乳酯乙酯、己酸乙酯含量均顯著提高，可能是放線菌對酵母有抑制產(chǎn)酒的作用，這與杜海[25]的研究結(jié)果相符合，另外，可能是在酯化酶的作用下，醇酸酯化，使得乙醇被消耗。在酒醅成分分析中，沒有發(fā)現(xiàn)土味素，可能是隨著發(fā)酵進行，乙醇濃度與酸度升高，產(chǎn)土味素機制被抑制[30]。

本研究表明，放線菌在白酒釀造過程起一定作用，能夠提高白酒的風(fēng)味與品質(zhì)。相對而言，桑氏鏈霉的發(fā)酵性能更好，能夠生成更多的香味成分，總酯含量最高，使得基酒酒體香味濃郁，對白酒香型形成可能有更多的貢獻價值。本研究為放線菌在白酒釀造中的特性研究及應(yīng)用提供了一定的參考，但放線菌在白酒釀造中的具體代謝途徑與能量循環(huán)，還需要進一步探索。