陳 靜，王朝霞，朱桂蘭，魯紅俠，班 恒，張 瑜

（合肥師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，安徽合肥 230061）

隨著生活水平的日益提高，綠色健康食品也越來(lái)越受到大眾的重視和喜愛(ài)。果醋是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種新型高價(jià)值營(yíng)養(yǎng)型飲品[1]。果醋集水果和食醋的優(yōu)點(diǎn)于一身，以水果或果品加工下腳料為主要原料，利用現(xiàn)代生物技術(shù)釀制而成。不僅風(fēng)味優(yōu)良而且還含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和生物活性保健成分[2]。研究發(fā)現(xiàn)，果醋具有多種保健功效[3-5]：①經(jīng)常食用果醋，能降低膽固醇；②果醋中含有豐富的維生素、氨基酸和氧，能在體內(nèi)與鈣質(zhì)合成醋酸鈣，增強(qiáng)鈣質(zhì)的吸收；③果醋中還含有豐富的維C，能防止細(xì)胞癌變和細(xì)胞衰老；④果醋中所含有的有機(jī)酸、甘油和醛類物質(zhì)，可以平衡皮膚的pH值，控制油脂分泌、擴(kuò)張血管；⑤能促進(jìn)身體的新陳代謝、調(diào)節(jié)酸堿平衡、消除疲勞。

血橙（Citrus sinensis L，Osbeck），蕓香科柑橘屬下甜橙類，果肉成熟時(shí)橙紅或紫紅色，是柑橘中唯一含花色苷的品種[6]。血橙不僅果肉細(xì)嫩、香味濃郁，而且營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，含有豐富的維C、類黃酮、花青素和多酚等生物活性物質(zhì)，具有抗氧化、促進(jìn)血液循環(huán)、改善貧血、提高機(jī)體免疫力等藥用價(jià)值，深受廣大消費(fèi)者的喜愛(ài)[7-8]。

血橙首次出現(xiàn)在1850年的歐洲，主要種植在西班牙、意大利和北美等區(qū)域。中國(guó)各地有大量栽培，主要產(chǎn)區(qū)在四川、江西。目前，血橙主要以鮮果銷售的方式出售，然而血橙鮮果采摘周期短，上市時(shí)間較為短暫集中，且不耐貯藏，不能像蘋(píng)果一樣實(shí)現(xiàn)周年供應(yīng)。關(guān)于血橙深加工產(chǎn)品的研究較少，主要集中在果汁[9-11]和果酒[12-13]等產(chǎn)品。為進(jìn)一步加強(qiáng)血橙深加工，緩解鮮銷壓力的同時(shí)也能夠擴(kuò)大產(chǎn)業(yè)鏈。以血橙為原料，采取兩步液態(tài)發(fā)酵法，研究了酒精發(fā)酵階段和醋酸發(fā)酵階段的關(guān)鍵技術(shù)，從而進(jìn)一步優(yōu)化血橙果醋的加工工藝條件，為血橙果醋的釀造工藝提供一定的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

血橙，重慶萬(wàn)州提供；果膠酶，鄭州超凡化工有限公司提供；食用級(jí)白砂糖，中糧集團(tuán)提供；安琪酵母葡萄酒果酒專用酵母SY，安琪酵母股份有限公司提供；滬釀1.01醋酸菌，上海釀造一廠提供；氫氧化鈉、酚酞，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供。所用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

L13-Y91型榨汁機(jī)，九陽(yáng)股份有限公司產(chǎn)品；電子分析天平、722s型可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；JK-3200B型超聲波清洗器，合肥市尼克機(jī)械制造有限公司產(chǎn)品；恒溫水浴鍋，江蘇省金壇市杰瑞爾電器有限公司產(chǎn)品；Anke TDL-5A型離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠產(chǎn)品；WAY-2W型阿貝折光儀，上海精科物光有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 工藝流程

選果→去皮→壓榨→脫苦澄清→過(guò)濾→酒精發(fā)酵→醋酸發(fā)酵→澄清→殺菌。

1.3.2 預(yù)處理

將新鮮血橙靜置24℃條件下12 d脫苦[14]，清水沖洗干凈后剝皮，去囊衣，榨汁，過(guò)濾，然后向其加入果膠酶進(jìn)一步澄清去苦，50℃下水浴2 h，再用紗布過(guò)濾，得到脫苦、澄清的橙汁，用于酒精發(fā)酵。

1.3.3 酒精發(fā)酵階段單因素試驗(yàn)

（1）加糖量的影響。將脫苦澄清后的橙汁接種已活化酵母菌，28℃下恒溫發(fā)酵5 d，其中每組加糖量分別為0，30，60，90 g/L，測(cè)評(píng)發(fā)酵結(jié)束后的酒精度，計(jì)算乙醇轉(zhuǎn)化率。

（2）發(fā)酵溫度的影響。將脫苦澄清后的橙汁接種已活化酵母菌，初始糖度30 g/L，分別靜置于18，23，28，33℃的恒溫箱發(fā)酵5 d，測(cè)評(píng)發(fā)酵結(jié)束后的酒精度，計(jì)算乙醇轉(zhuǎn)化率。

（3）發(fā)酵時(shí)間的影響。將脫苦澄清后的橙汁接種已活化酵母菌，初始糖度30 g/L，28℃下恒溫發(fā)酵，分別測(cè)評(píng)發(fā)酵時(shí)間為2，4，6，8 d后的酒精度，計(jì)算乙醇轉(zhuǎn)化率。

1.3.4 醋酸發(fā)酵階段單因素試驗(yàn)

（1）醋酸菌接種量對(duì)產(chǎn)酸的影響。在酒精度為6%，按20%的裝液量，初始pH值4，溫度35℃的條件下，在轉(zhuǎn)速為120 r/min的恒溫?fù)u床環(huán)境中發(fā)酵5 d，將3%，6%，9%，12%醋酸菌種液接入酒液中，測(cè)評(píng)發(fā)酵結(jié)束后的酸度，計(jì)算產(chǎn)酸轉(zhuǎn)化率。

（2）初始發(fā)酵pH值對(duì)產(chǎn)酸的影響。在酒精度為6%，按20%的裝液量，10%醋酸菌種子液，溫度35℃條件下，在轉(zhuǎn)速為120 r/min的恒溫?fù)u床環(huán)境中發(fā)酵5 d，將初始發(fā)酵pH值調(diào)至3.5，4.0，4.5，5.0，測(cè)評(píng)發(fā)酵結(jié)束后的酸度，計(jì)算產(chǎn)酸轉(zhuǎn)化率。

（3） 不同裝液量對(duì)產(chǎn)酸的影響。在酒精度為6%，10%醋酸菌種子液，初始pH值4，溫度35℃條件下，分別按10%，20%，30%，40%的裝液量，在轉(zhuǎn)速為120 r/min的恒溫?fù)u床環(huán)境中發(fā)酵5 d，測(cè)評(píng)發(fā)酵結(jié)束后的酸度，計(jì)算產(chǎn)酸轉(zhuǎn)化率。

1.3.5 正交試驗(yàn)

在醋酸發(fā)酵階段各單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇醋酸菌接種量、裝液量、初始pH值為考查因素，以產(chǎn)酸的質(zhì)量濃度和產(chǎn)酸轉(zhuǎn)化率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，進(jìn)行三因素三水平正交試驗(yàn)。

1.3.6 理化指標(biāo)檢測(cè)

酒精度采用GB 5009.225—2016標(biāo)準(zhǔn)中比重法測(cè)定乙醇質(zhì)量濃度[15]，根據(jù)《酒精生產(chǎn)分析檢驗(yàn)》[16]將酒精度換算成酒精濃度，計(jì)算乙醇轉(zhuǎn)化率；糖度采用阿貝折光儀測(cè)定；酸度參考GB/T 12456—2008標(biāo)準(zhǔn)[17]中酸堿滴定法測(cè)定，并計(jì)算總酸轉(zhuǎn)化率。

2 結(jié)果與分析

2.1 酒精發(fā)酵階段

2.1.1 不同加糖量對(duì)酒精發(fā)酵階段的影響

不同加糖量對(duì)乙醇質(zhì)量濃度和乙醇轉(zhuǎn)化率的影響見(jiàn)圖1。

在酒精發(fā)酵階段，葡萄糖經(jīng)過(guò)充分發(fā)酵，轉(zhuǎn)化為足量的乙醇是保證下一階段醋酸發(fā)酵產(chǎn)酸充足的重要條件。由圖1可知，隨著加糖量從0增加到90 g/L時(shí)，產(chǎn)出的乙醇質(zhì)量濃度從33.92 g/L不斷增加到75.14 g/L，呈現(xiàn)出逐漸增大的趨勢(shì)，乙醇轉(zhuǎn)化率卻呈現(xiàn)先增大再減小的趨勢(shì)，在加糖量為30 g/L時(shí)轉(zhuǎn)化率達(dá)最大值，為86.89%。因?yàn)榫凭l(fā)酵過(guò)程主要是酵母菌利用糖類，在無(wú)氧的環(huán)境下將其轉(zhuǎn)化為酒精和二氧化碳，發(fā)酵液糖質(zhì)量濃度會(huì)直接影響產(chǎn)酒量。原果汁中的糖質(zhì)量濃度為102 g/L，隨著加糖量增加，待發(fā)酵血橙汁中糖質(zhì)量濃度也增加，在糖質(zhì)量濃度較低時(shí)產(chǎn)酒量較低，隨著糖質(zhì)量濃度逐漸增加，產(chǎn)出乙醇質(zhì)量濃度逐漸增加，但糖濃度過(guò)高會(huì)影響酵母的生長(zhǎng)代謝和發(fā)酵，使得發(fā)酵進(jìn)行不徹底，從而影響酵母對(duì)糖的利用效率，表現(xiàn)出乙醇轉(zhuǎn)化率隨著糖量增加卻下降的現(xiàn)象。因此，較佳的初始加糖量為30 g/L，此時(shí)乙醇質(zhì)量濃度為57.73 g/L，乙醇轉(zhuǎn)化率為86.89%。

2.1.2 不同發(fā)酵溫度對(duì)酒精發(fā)酵階段的影響

不同發(fā)酵溫度對(duì)乙醇質(zhì)量濃度和乙醇轉(zhuǎn)化率的影響見(jiàn)圖2。

發(fā)酵階段合理的溫度控制對(duì)于酵母菌在橙汁中的生長(zhǎng)繁殖和發(fā)酵活動(dòng)至關(guān)重要。由圖2可知，隨著酒精發(fā)酵溫度從18℃增加到33℃，產(chǎn)出乙醇質(zhì)量濃度呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，在發(fā)酵溫度為28℃時(shí)乙醇質(zhì)量濃度最大，為47.13 g/L；乙醇轉(zhuǎn)化率也相應(yīng)呈現(xiàn)出先增大后減小的趨勢(shì)，同時(shí)在28℃時(shí)，乙醇轉(zhuǎn)化率達(dá)最大值92.22%。因?yàn)?5～30℃是酵母菌的生長(zhǎng)適宜溫度，當(dāng)溫度過(guò)低或過(guò)高時(shí)，酵母菌的生長(zhǎng)繁殖和發(fā)酵活動(dòng)都不能高效率進(jìn)行，酵母菌將糖轉(zhuǎn)化成酒精的活動(dòng)就會(huì)受到影響，進(jìn)而影響產(chǎn)酒量和產(chǎn)酒轉(zhuǎn)化率。因此，酒精發(fā)酵的較佳溫度是28℃，在此條件下乙醇質(zhì)量濃度為47.13 g/L，乙醇轉(zhuǎn)化率為92.22%。

2.1.3 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)酒精發(fā)酵階段的影響

不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)乙醇濃度和乙醇轉(zhuǎn)化率的影響見(jiàn)圖3。

酒精發(fā)酵主要分為發(fā)酵前期、主發(fā)酵期和后發(fā)酵期3個(gè)階段。由圖3可知，隨著酒精發(fā)酵時(shí)間從2 d增加到8 d，產(chǎn)出乙醇質(zhì)量濃度呈現(xiàn)先增大后平穩(wěn)趨勢(shì)，在發(fā)酵第6天乙醇質(zhì)量濃度達(dá)最大值，且第8天的乙醇質(zhì)量濃度未發(fā)生明顯變化；乙醇轉(zhuǎn)化率也呈現(xiàn)出先增大后平穩(wěn)的趨勢(shì)，且在發(fā)酵第6天乙醇轉(zhuǎn)化率達(dá)最大值，第8天乙醇轉(zhuǎn)化率無(wú)明顯變化。因?yàn)樵诎l(fā)酵前期，發(fā)酵液中主要進(jìn)行的是酵母菌的有氧繁殖，故此時(shí)產(chǎn)酒量不佳，乙醇轉(zhuǎn)化率較低；當(dāng)氧氣含量逐漸降低，發(fā)酵液中主要進(jìn)行酵母菌無(wú)氧發(fā)酵時(shí)，產(chǎn)酒量明顯增加，乙醇轉(zhuǎn)化率也較高；此后，隨著糖分逐漸消耗殆盡，發(fā)酵過(guò)程慢慢結(jié)束，發(fā)酵液中不再產(chǎn)酒，乙醇轉(zhuǎn)化率趨于平穩(wěn)。因此，酒精發(fā)酵的較佳時(shí)間為6 d，在此條件下乙醇質(zhì)量濃度為61.72 g/L，乙醇轉(zhuǎn)化率為92.86%。

2.2 醋酸發(fā)酵階段

2.2.1 不同醋酸菌接種量對(duì)醋酸發(fā)酵階段的影響

不同醋酸菌接種量對(duì)醋酸發(fā)酵階段的影響見(jiàn)圖4。

由圖4可知，當(dāng)醋酸接種量從3%增加到12%時(shí)，總酸質(zhì)量濃度呈現(xiàn)出先增大后減小的趨勢(shì)，在接種量為9%時(shí)，產(chǎn)酸量最大，為41.60 g/L；產(chǎn)酸轉(zhuǎn)化率也呈現(xiàn)出先增大后減小的趨勢(shì)，在接種量為9%時(shí)，產(chǎn)酸轉(zhuǎn)化率達(dá)最大值65.86%。在一定接種量范圍內(nèi)，隨著接種量增大，醋酸菌能高效利用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)產(chǎn)酸，當(dāng)接種量過(guò)高，醋酸菌利用發(fā)酵液中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行繁殖，產(chǎn)生過(guò)量的代謝產(chǎn)物，影響產(chǎn)酸，使得產(chǎn)酸量和總酸轉(zhuǎn)化率較低。因此，血橙果醋較佳的醋酸菌接種量為9%，在此條件下總酸質(zhì)量濃度為41.60 g/L，產(chǎn)酸轉(zhuǎn)化率為65.86%。

2.2.2 不同初始pH值對(duì)醋酸發(fā)酵階段的影響

由圖5可知，當(dāng)初始pH值從4.0增加到5.5時(shí)，總酸質(zhì)量濃度呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)pH值為5.0時(shí)，總酸質(zhì)量濃度達(dá)最大值48.74 g/L；總酸轉(zhuǎn)化率也呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)pH值為5.0時(shí)，總酸轉(zhuǎn)化率也達(dá)最大值，為77.11%。pH值為3.5～6.0時(shí)，較適宜醋酸菌生長(zhǎng)代謝，pH值過(guò)高或過(guò)低都會(huì)對(duì)醋酸菌生長(zhǎng)代謝和有氧發(fā)酵產(chǎn)生不利影響，抑制產(chǎn)酸活動(dòng)。血橙果醋較佳的發(fā)酵初始pH值為5.0，在此條件下，總酸質(zhì)量濃度為48.74 g/L，總酸轉(zhuǎn)化率為77.11%。

不同初始pH值對(duì)總酸質(zhì)量濃度和總酸轉(zhuǎn)化率的影響見(jiàn)圖5。

2.2.3 不同裝液量對(duì)醋酸發(fā)酵階段的影響

不同裝液量對(duì)總酸質(zhì)量濃度和總酸轉(zhuǎn)化率的影響見(jiàn)圖6。

由圖6可知，當(dāng)裝液量從10%增加到40%時(shí)，總酸質(zhì)量濃度呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)裝液量為30%時(shí)，總酸質(zhì)量濃度達(dá)最大值43.11 g/L；總酸轉(zhuǎn)化率也呈現(xiàn)先升后降趨勢(shì)，當(dāng)裝液量為30%時(shí)，總酸轉(zhuǎn)化率達(dá)最大值68.34%。當(dāng)裝液量較低時(shí)，發(fā)酵液中酒精含量較少，產(chǎn)酸較少，同時(shí)由于裝液量較低，總酸有部分揮發(fā)，而導(dǎo)致總酸轉(zhuǎn)化率較低；當(dāng)裝液量較高的時(shí)候，發(fā)酵液中的氧氣體積含量減小，醋酸菌不能充分進(jìn)行有氧發(fā)酵，從而導(dǎo)致總酸降低，總酸轉(zhuǎn)化率也降低。因此，30%裝液量是較佳裝液量，在此條件下，總酸質(zhì)量濃度達(dá)最大值，為43.11 g/L；總酸轉(zhuǎn)化率也達(dá)最大值68.34%。

2.3 血橙果醋醋酸發(fā)酵階段正交試驗(yàn)

正交因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1，醋酸發(fā)酵階段正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 正交因素與水平設(shè)計(jì)

表2 醋酸發(fā)酵階段正交試驗(yàn)結(jié)果

由表1可知，在血橙果醋發(fā)酵階段各單因素試驗(yàn)中，選擇醋酸菌接種量、裝液量、初始pH值為試驗(yàn)因素，以總酸質(zhì)量濃度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，進(jìn)行三因素三水平正交試驗(yàn)，從而得出發(fā)酵階段更佳的工藝條件。

由表2可知，各因素對(duì)總酸質(zhì)量濃度影響大小關(guān)系為A＞B＞C，即接種量＞初始pH值＞裝液量，較佳水平為A2B3C3，即接種量為9%，初始pH值為5.0，裝液量為30%時(shí)為較佳發(fā)酵工藝條件，此時(shí)總酸質(zhì)量濃度為49.81 g/L，總酸轉(zhuǎn)化率為78.92%。

3 結(jié)論

以血橙為原料，采取兩步液態(tài)發(fā)酵法，優(yōu)化了血橙果醋釀造工藝。通過(guò)試驗(yàn)得出最佳的工藝參數(shù)為酒精發(fā)酵階段，加糖量30 g/L，發(fā)酵溫度28℃，發(fā)酵時(shí)間6 d，產(chǎn)出乙醇質(zhì)量濃度為61.7 g/L，乙醇轉(zhuǎn)化率最高為92.86%；醋酸發(fā)酵階段，醋酸菌接種量9%、初始pH值5.0、裝液量30%、發(fā)酵5 d時(shí)，總酸質(zhì)量濃度達(dá)到49.8 g/L，總酸轉(zhuǎn)化率最高為78.92%，為血橙果醋的釀造提供一定的理論基礎(chǔ)。