急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)是冠狀動脈急性、持續(xù)性缺血缺氧所引起的心肌壞死。臨床上一般表現(xiàn)為劇烈持久的胸骨后疼痛，伴有血清心肌酶活性增高及心電圖的進(jìn)行性改變，常并發(fā)心律失常、休克或心力衰竭等威脅生命的癥狀，一般經(jīng)休息和給予硝酸酯類藥物并不能緩解。近年來，我國該病的發(fā)生率、死亡率明顯上升，嚴(yán)重威脅人民的生命健康[1-3]。降低疾病的發(fā)生率及死亡率是我國目前面臨的一個重大問題?，F(xiàn)階段臨床診斷AMI的主要方法是對病人進(jìn)行心電圖檢查，觀察心肌損傷標(biāo)記物及影像學(xué)變化[4]。但是由于上述標(biāo)志物對于疾病的檢測并不完善，如對心肌缺血疾病的敏感性以及特異性有一定缺陷，需要反復(fù)檢查，嚴(yán)重影響了疾病的診斷。有學(xué)者提出，microRNA表達(dá)與AMI預(yù)后可能存在重要關(guān)系，目前尚少有研究報道m(xù)iR-126、miR-210的表達(dá)水平與AMI預(yù)后的相關(guān)性[5-6]。本研究擬檢測AMI病人血清中miR-126、miR-210的表達(dá)水平，探討其表達(dá)水平以及對病人預(yù)后評價的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2016年5月—2017年10月青島市中心醫(yī)院收治的64例AMI病人(均為采血前未接受藥物治療)作為觀察組，符合AMI診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]。其中主要的肌鈣蛋白升高(至少超過99%參考值上限)，并至少伴有以下一項指標(biāo)：①心肌缺血癥狀；②病理學(xué)Q波形成；③缺血性心電圖改變，如ST-T改變或左束支傳導(dǎo)阻滯；④影像學(xué)顯示異常，如心肌活性喪失或局部壁室運動異常；⑤證實冠狀動脈內(nèi)有血栓。對照組：選擇同期健康體檢者64名(采血前未接受藥物治療)，入選標(biāo)準(zhǔn)為無胸痛、無心電圖、心肌標(biāo)志物、血常規(guī)、胸片、肝腎功能等異常變化。觀察組和對照組排除標(biāo)準(zhǔn)：①嚴(yán)重肝腎功能不全病人；②自身免疫性疾??；③惡性腫瘤；④感染性疾病。兩組研究對象性別、年齡、吸煙情況、高血壓、收縮壓、舒張壓、糖尿病、肌酐、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。同時將AMI病人按全球急性冠脈事件登記(GRACE)評分[8]分為高危組(>140分)、中危組(109～140分)、低危組(≤108分)。詳見表1。本研究內(nèi)容獲得病人及其家屬的知情同意，并簽署知情同意書，本研究經(jīng)過青島市中心醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

表1 兩組基線資料比較

注：1 mmHg =0.133 kPa。

1.2 方法

1.2.1 儀器與試劑 美國Sigma的高速冷凍離心機(jī)，Roche公司的Cobas600 E601全自動電化學(xué)發(fā)光分析儀及試管等。

1.2.2 樣本收集 使用無抗凝劑的采血管抽取受試對象外周靜脈血4 mL，在室溫下以3 000 r/min離心15 min，使用1.5 mL PE管取上清液，存放至-80 ℃冰箱內(nèi)備用。采用Roche公司的Cobas600 E601全自動電化學(xué)發(fā)光分析儀檢測超敏肌鈣蛋白T(cTnT)。

1.2.3 目的miRNA引物的合成 本次實驗的miRNA引物均由寶生物工程公司提供并通過驗證。主要設(shè)計是采用stem-loop(莖環(huán))結(jié)構(gòu)，其特異性好、長度適中，使miRNA在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)過程中的莖環(huán)不被破壞，主要是參照miRNA反轉(zhuǎn)錄及熒光定量引物的設(shè)計原則。同樣為了使定量聚合酶的靈敏度增高，特異性結(jié)合力加強(qiáng)，在3′端上游引物加Poly(A)尾結(jié)構(gòu)。試驗中所選目的miRNA及內(nèi)參的引物系列見表2。

表2 引物序列

1.2.4 總RNA提取 從-80 ℃冰箱將樣品取出溶解后，按每200 μL血清樣本加入Buffer RLM使其裂解，室溫放置5 min，使蛋白核酸復(fù)合物分離；4 ℃，12 000 r/min離心15 min，取上清液至1.5 mL PE管中；再加入200 μL 氯仿，劇烈晃動15 s后取上層無色水至離心管，取轉(zhuǎn)移液體積加1.25倍的無水乙醇混勻；使用Wash buffer1洗2次，Wash buffer 2洗1次，離心30 s，倒掉廢液，重回收集管，加入40 μL RNase-Free Water，室溫放置1 min，12 000 r/min離心1 min，收集DNA液。

1.2.5 熒光定量聚合酶檢測血清miR-126、miR-210 使用室溫融化體積為25 μL的2×miRNAqPCRpremi試劑和已經(jīng)均勻混合，并經(jīng)短暫離心后體積為1 μL的Reverseprimer試劑置于冰上，構(gòu)造反應(yīng)體系；然后啟動PCR儀器，其主要3步分別為：90 ℃、10 min 、1個循環(huán)，90 ℃、15 s、40個循環(huán)，60 ℃、1 min、40個循環(huán)，對目的cDNA產(chǎn)物進(jìn)行熒光定量聚合酶反應(yīng)。

1.2.6 血漿cTnT檢測 使用貝克曼ACCESS2全自動化學(xué)發(fā)光儀測定觀察組及對照組血漿中cTnT含量，具體方法參見使用說明書。

1.2.7 隨訪 對所有病人進(jìn)行為期1年的隨訪，觀察兩組病人心血管不良反應(yīng)發(fā)生情況，主要包括死亡、再發(fā)心肌梗死、再次血運重建和再入院等。

2 結(jié) 果

2.1 各組血清miR-126、miR-210的表達(dá)水平 觀察組血清中miR-126表達(dá)水平低于對照組，而血清中miR-210表達(dá)水平高于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。詳見表3。

表3 各組血清miR-126、miR-210表達(dá)水平比較(±s)

2.2 觀察組血清miR-126、miR-210水平與GRACE評分分層關(guān)系 高危組血清miR-126水平低于中危組、低危組(高危組<中危組<低危組，P<0.001)；高危組血清miR-210水平高于中危組、低危組(高危組>中危組>低危組，P<0.001)。詳見表4。

表4 觀察組血清miR-126、miR-210水平與GRACE評分分層關(guān)系(±s)

與高危組比較，①P<0.05；與中危組比較，②P<0.05。

2.3 觀察組血清miR-126、miR-210表達(dá)水平與cTnT的相關(guān)分析 血清miR-126水平表達(dá)量與cTnT呈正相關(guān)(r=0.87，P<0.001)；miR-210水平表達(dá)量與cTnT呈負(fù)相關(guān)(r=-0.42，P<0.001)。

2.4 不同血清miR-126、miR-210表達(dá)的AMI病人預(yù)后比較 隨訪1年后以中位數(shù)為界值，分析發(fā)現(xiàn)血清miR-126高表達(dá)組AMI病人心血管不良事件發(fā)生率低于低表達(dá)組(χ2=5.333，P=0.021)；血清miR-210的高表達(dá)組AMI病人心血管不良事件發(fā)生率高于低表達(dá)組(χ2=3.140，P=0.037)。詳見表5。

表5 不同血清miR-126、miR-210表達(dá)組病人不良心血管事件發(fā)生率比較 單位：例(%)

與高表達(dá)組比較，①P<0.05。

3 討 論

AMI是冠狀動脈死亡的主要原因，一般發(fā)生在冠狀動脈粥樣硬化基礎(chǔ)上，可因病人過度勞累、激動、暴飲暴食、吸煙、飲酒等因素導(dǎo)致冠狀動脈粥樣斑塊破裂，致血小板在破裂表面形成血栓，使得動脈管腔堵塞，導(dǎo)致心肌缺血壞死[9-10]。目前臨床對于AMI病人的診斷并不完善。

有研究發(fā)現(xiàn)，miRNA可作為多種疾病的生物標(biāo)志物，對于血管的再生、刺激血液干細(xì)胞的形成起著一定的作用，同時還對心血管疾病的發(fā)病機(jī)制起著調(diào)節(jié)作用，而AMI作為心血管疾病的一種，主要特征是以心肌細(xì)胞壞死為主，并常伴有心肌細(xì)胞內(nèi)容物釋放入血，因此，受到了研究者的強(qiáng)烈關(guān)注。miRNA是一種類似siRNA的分子，一般成熟的miRNA是由較長的初級轉(zhuǎn)錄物經(jīng)過一系列的加工而產(chǎn)生的，通常是廣泛性存在于真核生物中，其長度為18～25 nt，可調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、組織分化以及對生命的發(fā)育、疾病有重要作用，且多數(shù)的miRNA具有組織特異性、時序性、廣泛性及多樣性，對于細(xì)胞的生長發(fā)育起著重要作用[11-12]。

本研究觀察AMI病人血清miR-126、miR-210表達(dá)水平對預(yù)后的臨床價值，結(jié)果顯示，觀察組血清miR-126水平低于對照組，其中高危組血清miR-126水平低于中危組、低危組，由于血清miR-126表達(dá)主要存在血管內(nèi)皮細(xì)胞中，能夠在多方面調(diào)節(jié)維持內(nèi)皮細(xì)胞，如細(xì)胞增殖、完整性、遷移等[13-14]。因此，在AMI的作用下使內(nèi)皮細(xì)胞分泌miR-126受到抑制，導(dǎo)致血清miR-126的表達(dá)具有差異性。觀察組血清miR-210表達(dá)水平高于對照組，其中高危組血清miR-210表達(dá)水平也明顯高于中危組、低危組，本研究結(jié)果與有關(guān)文獻(xiàn)研究報道一致[15-16]。cTnT作為AMI診斷金標(biāo)準(zhǔn)[17]。本次研究中AMI病人血清miR-126、miR-210表達(dá)水平與cTnT相關(guān)分析結(jié)果顯示，血清miR-126水平表達(dá)量與cTnT呈正相關(guān)，miR-210水平表達(dá)量與cTnT呈負(fù)相關(guān)，可以反映出心肌細(xì)胞的損傷程度[18]。在本研究中，為了解AMI病人預(yù)后情況，對所有病人進(jìn)行為期1年的隨訪，比較兩組病人心血管不良反應(yīng)發(fā)生情況，結(jié)果顯示高表達(dá)組血清miR-126心血管不良事件發(fā)生率低于低表達(dá)組，血清miR-210高表達(dá)組心血管不良事件發(fā)生率高于低表達(dá)組。表明血清miR-126、miR-210水平能夠反映AMI病人的預(yù)后狀況，這對于后續(xù)的治療具有一定意義。

綜上所述，血清miR-126、miR-210表達(dá)水平降低或升高能夠評估AMI病人的預(yù)后狀況，提高臨床對疾病的診斷和治療，血清miR-126、miR-210可作為AMI危險分層指標(biāo)，但是由于本次試驗樣本量不足，尚需要更大規(guī)模研究進(jìn)一步開展。